專利名稱：人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
背景技術(shù)：
人生長激素(human growth hormone, hGH)是由腦垂體嗜酸性細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)類激素。hGH的功能復(fù)雜多樣，具有調(diào)節(jié)人體的生長發(fā)育，影響蛋白質(zhì)、碳水化合物以及脂肪的代謝等作用。重組hGH是臨床上非常重要的一個(gè)藥物，在生理劑量上被用來治療成年人以及兒童的hGH缺乏癥；在藥理劑量上被用來治療很多疾病，比如骨質(zhì)疏松癥、心力衰竭、慢性腎衰竭、特納氏綜合癥、以及多種急慢性代謝方面的疾病等。hGH在體內(nèi)起作用主要是通過與受體的結(jié)合,而生長激素受體(growth hormonereceptor, GHR)在體內(nèi)的分布非常廣泛，很多器官都有GHR的存在。并且hGH在體內(nèi)被水解成各種活性肽段，也發(fā)揮多種作用，有些是與治療無關(guān)甚至是毒性的。因此長期使用hGH會(huì)產(chǎn)生一些諸如葡萄糖耐受性、胰島素拮抗性、浮腫以及高血壓等癥狀。有的甚至需要在施用hGH之后，對(duì)病人進(jìn)行糖尿病治療，這在很大程度上限制了 hGH的應(yīng)用。蛋白質(zhì)水解及體外多肽合成研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)完整的hGH分子包含一些獨(dú)立的結(jié)構(gòu)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域都具有獨(dú)立的生物化學(xué)或生理學(xué)作用。因此，具有與結(jié)構(gòu)完整的hGH分子類似的功能，而沒有干擾活性的多肽成為人們研究的熱點(diǎn)。hGH177_191是hGH分子C末端的15個(gè)氨基酸，被認(rèn)為是hGH促進(jìn)脂肪分解的區(qū)域。1959年,Raben和Hollenberg首次在成年人中發(fā)現(xiàn)hGH具有分解脂肪的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hGH缺乏的成年人，當(dāng)其循環(huán)系統(tǒng)中hGH的表達(dá)水平下降時(shí)，會(huì)出現(xiàn)腹部脂肪堆積，而用hGH替代治療后，則腹部恢復(fù)正常。這說明腹部脂肪堆積與循環(huán)系統(tǒng)中hGH的表達(dá)水平有密切的關(guān)系。后來實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hGH能夠抑制脂蛋白脂酶的活性，增加循環(huán)系統(tǒng)中游離脂肪酸的含量，最終減少脂肪細(xì)胞的聚集。hGH177,是hGH分子C末端的15個(gè)氨基酸，被認(rèn)為是hGH促進(jìn)脂肪分解的區(qū)域。通過水解和酶切的方法研究hGH的C末端的片段發(fā)現(xiàn)hGH177_191是保持該生物活性最小的片段。NMR顯示hGH177_191在溶液中呈現(xiàn)一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與在hGH中相似。hGH177_191具有與hGH相同的作用原理，都是直接作用于脂肪細(xì)胞，能夠加速細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存脂肪的釋放和燃燒，從而減少脂肪的聚集。對(duì)hGH177_191的體外活性研究發(fā)現(xiàn)hGH177_191對(duì)嚙齒動(dòng)物、豬以及人的脂肪細(xì)胞或組織都能起到急性的脂肪分解作用。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示肥胖小鼠施用不同劑量的hGH177_191后，均能在不減少食物攝入量的基礎(chǔ)上使小鼠的體重有不同程度的減輕。人體毒性實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，hGH177_191的耐受性非常好，對(duì)人體安全無副作用。GH177_191有且唯一具有分解脂肪的生物活性，所以具有潛在的治療肥胖的應(yīng)用價(jià)值。hGH177_191僅由15個(gè)氨基酸組成，在開發(fā)為藥物的過程中，面臨著一系列的問題。hGH177_191分子量特別小，在體內(nèi)的半衰期非常短，只有幾分鐘。為了充分發(fā)揮其藥效，必需每天注射或口服。每天注射會(huì)給病人帶來注射部位疼痛等痛苦，造成病人的依從性比較差。而口服后，肽段會(huì)被水解，同樣不利于藥效的發(fā)揮。并且，通過體外合成的方法生產(chǎn)hGH177_191，其費(fèi)用比較高，每天使用更增加了其成本，不利于藥物的大規(guī)模推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域的融合蛋白及其制備方法，解決了現(xiàn)有人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)的半衰期短，口服易被水解，藥效不易發(fā)揮的問題。