專利名稱：一種sod的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的提取方法，具體涉及一種超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法。
背景技術(shù)：
SOD是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)的簡(jiǎn)稱，國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的編碼為EC I. 15. I. I,屬于氧化還原類酶。SOD是一種能夠清除機(jī)體中過(guò)多自由基的活性物質(zhì)，該物質(zhì)與機(jī)體的衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病和輻射防護(hù)等密切有關(guān)，對(duì)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障、膀胱炎、皮膚病、紅斑狼瘡等疾病療效較好。此酶無(wú)抗原性，不良反應(yīng)小，副作用小，是一種醫(yī)療價(jià)值很高、具有廣闊前途的藥用酶。SOD按金屬輔基成分的不同分為三種，第一種是含有銅(Cu)鋅(Zn)金屬輔基的稱 (Cu. Zn一S0D),呈綠色,存在于機(jī)體細(xì)胞衆(zhòng)中；第二種是是含有猛(Mn)金屬輔基的稱(Mn—S0D)，呈紫色，存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；第三種是含有鐵(Fe)金屬輔基的稱(Fe —S0D),呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。SOD的分布極為廣泛，迄今為止已從細(xì)菌、真菌、藻類、魚類、昆蟲和哺乳類動(dòng)物等各種生物體分離得到。但是，從最早發(fā)現(xiàn)SOD到今天對(duì)SOD的開發(fā)應(yīng)用，SOD大都是從動(dòng)物的血液中分離提取。因此，公開的提取SOD的方式大多的是動(dòng)物血液提取和分離。由于分離提取SOD的動(dòng)物血液的資源有限，代價(jià)也非常昂貴，進(jìn)而造成原料緊張，成本增加。在分離提取SOD時(shí)，需要多次加入動(dòng)物血液再多次分離該物質(zhì)，使得分離提取工藝繁瑣復(fù)雜，容易造成化學(xué)污染。另外，由于使用的是動(dòng)物血液，提取SOD時(shí)還存在艾滋病等血液中病毒的交叉感染及其它潛在危險(xiǎn)。國(guó)際衛(wèi)生組織曾經(jīng)呼吁立刻停止從動(dòng)物血液中提取的SOD的使用。另外，來(lái)源于動(dòng)物血液的S0D，是含有銅(Cu)鋅(Zn)金屬輔基的稱為Cu. Zn — S0D)
的單一性酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取SOD的方法，該方法可以從植物中獲得S0D。本發(fā)明提供的SOD的提取方法包括以下步驟將刺梨果粉碎，獲得刺梨果塊；對(duì)刺梨果塊進(jìn)行浸提，得到浸提液；將浸提液進(jìn)行離心分離，得到SOD粗酶液；將SOD粗酶液進(jìn)行超濾，得到SOD溶液；將SOD溶液濃縮，得到SOD濃縮液；將SOD濃縮液離心噴霧干燥得到S0D?？蛇x的，將SOD濃縮液離心噴霧干燥得到粉末狀固體S0D?？蛇x的，將野生刺梨果粉碎，獲得野生刺梨果塊。
可選的，在6(T70°C的純凈水中對(duì)刺梨果塊進(jìn)行恒溫浸提8 12h?？蛇x的，將SOD粗酶液進(jìn)行超濾進(jìn)一步包括將SOD粗酶液通過(guò)一級(jí)濾膜，收集一級(jí)截留液；用純凈水稀釋一級(jí)截留液后再通過(guò)二級(jí)濾膜，收集二級(jí)通過(guò)液和二級(jí)截留液；用純凈水稀釋二級(jí)通過(guò)液后再通過(guò)三級(jí)濾膜，收集三級(jí)截留液；將二級(jí)截留液和三級(jí)截留液合并得到為SOD溶 液?？蛇x的，一級(jí)濾膜分子量為5000 10000，二級(jí)濾膜分子量為50000 80000，三級(jí)濾膜分子量為20000 40000。可選的，對(duì)SOD溶液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其范圍在3. 8 5. 2之間?？蛇x的，在將刺梨果粉碎之前，還包括清洗刺梨果的步驟?？蛇x的，在清洗之后對(duì)刺梨果進(jìn)行烘干的步驟，且在烘干過(guò)程中向刺梨果加硫磺?？蛇x的，將SOD溶液減壓真空濃縮18 30min，得到SOD濃縮液。本發(fā)明提供的SOD的提取方法是全物理方法提取S0D，只需要常用的簡(jiǎn)單設(shè)備即可完成，工藝簡(jiǎn)單，不存在危險(xiǎn)；且提取過(guò)程中所使用的溫度不高，條件溫和，成品SOD常溫下能夠保存；由于采用了生物技術(shù)?；罟に?，全物理處理工藝，故既無(wú)環(huán)境污染也沒(méi)有內(nèi)原性化學(xué)污染；進(jìn)而該SOD的提取方法能夠降低開發(fā)成本，是一種具備規(guī)模提取植物SOD的方法。