專利名稱：滇池金線鲃鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滇池金線鈀鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，屬于淡水水生生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漠池金線把Sinocyclocheilus grahami (Regan,1904)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)金線把屬(Sinocyclocheilus),是滇池流域的特有種。1989年，滇池金線鈀被列為國(guó)家II級(jí)保護(hù)動(dòng)物，在《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)(魚(yú)類(lèi))》中被列為瀕危等級(jí)，在中國(guó)物種紅色名錄中被列為VU等級(jí)。該魚(yú)因其在陽(yáng)光下，側(cè)線鱗金光熠熠，如金線閃爍而得名，該魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，位列云南四大名魚(yú)之首。自上世紀(jì)50年代后期以來(lái)，由于外來(lái)種入侵、水體污染、生境喪失、過(guò)度捕撈等原因，滇池金線鈀在滇池湖體已經(jīng)消失，現(xiàn)僅存于入湖溪流及龍?zhí)吨?。若不及時(shí)采取有效的拯 救措施，以后將在自然界中將很難找到滇池金線鈀這一物種；盡管滇池金線鈀人工繁殖技術(shù)已研發(fā)成功，但由于養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)本身的局限性，造成種質(zhì)退化，遺傳多祥性減少、生長(zhǎng)速度緩慢、品質(zhì)下降、對(duì)病害和環(huán)境脅迫的防御能力降低，病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，因此滇池金線鈀優(yōu)良品種的種質(zhì)保存及遺傳多樣性保護(hù)，已成為其水產(chǎn)養(yǎng)殖中亟待攻克的重要科技問(wèn)題。有必要對(duì)于滇池金線鈀的體細(xì)胞培養(yǎng)冷凍保存技術(shù)進(jìn)行探索，為滇池金線鈀物種保護(hù)提供新方向與新思路。并逐步擴(kuò)展至病毒學(xué)、免疫學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域的研究。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明的相同報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微創(chuàng)處理且操作簡(jiǎn)便易行的滇池金線鈀尾鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，以滿足對(duì)滇池金線鈀種質(zhì)資源保存和理論研究的需要。本發(fā)明的滇池金線鈀細(xì)胞系的構(gòu)建方法，步驟如下(I)制備細(xì)胞培養(yǎng)液選擇pH值為7. 2-7. 4的L_15培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，使胎牛血清的終濃度為20%，人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子終濃度為5 ng/ml,保存于4 C冰箱中，備用；( 2 )鰭組織微創(chuàng)取樣將活魚(yú)置于含有8 mg/L高猛酸鉀的溶液中消毒10 min，然后用無(wú)菌器械取尾鰭，置于12孔板中，加入含有200 IU/ml青霉素、200 u g/ml鏈霉素和15 u g/ml兩性霉素B的HBSS溶液3 ml，消毒后魚(yú)體放回魚(yú)缸中飼養(yǎng)，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的日常護(hù)理鰭條重新長(zhǎng)出；(3)原代培養(yǎng)在無(wú)菌操作臺(tái)中取出尾鰭組織，用HBSS+200 IU/ml青霉素+200 U g/ml鏈霉素+15 u g/ml兩性霉素B的溶液清洗三次；然后將組織剪成土 I mm3的小塊，均勻接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，在20°C培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜，次日再加入L-15+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 ii g/ml鏈霉素+10 U g/ml兩性霉素B的培養(yǎng)液3 ml，在20°C培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每3天半量更換培養(yǎng)液，第7天細(xì)胞開(kāi)始從組織塊中遷移，50天長(zhǎng)成細(xì)胞單層；(4)傳代培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入0. 13%的胰蛋白酶溶液I ml，消化2min，細(xì)胞變圓后，加入吸出的培養(yǎng)液I ml，再加入新鮮L-15+20%FBS+5 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液8 ml，均勻接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每7天傳代一次，傳至第5代吋，細(xì)胞培養(yǎng)液中血清含量減為10%，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。本發(fā)明的有益效果在干
I、采用微創(chuàng)處理，在保證魚(yú)體存活的前提下，操作簡(jiǎn)便易行。2、構(gòu)建的滇池金線鈀鰭細(xì)胞系形態(tài)為成纖維樣，能夠連續(xù)傳代并直接應(yīng)用于生物學(xué)特性研究，滿足了對(duì)滇池金線鈀種質(zhì)資源保存和理論研究及應(yīng)用的需要；3、該構(gòu)建方法也適用于其他魚(yú)類(lèi)構(gòu)建鰭條的細(xì)胞系。
具體實(shí)施例方式I、制備細(xì)胞培養(yǎng)液選擇pH值為7. 2-7. 4的L_15培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，使胎牛血清的終濃度為20%，人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子終濃度為5 ng/ml,于4 C冰箱中保存，備用；2、鰭組織微創(chuàng)取樣將活魚(yú)置于含有8 mg/L高猛酸鉀的溶液中消毒10 min，然后用無(wú)菌器械取尾鰭，置于12孔板中，加入含有200 IU/ml青霉素、200 u g/ml鏈霉素和15 u g/ml兩性霉素B的HBSS溶液3 ml，消毒后魚(yú)體放回魚(yú)缸中飼養(yǎng)，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的日常護(hù)理鰭條重新長(zhǎng)出；3、原代培養(yǎng)在無(wú)菌操作臺(tái)中取出尾鰭組織，用HBSS+200 IU/ml青霉素+200 U g/ml鏈霉素+15 u g/ml兩性霉素B的溶液清洗三次；然后將組織剪成土 I mm3的小塊，均勻接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，在20°C培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜，次日再加入L-15+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 ii g/ml鏈霉素+10 U g/ml兩性霉素B的培養(yǎng)液3 ml，在20°C培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每3天半量更換培養(yǎng)液，第7天細(xì)胞開(kāi)始從組織塊中遷移，50天長(zhǎng)成細(xì)胞單層；4、傳代培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入0. 