專利名稱：基于dna分析的羊毛羊絨定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種基于DNA分析的羊毛羊絨定量檢測方法。
背景技術(shù)：
羊絨素有“軟黃金”之稱，價格昂貴，其良好的服用性能使得羊絨產(chǎn)品一直廣受歡迎。我國是山羊絨的重要生產(chǎn)國之一，世界上70%的羊絨都出自我國內(nèi)蒙、新疆、寧夏等地，每年依靠此項出口創(chuàng)匯數(shù)額可觀。一些不法商販將羊毛或脫鱗(改性)羊毛，拉伸綿羊毛等極易與山羊絨纖維混淆的纖維混為山羊絨，牟取暴利，極大地敗壞了我國的聲譽。2004-2006年，經(jīng)多次協(xié)商，英、美、法、澳大利亞及我國的專家一致同意用鱗片厚度來鑒別羊毛羊絨。羊絨的鱗片厚度(鱗片細胞本身的厚度)為O. 42 μ m以下，羊毛鱗片均在·
O.54 μ m以上。近年來，一方面是超細綿羊品種的出現(xiàn)，這些羊毛的鱗片厚度均在O. 50 μ m以下；另一方面，片面追求高產(chǎn)，遼寧蓋縣的高產(chǎn)絨山羊得到了大力推廣，羊絨普遍增粗，鱗片厚度增大。依靠鱗片厚度的鑒別方法已經(jīng)無法正確鑒別羊毛羊絨。羊毛羊絨的精確檢測一直是紡織品檢測領(lǐng)域的難題。一般來說化學合成纖維的鑒別相對容易，而物理、化學性質(zhì)相近的天然纖維的鑒別就比較困難，加之天然動物纖維常常要進行防縮處理及染色等工藝，增加了檢測的難度。目前常規(guī)使用的檢測方法為物理法，主要包括光學顯微鏡法和掃描電鏡法(SEM)。國內(nèi)外不同標準不約而同地將顯微鏡法置于最重要和最廣泛的應用地位。顯微鏡檢測存在一些問題費時，費力，且依賴檢測人員的經(jīng)驗，因而具有不可避免的主觀性。而掃描電鏡也存在著成本高，制樣麻煩，檢測時間長等缺陷。圖I是掃描電鏡下放大600倍的山羊絨和綿羊毛纖維。因此，建立新的方法，準確客觀地鑒別細羊毛與山羊絨纖維，對于公平貿(mào)易和維護我國產(chǎn)絨大國的良好聲譽，顯得尤為迫切。隨著生物技術(shù)和生命科學的飛速發(fā)展，DNA檢測技術(shù)以其客觀性和精準性在食品、動植物檢疫、醫(yī)療診斷、司法鑒定及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到了廣泛的應用。近年，有很多學者開展了基于DNA技術(shù)的纖維物種鑒別研究，對紡織品質(zhì)量檢測現(xiàn)代化技術(shù)的發(fā)展具有重要的推動作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的的第一個目的在于提供一種基于DNA分析的羊毛羊絨定量檢測方法。本發(fā)明的的第二個目的在于提供一種山羊源性纖維成分的檢測試劑盒。本發(fā)明的的第三個目的在于提供所述山羊源性纖維成分的檢測試劑盒的應用。本發(fā)明的的第四個目的在于提供一種綿羊源性纖維成分的檢測試劑盒。本發(fā)明的的第五個目的在于提供所述山羊源性纖維成分的檢測試劑盒的應用。本發(fā)明的的第六個目的在于提供一種山羊源性纖維成分的特異性引物和特異性探針。
本發(fā)明的的第七個目的在于提供一種綿羊源性纖維成分的特異性引物和特異性探針。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)作為本發(fā)明的第一方面，一種基于DNA分析的羊毛羊絨定量檢測方法，包括以下步驟步驟一、以待測樣品的DNA為模板，進行熒光定量PCR擴增；步驟二、檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號；步驟三計算待測樣品中山羊源性纖維成分和綿羊源性纖維成分的含量；其中，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增山羊源性纖維成分特異性引物對和山羊源性纖維成分特異性探針，以及擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對和綿羊源性纖維成分特異性探針?！て渲?，所述擴增山羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述山羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO :4和SEQ IDNO 5所示。其中，所述綿羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。作為本發(fā)明的第二方面，一種山羊源性纖維成分的檢測試劑盒，含有以下試劑(a)擴增山羊源性纖維成分特異性引物對；(b)山羊源性纖維成分特異性探針。進一步地,所述試劑盒還包括(C)標準參照物。其中，所述擴增山羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述山羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述標準參照物是山羊源性纖維成分DNA，或含有山羊源性纖維成分擴增目的片段的質(zhì)粒DNA，或山羊絨。