一種融合蛋白，包括兩個(gè)區(qū)域，其中，第一區(qū)域?yàn)槿搜灏椎鞍?，第二區(qū)域?yàn)槿松L激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域，人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為LRIVQCRSVEGSCGF。人血清白蛋白(Human Serum Albumin,簡稱HSA)HSA是由585個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量約為66. 5KD，是血漿的主要成分，正常情況下不易透過腎小球，在血漿中的半衰期較長，可達(dá)14 20天，而且體內(nèi)分布極廣，沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，是一種理想的 生物活性蛋白載體。人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域可以直接連接，也可以通過連接肽連接。連接肽的長短以及氨基酸組成等對(duì)融合蛋白的表達(dá)水平、產(chǎn)率、穩(wěn)定性以及活性等有影響，所述連接肽的長度優(yōu)選2 100個(gè)氨基酸,更優(yōu)選為5 50個(gè)氨基酸,最優(yōu)選為14 30個(gè)氨基酸。所述連接肽的氨基酸序列優(yōu)選為[GlyGlyGlyGlySer]n，其中η為I 10的自然數(shù)，更優(yōu)選為I 5的自然數(shù)。所述人血清白蛋白作為蛋白載體與人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域融合形成的融合蛋白分子量較大，不易被腎小球?yàn)V過，能夠延長半衰期。所述HSA的氨基酸序列優(yōu)選為如SEQ ID NO. 2所示，hGH177_191與該序列的HSA融合在延長多肽作用半衰期的基礎(chǔ)上較大程度的保留了其活性和功能。所述HSA的氨基酸序列也可以與SEQ ID NO. 2具有85%同源性，優(yōu)選為具有95%的同源性。本發(fā)明還提供了編碼所述融合蛋白的基因，根據(jù)真菌密碼子偏好性，其堿基序列優(yōu)選為SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明還提供了一種包含所述融合蛋白的基因的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒的原始載體可以選用pPIC系列載體，優(yōu)選為pPIC9K，pPICZ α等分泌型載體，最優(yōu)選為PPIC9。pPIC9載體上的醇氧化酶操縱子(AOXl) 5’序列和3’序列，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高。PPIC9載體能對(duì)表達(dá)后的外源蛋白進(jìn)行加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，提高表達(dá)蛋白的活性，也便于重組蛋白的純化。在單個(gè)重組質(zhì)粒中，人血清白蛋白基因和人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域基因的相對(duì)順序可以任意，而且其中人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域基因的拷貝數(shù)可以是兩個(gè)或兩個(gè)以上，所述重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)可以為pPIC9-HSA-hGH177_191，pPIC9-hGH177_191-HSA,pPIC9-HSA-L-hGH177_191，pPIC9-hGH177_191-L-HSA，pPIC9-hGH177_191-HSA-hGH177_191 或 pPIC9_hGH177-191-L-HSA-L-hGH177_191。本發(fā)明還提供了一種包含所基因的表達(dá)系統(tǒng)。所述的表達(dá)系統(tǒng)選擇的宿主可以為細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞，優(yōu)選為酵母，更優(yōu)選為畢赤酵母GS115。
本發(fā)明還提供了一種所述融合蛋白的制備方法，包括(I)構(gòu)建包含融合蛋白基因的重組表達(dá)載體；具體可以為以人胎肝組織DNA為模板，擴(kuò)增得到HSA基因片段，連接到載體中，接著設(shè)計(jì)帶hGH177_191基因的引物，然后以上述帶有HSA基因的重組載體為模板，擴(kuò)增得到整個(gè)融合蛋白基因，最后將融合蛋白基因連接到PPIC9中。(2)將重組表達(dá)載體酶切線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，獲得轉(zhuǎn)化子；酶切線性化所用的內(nèi)切酶為Sail，所述的轉(zhuǎn)化的方法可以采用電穿孔法、化學(xué)法、原生質(zhì)體生成法或全細(xì)胞法。(3)對(duì)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中分離純化所述融合蛋白。
