專利名稱：一種胞外生產(chǎn)重組β-環(huán)狀糊精轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是用培養(yǎng)重組大腸桿菌生產(chǎn)β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶( β -CGT酶)的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱CGT酶)是一種能夠通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)移糖基反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精(CDs)的胞外酶，根據(jù)生成的主要產(chǎn)物可大致分為α-、β-、Y-三種類型。環(huán)狀糊精一般分類為α-、β-、Υ-、δ-、ε-、ζ -及11-0)，分別由6、7、8、9、10、11及12個(gè)葡萄糖單元組成，其中研究最多且應(yīng)用最廣的是α-、β-、Υ-⑶。目前β -⑶的應(yīng)用最廣泛,這是由于β -⑶的孔徑適中，性質(zhì)穩(wěn)定。環(huán)糊精是一種具有內(nèi)疏水外親水的筒狀結(jié)構(gòu)，能和許多疏水客體化合物或功能基團(tuán)包結(jié)在其環(huán)形疏水空隙內(nèi)，從而改變了客體物質(zhì)的物理、化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)，以此特性為基礎(chǔ)衍生出環(huán)糊精的包埋、包合技術(shù)，致使其在輕工、農(nóng)業(yè)、化工、環(huán)保、食品領(lǐng)域尤其是作為食品添加劑方面應(yīng)用性很廣。因此大規(guī)模生產(chǎn)β_⑶有重要的意義?，F(xiàn)有的生產(chǎn)β -⑶的主要方法是酶生產(chǎn)法，想要提高β -⑶的產(chǎn)率、降低制作成本，必須大幅度的提高β-CGT酶的產(chǎn)率，目前國(guó)外對(duì)β-CGT酶的研究較多，國(guó)內(nèi)關(guān)于這方面的研究不太成熟，主要包括篩選和誘變野生菌種、產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化等，基因工程菌的研究不多。國(guó)內(nèi)能夠生產(chǎn)β_⑶不多，生產(chǎn)的β-CGT酶只能自給自足，且相比日本、德國(guó)、法國(guó)等國(guó)家產(chǎn)量不高，價(jià)格較貴且純度不高，國(guó)內(nèi)環(huán)糊精的供需也多依靠進(jìn)口。產(chǎn)β -CGT酶的微生物種類很多，現(xiàn)在工業(yè)上生產(chǎn)環(huán)糊精所用的CGT酶大都來自芽孢桿菌屬，但此類菌產(chǎn)CGT酶的能力非常低，不能滿足環(huán)糊精的制備需求。為了解決野生菌種產(chǎn)CGT酶能力較低這個(gè)問題，運(yùn)用基因工程將有關(guān)CGT酶基因在其他宿主菌種表達(dá)成為如今研究開發(fā)的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效胞外表達(dá)β -環(huán)繞糊精轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)工藝，以解決發(fā)酵工藝中酶活不高，工業(yè)應(yīng)用成本高等難題。本發(fā)明成功構(gòu)建含有表達(dá)載體pET28(+)-cgt并轉(zhuǎn)化疋Cb7i BL21(DE3)宿主菌，通過搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了 β -CGT酶的高效胞外表達(dá)，為其大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。(I)菌株(大腸桿菌)以Ε. Coli BL21 (DE3) (pET28 (+) /cgt)為出發(fā)菌株(謝振榮，趙三軍，唐湘華等.來M PaenibaciIIus sp.的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J].食品科技，2010，35(11) : 16^19.)；
(2)種子培養(yǎng)階段將_80°C甘油保藏的菌株接入種子培養(yǎng)基，使用恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度35 37°C ;
(3)發(fā)酵階段按照1-2%的接種量接種至200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，放于恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，溫度控制在35-37°C，轉(zhuǎn)速控制在150-160rpm，培養(yǎng)6_8個(gè)小時(shí)；
(4)誘導(dǎo)階段當(dāng)菌體0D_達(dá)到I. 4-1. 6時(shí)，加入乳糖誘導(dǎo)，保證乳糖的終濃度為4 6g/L，溫度保持在35-37°C，轉(zhuǎn)速提高至170-180rpm，誘導(dǎo)8_9個(gè)小時(shí)后過濾，所得液體即為β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。所述大腸桿菌疋Cb7i BL21(DE3) (pET28(+)_cgt)的構(gòu)建方法為將來源于Paenibacillus sp. XW-6-66的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(謝振榮，趙三軍，唐湘華等· PamibeiciIIus sp.的β -環(huán)糊精 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J].食品科技，2010，35(11) : 16 19.)插入質(zhì)粒ρΕΤ28(+)，構(gòu)建了表達(dá)載體pET28(+)/cgt，并將其轉(zhuǎn)化宿主菌疋Coli BL21(DE3)；