作為本發(fā)明的第三方面，一種山羊源性纖維成分的檢測試劑盒的應用，用于定量檢測山羊源性纖維成分。作為本發(fā)明的第四方面，一種綿羊源性纖維成分的檢測試劑盒，含有以下試劑(a)擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對；(b)綿羊源性纖維成分特異性探針。進一步地,所述試劑盒還包括(C)標準參照物。其中，所述擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO :4和SEQ IDNO 5所示。其中，所述綿羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。其中，所述標準參照物是綿羊源性纖維成分DNA，或含有綿羊源性纖維成分擴增目的片段的質(zhì)粒DNA，或綿羊毛。
作為本發(fā)明的第五方面，一種綿羊源性纖維成分的檢測試劑盒的應用，用于定量檢測綿羊源性纖維成分。作為本發(fā)明的第六方面，一種山羊源性纖維成分的特異性引物和特異性探針，其中，所述山羊源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示；所述山羊源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ ID N0:3所示。作為本發(fā)明的第七方面，一種綿羊源性纖維成分的特異性引物和特異性探針，其中，所述綿羊源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO 4和SEQ IDNO 5所示；所述綿羊源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ ID N0:6所示。本發(fā)明的有益效果I、可快速、簡便地檢測羊毛羊絨混紡制品中的羊毛和羊絨含量； 2、靈敏度高，熒光定量PCR只需微量的DNA模板；3、針對山羊源性和綿羊源性的特異性引物和探針特異性好，準確度高，誤差小于10%。


圖I為山羊絨(左)和綿羊毛(右)的掃描電鏡圖。圖2為山羊源性檢測引物和探針的位置。圖3為綿羊源性檢測引物和探針的位置。圖4為山羊源性成分的實時熒光PCR結(jié)果。圖5為綿羊源性成分的實時熒光PCR結(jié)果。圖6為山羊源性成分的探針引物的特異性檢測結(jié)果。圖7為綿羊源性成分的探針引物的特異性檢測結(jié)果。圖8為山羊源性成分體系的靈敏度檢測結(jié)果，其中，從左往右各點分別代表山羊絨DNAl倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度稀釋。圖9為綿羊源性成分體系的靈敏度檢測結(jié)果其中，從左往右各點分別代表綿羊毛DNAl倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度稀釋。圖10為羊絨羊毛定量標準曲線圖。圖11為標為100%的羊絨圍巾的顯微鏡檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或廠商提供的條件進行。實施例I、引物和探針的設(shè)計針對山羊源性成分的產(chǎn)物大小為67bp。熒光定量引物和探針的位置如圖2所示，序列如下GolF :5，-CCCGTCACCCTCCTCAAGT-3，(SEQ ID NO 1)
GolR :5’ -CCTCTCATGTAGTTGATGCGTGTT-3’(SEQ ID NO :2)Pgol FAM-AATACAATGCACTCAAGC-MGB (SEQ ID NO :3)針對綿羊源性成分的產(chǎn)物大小為97bp。熒光定量引物和探針的位置如圖3所示，序列如下ShlF :5’ -CGTCACCCTCCTCAAGTAAATATGA-3’ (SEQ ID NO 4)ShlR :5’ -TTCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’ (SEQ ID NO 5)PshlFAM-ACCTATTTACATATATCAACCACAC-MGB (SEQ ID NO 6)其中，F(xiàn)AM表示熒光報告基團，MGB表示淬滅基團。本發(fā)明采用熒光探針法，其檢測 原理是利用熒光標記特異性探針來識別模板。與現(xiàn)有技術(shù)中SYBR染料法相比，本發(fā)明熒光標記特異性探針的特異性更強。實施例2、山羊源性成分和綿羊源性成分反應體系的優(yōu)化分別取山羊絨、綿羊毛5mg,剪碎后用progema毛發(fā)抽提試劑盒抽提DNA, 70 μ I洗脫液洗脫DNA。反應體系除ABI Taqman universal PCR master mix (2 X) 10 μ I, DNA 模板4 μ I以外，其他成分如表I和表2所示。引物的濃度為10 μ Μ，探針的濃度為2 μ Μ。表I、山羊源性成分測定優(yōu)化反應體系中其他成分的用量(單位μ I)
體系引物探針 ddH20 ~ 04 T&~
~20 4 2376~
306 Tl~
~ 06 2 O~
506 Σδ 2 9~
608 H~
~0 8 23 2~
~808ΓδΓ ~
917023