本發(fā)明的融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽、修飾產(chǎn)物等。如在多肽的氨基、羧基、巰基上進(jìn)行再修飾，所用修飾劑可以但不局限于
聚乙二醇、葡萄糖等。本發(fā)明的有益效果為①本發(fā)明的融合蛋白有且唯一具有促進(jìn)脂肪分解的活性；②該融合蛋白在體內(nèi)的半衰期較長；③融合蛋白在酵母中表達(dá)，表達(dá)后無需復(fù)性，便于純化；④純化步驟簡潔高效，終產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低，有利于臨床使用重組表達(dá)生產(chǎn)成本較低，效率高。


圖I 為質(zhì)粒 pPIC9-HSA_hGH177_191 的構(gòu)建過程；圖2 為質(zhì)粒 pPIC9-HSA-L_hGH177_191 的構(gòu)建過程；圖3 為質(zhì)粒 pPIC9-hGH177_191-HSA_hGH177_191 的構(gòu)建過程；圖4為pPIC9載體和融合基因的雙酶切電泳結(jié)果；圖5為畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果；圖6為純化后的融合蛋白的SDS-PAGE分析；圖7為融合蛋白PVDF膜免疫印跡分析；圖8為融合蛋白促進(jìn)脂肪分解活性檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :HSA cDNA的克隆用PCR方法從人胎肝cDNA文庫中獲得不帶有信號(hào)肽編碼序列的HSAcDNA。設(shè)計(jì)的引物為HSA up :5，ATGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTT 3，HSA dn :5’ ATGCGGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT 3’ 上下游引物分別弓I入EcoRI和BamHI位點(diǎn)和保護(hù)堿基，劃線處為內(nèi)切酶識(shí)別序列。PCR反應(yīng)條件100 μ L反應(yīng)體系中，加入I. 5 μ L肝組織cDNA (經(jīng)RNA提取試劑盒提取后逆轉(zhuǎn)錄而得到)，20ymol/L的上下游引物各I. 5μ L，IOmmoI/L的dNTP (脫氧核苷酸)I μ L，IOX反應(yīng)緩沖液10 μ L，Taq DNA聚合酶O. 5 μ L，剩余用ddH20補(bǔ)足。用EPPEND0RF 公司的(型號(hào)為 Matstercycler Gradient) PCR 儀，PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s ;54°C退火45s ;72°C延伸2min，共33個(gè)循環(huán)以后，再72°C延伸lOmin。通過O. 8%凝膠電泳分析得到預(yù)期為I. 8kb的條帶。PCR產(chǎn)物電泳純化用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。取純化的HSA cDNA3yL，加入IyL pGEM-T載體，5yL 2X反應(yīng)緩沖液，I μ LT4DNA連接酶，16°C反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)化新鮮制作的DH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌鋪于x-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，接種至5mL含SOyg/ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，用試劑盒進(jìn)行小量質(zhì)粒抽提，用EcoRI和BamHI雙酶切后進(jìn)行電泳鑒定挑選片段插入的陽性克隆。從pGEM-T載體的多克隆位點(diǎn)兩端分別測序，完成HSAcDNA全長測序，獲得了含有序列正確的HSAcDNA的克隆。實(shí)施例2 :融合表達(dá)載體的構(gòu)建
hGH177_191 是 hGH 的 C 末端的 15 個(gè) AA,其氨基酸序列為H2N-Leu-Arg-Ile-Val_Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-OH。根據(jù)酵母偏愛的密碼子推導(dǎo) IiGH177_191 的核苷酸序列為ctg aga ate gtt cag tgc aga tct gtt gag ggt tct tgt ggt ttc,構(gòu)建的重組質(zhì)粒，如圖1、2、3所示。以實(shí)施例I中構(gòu)建的pGEM-T-HSA質(zhì)粒為模板，PCR體外擴(kuò)增得到HSA基因和hGH177_191片段的融合基因。用引物I和4互為上下游引物擴(kuò)增得到融合基因HSA-L-hGH177_191，用引物3和2互為上下游引物擴(kuò)增得到融合基因hGH177_191-HSA_hGH177_191。用引物I和2互為上下游引物擴(kuò)增得到融合基因HSA-hGH177_191。表I :用于重組表達(dá)載體構(gòu)建的引物