13%的胰蛋白酶溶液I ml，消化2min，細(xì)胞變圓后，加入吸出的培養(yǎng)液I ml，再加入L-15+20%FBS+5 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液8 ml，均勻接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每7天傳代一次，傳至第5代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中血清含量減為10%，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。5、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇(I)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液凍存液包括胎牛血清，L-15培養(yǎng)液和DMS0，按5:4:1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。(2)細(xì)胞凍存取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液1200 rpm離心8 min，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為IXlO6個(gè)/ml，將I ml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8 ml凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80°C過(guò)夜，然后放入液氮中長(zhǎng)期保存。(3)細(xì)胞復(fù)蘇將上述凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無(wú)菌操作臺(tái)中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，并加入I ml L-15+20%FBS+5 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液，1000 rpm離心8 min，除上清。用10 ml新鮮培養(yǎng)液L_15+20%FBS+5 ng/ml bFGF重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ，7天細(xì)胞即長(zhǎng)成單層。
權(quán)利要求
1.滇池金線鈀鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于該構(gòu)建方法的步驟如下 a.制備細(xì)胞培養(yǎng)液 選擇PH值為7. 2-7. 4的L-15培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，使胎牛血清終濃度為20%，人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子終濃度為5 ng/ml，于4°C冰箱中保存，備用； b.鰭組織微創(chuàng)取樣 將活魚(yú)置于含有8 mg/L高猛酸鉀的溶液中消毒10 min，然后用無(wú)菌器械取尾鰭，置于.12孔板中，加入HBSS+200 IU/ml青霉素+200 y g/ml鏈霉素+15 U g/ml兩性霉素B的溶液3 ml，消毒后魚(yú)體放回魚(yú)缸中飼養(yǎng)，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的日常護(hù)理鰭條重新長(zhǎng)出； c.原代培養(yǎng) 在無(wú)菌操作臺(tái)中取出尾鰭組織，用HBSS+200 IU/ml青霉素+200 y g/ml鏈霉素+15U g/ml兩性霉素B的溶液清洗三次，然后將組織剪成土 I mm3的小塊，均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在20°C培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜，次日再加入L-15+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 ii g/ml鏈霉素+10 U g/ml兩性霉素B的細(xì)胞培養(yǎng)液3 ml，在20°C培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每3天半量更換培養(yǎng)液，第7天細(xì)胞開(kāi)始從組織塊中遷移，50天長(zhǎng)成細(xì)胞單層； d.傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入0. 13%的胰蛋白酶溶液I ml，消化.2min，細(xì)胞變圓后，加入吸出的培養(yǎng)液I ml，再加入L-15+20%FBS+5 ng/ml bFGF的細(xì)胞培養(yǎng)液8 ml，均勻接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，于20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每7天傳代一次，傳至第5代吋，細(xì)胞培養(yǎng)液中血清含量減為10%，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種滇池金線鲃鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，屬于淡水水生生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。該方法是以滇池金線鲃鰭條組織為材料，采用組織塊法，在含有胎牛血清和人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，pH值為7.2-7.4的L-15培養(yǎng)液中培養(yǎng)；采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行繼代培養(yǎng)；具體包括制備細(xì)胞培養(yǎng)液、鰭組織微創(chuàng)取樣、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)步驟。本發(fā)明的有益效果在于1、采用微創(chuàng)處理，在保證魚(yú)體存活的前提下，操作簡(jiǎn)便易行；2、構(gòu)建的滇池金線鲃鰭細(xì)胞系形態(tài)為成纖維樣，能夠連續(xù)傳代并直接應(yīng)用于生物學(xué)特性研究，滿足了對(duì)滇池金線鲃種質(zhì)資源保存和理論研究及應(yīng)用的需要；3、該構(gòu)建方法也適用于其他魚(yú)類(lèi)構(gòu)建鰭條的細(xì)胞系。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102757932SQ20121027786
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛(ài), 陳小勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所