~10170ΓδΓδ~
~ΠO22Γ2~
~12O2 5Tl~表2、綿羊源性成分測定優(yōu)化反應體系中其他成分的用量(單位μ I)
權(quán)利要求
1.一種基于DNA分析的羊毛羊絨定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一、以待測樣品的DNA為模板，進行熒光定量PCR擴增； 步驟二、檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號； 步驟三計算待測樣品中山羊源性纖維成分和綿羊源性纖維成分的含量； 其特征在于，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增山羊源性纖維成分特異性引物對和山羊源性纖維成分特異性探針，以及擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對和綿羊源性纖維成分特異性探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述擴增山羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述山羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述綿羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。
6.一種山羊源性纖維成分的檢測試劑盒，含有以下試劑 Ca)擴增山羊源性纖維成分特異性引物對； (b)山羊源性纖維成分特異性探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括 (C)標準參照物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述擴增山羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述山羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
10.如權(quán)利要求6、中任一項的試劑盒的應用，用于定量檢測山羊源性纖維成分。
11.一種綿羊源性纖維成分的檢測試劑盒，含有以下試劑 Ca)擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對； (b)綿羊源性纖維成分特異性探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括 (C)標準參照物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述綿羊源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。
15.如權(quán)利要求1Γ14中任一項的試劑盒的應用，用于定量檢測綿羊源性纖維成分。
16.一種如權(quán)利要求I所述的山羊源性纖維成分的特異性引物和特異性探針，其特征在于，所述山羊源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述山羊源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ IDNO 3所示。
17.—種如權(quán)利要求I所述的綿羊源性纖維成分的特異性引物和特異性探針，其特征在于，所述綿羊源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示；所述綿 羊源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ IDNO 6所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于DNA分析的羊毛羊絨定量檢測方法，包括步驟一、以待測樣品的DNA為模板，進行PCR擴增；步驟二、檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號；步驟三計算待測樣品中山羊源性纖維成分和綿羊源性纖維成分的含量；其中，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增山羊源性纖維成分特異性引物對和山羊源性纖維成分特異性探針，以及擴增綿羊源性纖維成分特異性引物對和綿羊源性纖維成分特異性探針。
文檔編號C12Q1/68GK102899397SQ20121027160
公開日2013年1月30日 申請日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者費靜, 楊娟, 陸維民, 周輝, 唐敏峰, 張舒亞, 王衛(wèi)華, 張小明, 王小平, 葉尚華, 高友軍, 劉錦瑞 申請人:上海出入境檢驗檢疫局工業(yè)品與原材料檢測技術(shù)中心, 中華人民共和國新疆出入境檢驗檢疫局, 河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心