PrimerSequence(SW)
1(HSA up)5，-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTG
AGG'V
2(HSΑ-hGH,77-191 5，-CG-GAATTCCTAGAAACCACAAGAACCCTCAdn)ACAGATCTGCACTGAACGATTCTCAGTAAGCCTA AGGC AGCTTG AC-3’3(hGH177-19,-HSA- 5，-GC-CTCGAGAAAAGAATGCTGAGAATCGTTC
AGTGCAGATCTGTTGAGGGTTCTTGTGGTTTCChGH丨77_丨9丨 up)ACACAAGAGTGAGG-B5
4(HSA-L-hGH|77-i9i 5，-CG-GAATTCCTAGAAACCACAAGAACCCTCAdn)ACAGATCTGCACTGAACGATTCTCAGGGAACCACC ACC ACC-3’表I中上游引物中引入XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn))，下游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn))。粗體字部分為畢赤酵母中蛋白酶Kex2的識(shí)別位點(diǎn)氨基酸Lys和Arg的密碼子,加入這兩個(gè)氨基酸密碼子可以使表達(dá)的蛋白序列只含有預(yù)期的融合蛋白的肽序列。體外擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為(Total 50 μ L)
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，包括兩個(gè)區(qū)域，其特征在于，第一區(qū)域?yàn)槿搜灏椎鞍祝诙^(qū)域?yàn)槿松L激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域，人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為LRIVQCRSVEGSCGF。
2.如權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，包括連接第一區(qū)域和第二區(qū)域的連接肽。
3.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述連接肽的氨基酸序列為[GlyGlyGlyGlySer]n,其中η為I 10的自然數(shù)。
4.如權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 2 所示。
5.一種編碼如權(quán)利要求I 4任一所述融合蛋白的基因。
6.一種包含權(quán)利要求5所述基因的重組質(zhì)粒。
7.如權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，原始載體為pPIC9。
8.一種包含權(quán)利要求5所述基因的表達(dá)系統(tǒng)。
9.如權(quán)利要求I所述融合蛋白的制備方法，包括 (1)構(gòu)建包含融合蛋白基因的重組表達(dá)載體； (2)將重組表達(dá)載體酶切線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia.pastoris)GS115，獲得轉(zhuǎn)化子細(xì)胞； (3)對(duì)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中分離純化所述融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人血清白蛋白與人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，包括兩個(gè)區(qū)域，其中，第一區(qū)域?yàn)槿搜灏椎鞍?，第二區(qū)域?yàn)槿松L激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域，人生長激素脂肪分解結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為LRIVQCRSVEGSCGF。本發(fā)明融合蛋白有且唯一具有促進(jìn)脂肪分解的活性；在體內(nèi)的半衰期較長；在酵母中表達(dá)后無需復(fù)性，便于純化；純化步驟簡潔高效，終產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低，有利于臨床使用；重組表達(dá)生產(chǎn)成本較低，效率高。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102827290SQ201210328039
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者陳樞青, 王芙蓉, 吳敏, 沈其 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)