專利名稱：一種重組人表皮生長因子工程菌的構(gòu)建和篩選方法
一種重組人表皮生長因子工程菌的構(gòu)建和篩選方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效胞內(nèi)可溶表達重組人表皮生長因子 (以下簡稱為h EGF)工程菌的構(gòu)建和篩選方法。
背景技術(shù)：
人表皮生長因子(Human epidermal growth factor, hEGF)是含有53個氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量為6216道爾頓；hEGF序列包含6個半胱氨酸殘基,可以形成三對分子內(nèi)二硫鍵，這些二硫鍵穩(wěn)定了 hEGF的構(gòu)象，對其發(fā)揮生物學(xué)功能起到了重要作用。
在體內(nèi)，hEGF誘導(dǎo)上皮發(fā)展，促進血管生成，抑制胃酸分泌。在體外，hEGF是成纖維細胞，上皮細胞和內(nèi)皮細胞的促細胞分裂劑，可以促進表皮細胞的集落形成。目前，hEGF 在醫(yī)療和化妝品行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。
hEGF廣泛存在于人的體液中，早期主要從尿液中提取(Starkey，R. H. et al.， Science, 189，800-802，1975)，由于hEGF在體液中的含量很小，直接提取成本很高，目前主要通過基因工程菌表達純化，常用的方法包括分泌表達和胞內(nèi)表達。hEGF的分泌表達， 雖然表達量較高，但是hEGF的同質(zhì)性和完整性受到影響，使得下游的純化步驟復(fù)雜化。而在胞內(nèi)表達時，現(xiàn)有做法是把hEGF基因以質(zhì)粒的形式引入大腸桿菌胞內(nèi)，但在發(fā)酵條件下，菌株的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象較為明顯，嚴(yán)重影響了 hEGF的得率(Wong, DK-H et al. , J. Ind. Microbiol. Biot.，21，31-36，1998)。如果能把hEGF基因直接引入大腸桿菌的基因組，那么它的丟失幾率會大大降低，但在此之前沒有這方面的報道。
此外，在胞內(nèi)表達hEGF時，由于大腸桿菌的胞內(nèi)為還原性環(huán)境，不利于hEGF分子內(nèi)三對二硫鍵的形成，所得的hEGF均以包涵體的形式存在，為了獲得有活性的hEGF，需要經(jīng)歷一個復(fù)雜的變復(fù)性過程，影響hEGF的產(chǎn)率。
有研究表明，利用Origami (DE3)宿主菌和SUMO標(biāo)簽表達融合蛋白可解決原蛋白可溶率低的問題(Su, Z.et al.，Protein Pept. Lett.，13，785-792，2006)。在此之前沒有把SUMO標(biāo)簽應(yīng)用到hEGF表達上的報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有重組表皮生長因子胞內(nèi)表達可溶率低和發(fā)酵培養(yǎng)中的質(zhì)粒丟失問題，提供一種高效、穩(wěn)定、高可溶性表達hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法。
本發(fā)明的hEGF工程菌構(gòu)建過程如下
一、通過PCR技術(shù)獲得包含卡那霉素抗性基因，通過化學(xué)合成方法獲得大腸桿菌 cspA基因功能元件；
二、對編碼SUMO蛋白的基因和編碼hEGF的基因序列，按照大腸桿菌的密碼子偏好性，進行密碼子優(yōu)化，獲得適合在大腸桿菌中大量表達的序列0PT-SUM0-hEGF ；
三、將第一步和第二步所得的片段連入pET21質(zhì)粒中，得到pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒;
四、以pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒為模板，構(gòu)建轉(zhuǎn)座體；
五、將轉(zhuǎn)座體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami 2 (DE3)；
六、篩選出高表達SUMO-hEGF的菌株；
其中步驟二中根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計的大量表達重組hEGF的優(yōu)化序列 OPT-SUMO-hEGF 如序列表中 SEQ ID NO 3 所示。
本發(fā)明的重組hEGF工程菌同已有文獻報道的重組hEGF工程菌相比，具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明采用轉(zhuǎn)座反應(yīng)，將編碼hEGF的基因整合于大腸桿菌的基因組中，由于沒有使用質(zhì)粒，從根源上避免了發(fā)酵條件中由于質(zhì)粒丟失而導(dǎo)致的產(chǎn)量下降的問題，極大的提高了工程菌的穩(wěn)定性；(2)本發(fā)明采用大腸桿菌抗凍基因cspA的功能元件，低溫誘導(dǎo)表達 hEGF,顯著的提高了 hEGF表達的可溶率；此外，低溫誘導(dǎo)有利于保證hEGF的同質(zhì)性，從一定程度上簡化了后續(xù)的純化操作。綜上所述，按本發(fā)明所述方法得到的菌株基因組穩(wěn)定、表達的人表皮生長因子可溶率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I為cspA基因功能元件排列順序圖
圖2為pET-kan-cspA-SE質(zhì)粒物理圖譜
圖3為高可溶表達菌株SE-26搖瓶培養(yǎng)后表達SUMO-hEGF的結(jié)果。圖中I道為誘導(dǎo)前的樣品，2道為低溫誘導(dǎo)48小時后的全菌蛋白，3道為低溫誘導(dǎo)48小時后超聲破碎菌體并離心后的上清。
具體實施方式
本發(fā)明的重組hEGF工程菌構(gòu)建具體過程如下