所述種子培養(yǎng)基組成為4_6g/L酵母粉，9-llg/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，pH 7. 0-7. 2,并含有濃度為O. 05mg/ml的卡那霉素。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為4_6g/L酵母粉，9-llg/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，
1-1. 25mmol/L CaCl2, 2-2. 5mmol/L MgSO4. 7H20, pH 7. 0-7. 2，并含有濃度為 0. 05mg/ml 的卡
那霉素。β -環(huán)繞糊精轉(zhuǎn)移酶環(huán)化酶活測(cè)定的具體步驟如下
實(shí)驗(yàn)組
(1)0.5mL 1%馬鈴薯淀粉和O. 4 mL 0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液ρΗ9. O于40°C水浴中預(yù)熱5 min ；
(2)加入100μ L適當(dāng)稀釋的酶液，40°C水浴中反應(yīng)20 min ；
(3)加入3.5 mL 30 mmol/L氫氧化鈉終止反應(yīng),冷卻；
(4)加入O.5 mL O. 02% (W/V)酹酞-5 mmol/L碳酸鈉溶液顯色；
(5)550 nm下測(cè)定吸光度值。對(duì)照組以不加酶液為對(duì)照組，其它同實(shí)驗(yàn)組。酶活定義一個(gè)酶活定義為上述條件下每分鐘生產(chǎn)I mg 環(huán)糊精所需要的酶量。酶活力計(jì)算公式
QI
酶活力(U/mL ) =— X η χ -
V t
其中，C一 β -環(huán)糊精生成量mg ；
V—酶液體積mL ； η—酶液稀釋倍數(shù)； t一反應(yīng)時(shí)間min。本發(fā)明采用兩階段控制工藝，實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌胞外高效表達(dá)β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。該工藝與現(xiàn)有的工藝相比步驟少，時(shí)間短，適合大規(guī)模生產(chǎn)，有效的胞外表達(dá)，大大的提聞了生廣效率。


圖I是分光光度計(jì)法測(cè)定β -⑶含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
1、大腸桿菌厶Coli BL21 (DE3) (pET28 (+) /cgt)的構(gòu)建將來源 Paenibacillus5/7.XW-6-66的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(謝振榮，趙三軍，唐湘華等.來源Paenibacillus sp.的β _環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J].食品科技，2010，35(11) : 16 19.)插入質(zhì)粒ρΕΤ28(+)，構(gòu)建了表達(dá)載體pET28(+)/cgt，并將其轉(zhuǎn)化宿主菌萬.Coli BL21(DE3)；
2、種子培養(yǎng)階段將-80°C甘油保藏的上述大腸桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基為5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl,卡那霉素O. 05mg/ml, ρΗ7·0,使用恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度37°C ； 3、發(fā)酵階段按照1%的接種量接種菌株至200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基為5g/L 酵母粉，10g/L 蛋白腺，10g/L NaCl, I mmol/L CaCl2, 2mmo I/LMgSO4. 7H20,卡那霉素0. 05mg/ml, pH 7. 0，放于恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，溫度控制在37°C，轉(zhuǎn)速控制在160rpm，培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)；
4、誘導(dǎo)階段當(dāng)菌體0D_達(dá)到I.5時(shí)，加入乳糖誘導(dǎo)，保證乳糖的終濃度為5g/L，溫度保持在35°C，轉(zhuǎn)速提高至ISOrpm，誘導(dǎo)9個(gè)小時(shí)后過濾，所得液體即為β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液，測(cè)得環(huán)化酶活為7. 121U/ml。實(shí)施例2:
I 菌株大腸桿菌疋 Coli BL21(DE3) (pET28 (+)/cgt)；
2種子培養(yǎng)階段將_80°C甘油保藏的上述大腸桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基5. 5g/L酵母粉，10. 5g/L蛋白胨，10. 5g/L NaCl，卡那霉素O. 05mg/ml, ρΗ7· 2，使用恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度37°C ；
3發(fā)酵階段按照2%的接種量接種菌株至200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基5. 5g/L 酵母粉，10. 5g/L 蛋白胨，10. 5g/L NaCl，I. 2mmol/L CaCl2, 2. 25mmol/L MgSO4. 7H20,卡那霉素0. 05mg/ml, pH 7. 2,放于恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng),溫度控制在35°C,轉(zhuǎn)速控制在150rpm，培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)；
4、誘導(dǎo)階段當(dāng)菌體0D_達(dá)到I. 4時(shí)，加入乳糖誘導(dǎo)，保證乳糖的終濃度為5g/L，溫度保持在36°C，轉(zhuǎn)速提高至170rpm，誘導(dǎo)9個(gè)小時(shí)后過濾，所得液體即為β _環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液，測(cè)得環(huán)化酶活為7. 225U/ml。實(shí)施例3:
1、菌株大腸桿菌疋Coli BL21(DE3) (pET28 (+)/cgt)；
2、種子培養(yǎng)階段將-80°C甘油保藏的上述大腸桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)為5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl,卡那霉素O. 05mg/ml, pH7. I,使用恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度37°C ；
3、發(fā)酵階段按照2%的接種量接種菌株至200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基為5g/L 酵母粉，10g/L 蛋白胨，10g/L NaCl, I. 2mmol/L CaCl2, 2. 5mmol/L MgSO4. 7H20，卡那霉素0. 05mg/ml,pH 7. I,放于恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng),溫度控制在36°C,轉(zhuǎn)速控制在150rpm,培養(yǎng)7個(gè)小時(shí)；
4、誘導(dǎo)階段當(dāng)菌體0D_達(dá)到1.6時(shí)，加入乳糖誘導(dǎo)，保證乳糖的終濃度為5g/L，溫度保持在37°C，轉(zhuǎn)速提高至170rpm，誘導(dǎo)8個(gè)小時(shí)后過濾，所得液體即為β _環(huán)糊精葡萄糖 基轉(zhuǎn)移酶粗酶液，測(cè)得環(huán)化酶活為7. 197U/ml。
權(quán)利要求
1.一種胞外生產(chǎn)重組3 -環(huán)狀糊精轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)方法，其特征在于采用發(fā)酵階段和誘導(dǎo)階段分開的生產(chǎn)エ藝，具體步驟如下 (I)以大腸桿菌^ Coli BL21(DE3) (pET28 (+)/cgt)為出發(fā)菌株； (2)種子培養(yǎng)階段將上述菌株接入種子培養(yǎng)基，使用恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度 35 - 37°C ； (3)發(fā)酵階段按照1-2%的接種量接種菌株至200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，放于恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，溫度控制在35-37°C，轉(zhuǎn)速控制在150-160rpm，培養(yǎng)6_8個(gè)小時(shí)； (4)誘導(dǎo)階段當(dāng)菌體OD_達(dá)到I.4-1. 6時(shí)，加入乳糖誘導(dǎo)，保證乳糖的終濃度為4 一6g/L，溫度保持在35-37°C，轉(zhuǎn)速提高至170-180rpm，誘導(dǎo)8_9個(gè)小時(shí)后過濾，所得液體即為^-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胞外生產(chǎn)重組3-環(huán)狀糊精轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)方法，其特征在于種子培養(yǎng)基組成為4_6g/L酵母粉，9-llg/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，pH 7.0-7. 2，并含有濃度為0. 05mg/ml的卡那霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胞外生產(chǎn)重組3-環(huán)狀糊精轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:4_6g/L酵母粉，9-llg/L/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，1_1. 25mmol/LCaCl2, 2-2. 5mmol/L MgSO4. 7H20, pH 7. 0-7. 2，并含有濃度為 0. 05mg/ml 的卡那霉素。
全文摘要
本發(fā)明是一種胞外生產(chǎn)重組β-環(huán)狀糊精轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)方法。以大腸桿菌E.ColiBL21(DE3)(pET28(+)/cgt)為出發(fā)菌株；經(jīng)種子培養(yǎng)階段恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)12小時(shí)，再經(jīng)發(fā)酵階段，按照1-2%的接種量接種菌株至200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，放于恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)6-8個(gè)小時(shí)；當(dāng)菌體OD600達(dá)到1.4-1.6時(shí)，加入乳糖誘導(dǎo)8-9個(gè)小時(shí)后過濾，所得液體即為β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。整個(gè)發(fā)酵時(shí)間18小時(shí)左右，胞外β-環(huán)繞糊精轉(zhuǎn)移酶的環(huán)化酶活達(dá)到7U/ml以上。本發(fā)明采用兩階段控制工藝，實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌胞外高效表達(dá)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。該工藝與現(xiàn)有的工藝相比步驟少，時(shí)間短，適合大規(guī)模生產(chǎn)，有效的胞外表達(dá)，大大的提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102796712SQ20121033396
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者黃遵錫, 宋拓, 李俊俊, 唐湘華, 許波, 楊云娟, 周峻沛 申請(qǐng)人:云南師范大學(xué)