I.包含卡那霉素抗性基因和cspA基因功能兀件的構(gòu)建
I. I卡那霉素抗性基因片段的獲得
I. I. I設(shè)計引物，序列如下
引物Kan-lj' -ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-31 (SEQID NO I)
引物Kan-〗』' -aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-31 (SEQID NO :2)
I. I. 2PCR反應(yīng)獲得卡那霉素抗性基因片段
PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶Vent購自NEB公司，pET42a質(zhì)粒購自默克密理博公司，PCR反應(yīng)體系如下
成分ThermoPoI緩沖液dNTP混合物引物Kan_1引物Kan-2Vent DNA聚合酶 pET42a質(zhì)粒PCR反應(yīng)的條件為變性94°C，30秒；退火56°C，30秒；延伸72°C，I分20秒； 循環(huán)數(shù)30
I. 2cspA基因功能兀件的犾得
cspA基因功能元件的序列如序列表中SEQ ID NO :3所示。各功能元件的排列順序如圖I所示。該序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。
2.編碼SUMO-hEGF基因片段的獲得
對編碼酵母SUMO蛋白的基因和編碼hEGF的基因序列，按照大腸桿菌的密碼子偏好性，進行密碼子優(yōu)化，獲得了適合在大腸桿菌中大量表達的序列OPT-SUMO-hEGF如序列表中SEQ ID N0:4所示。該序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。
系如下
3. pET-Kan-cspA-SE 質(zhì)粒的獲得 3. IpET-Kan質(zhì)粒的獲得 3. I. 1ρΕΤ21質(zhì)粒的雙酶切PET21質(zhì)粒購自默克密理博公司，Bgl II和Nde I內(nèi)切酶購自NEB公司，雙酶切體
成分pET21質(zhì)粒 10XNEB Buffer 3 Bgl Il Nde I用量 10μ 5μH2O
37°C酶切3小時。2μ 31 μ6
權(quán)利要求
1.一種重組人表皮生長因子(hEGF)工程菌的構(gòu)建和篩選方法，其特征在于重組hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法按以下步驟進行一、通過PCR技術(shù)獲得卡那霉素抗性基因，通過化學(xué)合成方式獲得大腸桿菌cspA基因功能元件；二、對編碼SUMO蛋白的基因和編碼hEGF的基因序列，按照大腸桿菌的密碼子偏好性，進行密碼子優(yōu)化，然后進行化學(xué)合成獲得適合在大腸桿菌中大量表達的序列OPT-SUMO-hEGF ;三、將第一步和第二步所得的片段連入pET21質(zhì)粒中，得到pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒；四、以pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒為模板,構(gòu)建轉(zhuǎn)座體；五、將轉(zhuǎn)座體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami 2 (DE3);六、篩選出融合蛋白SUM0_hEGF表達量高的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法，其特征在于在適合的PCR反應(yīng)條件下，獲得卡那霉素抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用PCR方法獲得卡那霉素抗性基因所用的初始質(zhì)粒為pET42a0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用PCR方法獲得卡那霉素抗性基因所用的引物序列如下 引物 Kan-1 :5' -ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-3! (SEQID NO 1)引物 Kan_2 :5' -aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-3! (SEQID NO 2)
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法，其特征在于cspA基因功能元件的序列為ggcaaattca tatgaaggaa tggtgtggcc gattaatcat aaatatgaaaaataattgtt gcatcacccg ccaatgcgtg gcttaatgca catcaaattgtgagcggata acaatttgat gtgctagcgc atatccagtg tagtaaggcaagtcccttca agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattcctttaacgcttcaaa atctgtaaag cacgccatat cgccgaaagg cacacttaattattaagagg taatacacca tgaatcacaa aRtRRRatcc aagctttaRRtaatctctgc ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcggggatttttttat ttgttttcag gaaataaata atcgatcgcg taataaaatctattattatt tttgtgaaga ataaatttgg gtgcaatgag aatgcgcaggccctttcgtc tcRCRCctcR aRRcagtctο
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法，其特征在于選用PET21為初始質(zhì)粒來構(gòu)建pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的選用pET21為初始質(zhì)粒構(gòu)建pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒，該結(jié)構(gòu)構(gòu)建需要以下步驟通過雙酶切和連接，把卡那霉素抗性基因片段插入PET21質(zhì)粒構(gòu)建ρΕΤ-Kan質(zhì)粒；通過雙酶切和連接，把cspA基因片段插入ρΕΤ-Kan質(zhì)粒構(gòu)建pET-Kan-cspA質(zhì)粒；通過兩步酶切和連接，把OPT-SUMO-hEGF序列插入pET-Kan_cspA質(zhì)粒構(gòu)建ρΕΤ-Kan-cspA-SE 質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒的步驟中，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計的表達高的重組hEGF的優(yōu)化序列OPT-SUMO-hEGF為RRcaaattRR atccatRcac caccaccacc accacggtat gtctgactctgaagttaacc aggaagcgaa accggaagtt aaaccggaag ttaaaccggaaacccacatc aacctgaaag tttctgacgg ttcttctgaa atcttcttcaaaatcaaaaa aaccaccccg ctgcgtcgtc tgatggaagc gttcgcgaaacgtcagggta aagaaatgga ctctctgcgt ttcctgtacg acggtatccgtatccaggcg gaccagaccc cggaagacct ggacatggaa gacaacgacatcatcgaagc gcaccgtgaa cagatcggtg gtaactctga ctctgaatgcccgctgtctc acgacggtta ctgcctgcac gacggtgttt gcatgtacatcgaagcgctg gacaaatacg cgtgcaactg cgttgttggt tacatcggtgaacgttgcca gtaccgtgac ctgaaatggt gggaactgcg ttaaaagcttgcagtcttο
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法，其特征在于以pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒為模板，合成ME-Kan-cspA-SE片段，然后將ME-Kan-cspA-SE片段和轉(zhuǎn)座酶混合構(gòu)建轉(zhuǎn)座體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的構(gòu)建轉(zhuǎn)座體步驟，其特征在于在適合的PCR反應(yīng)條件下，合成 ME_Kan_cspA_SE 片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的利用PCR方法合成ME-Kan-cspA-SE片段所用的引物序列如下引物 M_l:5' -ctgtctcttatacacatctcttttctacggggtctgacg-3' (SEQ ID NO :5)引物 M_2:5' -ctgtctcttatacacatctcaggccctttcgtctcgcgc-3' (SEQ ID NO :6)。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法，其特征在于轉(zhuǎn)化獲得高表達SUMO-hEGF大腸桿菌的方法如下將轉(zhuǎn)座體同Origami 2 (DE3)感受態(tài)細胞混合，先進行冰水浴，然后熱激，再加入適量LB培養(yǎng)基短暫培養(yǎng)，涂布平板，篩選抗卡那霉素的克隆。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組hEGF工程菌的構(gòu)建和篩選方法，其特征在于篩選高表達SUMO-hEGF大腸桿菌的方法如下挑取具有卡那霉素抗性的克隆，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)溫度降低，并加入誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達。分時段提取誘導(dǎo)表達的菌液，離心收集菌體，超聲破碎后檢測SUMO-hEGF的表達結(jié)果，表達量高的菌株即可用做生產(chǎn)用菌株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人表皮生長因子(hEGF)工程菌的構(gòu)建和篩選方法。主要步驟為一、由PCR技術(shù)獲得卡那霉素抗性基因，由化學(xué)合成方式獲得大腸桿菌cspA基因功能元件；二、對編碼SUMO蛋白和hEGF的基因序列，分別進行優(yōu)化，然后由化學(xué)合成獲得大量表達的融合蛋白基因序列OPT-SUMO-hEGF；三、將前兩步所得片段連入pET21質(zhì)粒，得到pET-Kan-cspA-SE質(zhì)粒；四、以上述質(zhì)粒為模板，構(gòu)建轉(zhuǎn)座體；五、將轉(zhuǎn)座體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami 2(DE3)；六、篩選出融合蛋白SUMO-hEGF表達量高的菌株。本發(fā)明得到的菌株基因組穩(wěn)定，表達的hEGF可溶率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/70GK102978231SQ20121027221
公開日2013年3月20日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者鄭春陽, 王磊, 王巍, 徐彬 申請人:天津強微特生物科技有限公司