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例I提供的從野生刺梨中提取SOD的方法流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的從野生刺梨中提取SOD的方法流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明公開技術(shù)內(nèi)容的限制。申請(qǐng)人:檢測(cè)種植刺梨和野生刺梨中SOD的含量，種植刺梨含S0D54000U/100g，野生刺梨含SOD ^ 810000U/100go野生刺梨中SOD的含量很高，野生刺梨一般生長(zhǎng)在海拔800米到1800米的高度，具有極強(qiáng)的抗異性。一般認(rèn)為，生物體抗異性越強(qiáng)，SOD的含量就越高。實(shí)施例I :以下是對(duì)本發(fā)明實(shí)施例提供的提取方法進(jìn)行描述。請(qǐng)參考圖1，圖I是本發(fā)明實(shí)施例I提供的一種從野生刺梨中提取SOD的方法流程圖，該方法包括以下步驟步驟101 :將野生刺梨果粉碎，獲得野生刺梨果塊。步驟102 :將得到的野生刺梨果塊在水中浸提，得到浸提液。步驟103 :將浸提液進(jìn)行離心分離，取上清液得到SOD粗酶液。步驟104 :將SOD粗酶液進(jìn)行超濾，過(guò)濾掉雜質(zhì)得到SOD溶液。步驟105 :將SOD溶液進(jìn)行濃縮，得到SOD濃縮液。步驟106 :將SOD濃縮液離心噴霧干燥得到S0D。該實(shí)施例提供的SOD的提取方法是全物理方法提取、分離SOD復(fù)合酶，只需要常用的簡(jiǎn)單設(shè)備即可完成，工藝簡(jiǎn)單，不存在危險(xiǎn)；且提取過(guò)程中所使用的溫度不高，條件溫和，成品SOD常溫下能夠保存；由于采用了生物技術(shù)?；罟に嚕锢硖幚砉に?，故既無(wú)環(huán)境污染也沒(méi)有內(nèi)原性化學(xué)污染；進(jìn)而該SOD的提取方法能夠降低開發(fā)成本，是一種具備規(guī)模提取植物SOD的方法。用該方法提取出來(lái)的產(chǎn)品是Cu. Zn — S0D、Mn — SOD和Fe — SOD三種酶的聚合體。鑒別三種酶的聚合體的方法是電泳法通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)Cu. Zn — S0D、Mn — SOD和Fe—SOD的相對(duì)分子質(zhì)量與所帶電荷等的性質(zhì)差異，在凝膠條上區(qū)分成不同的帶。實(shí)施例2 參考圖2，實(shí)施例2提供的用野生刺梨果提取SOD的方法，包括以下步驟步驟101 :將野生刺梨果用水清洗。 步驟102 :將野生刺梨果干燥，具體實(shí)施方式
為自然晾干，達(dá)到含水率為109^20%即可。步驟103 :用粉碎機(jī)將野生刺梨果粉碎，用1(T20目的篩子篩分野生刺梨果和雜質(zhì)，得到野生刺梨果塊。步驟104 :稱取野生刺梨果塊2公斤用紗布松散包好，放入40公斤純凈水溶劑里，加溫到55°C保持此溫度不變浸提24小時(shí)，每2小時(shí)人工攪拌一次，得到浸提液。步驟105 :將浸提液離心分離，然后靜置2小時(shí)，取上層清液即得SOD粗酶液。步驟106 :將SOD粗酶液通過(guò)分子量為5000的一級(jí)濾膜，除去大部分小分子物質(zhì)，主要是無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)酸及多糖，收集一級(jí)截留液和一級(jí)通過(guò)液，用純凈水稀釋一級(jí)截留液100 倍。步驟107 :將稀釋后的一級(jí)截留液通過(guò)分子量為50000的二級(jí)濾膜，收集二級(jí)截留液和二級(jí)通過(guò)液，再用純凈水把通過(guò)液稀釋100倍。步驟108 :將稀釋后的二級(jí)通過(guò)液通過(guò)分子量為20000的三級(jí)濾膜，收集三級(jí)截留液。將二級(jí)截留液、三級(jí)截留液合并即為SOD溶液，其主要成分是Cu. Zn — S0D、Mn — SOD和Fe — SOD三種酶的聚合體。步驟109 :用稀釋后的一級(jí)截留液對(duì)SOD溶液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值達(dá)到3. 8。步驟110 :將經(jīng)過(guò)PH調(diào)節(jié)的SOD溶液減壓真空濃縮，溫度保持在80°C，濃縮時(shí)間18min,得到SOD濃縮液。步驟111 :將SOD濃縮液離心噴霧干燥，離心噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)口溫度為180°C，這樣出料溫度可以保持在50°C左右。步驟112:得到 S0D。鑒別三種酶的聚合體的方法是電泳法通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)Cu. Zn — S0D、Mn — SOD和Fe—SOD的相對(duì)分子質(zhì)量與所帶電荷等的性質(zhì)差異，在凝膠條上區(qū)分成不同的帶。SOD是體內(nèi)專一清除超氧陰離子自由基的一個(gè)抗氧酶，它的清除反應(yīng)如下 O2 +O2 +2H+ — H202+02SOD通過(guò)三條途徑確保高效清除(O2‘_)。其一是運(yùn)用金屬輔基形式的多樣性，一旦一種酶受阻，就可用另一種來(lái)補(bǔ)償；二是利用在進(jìn)化上的高度保守，防止發(fā)生變異；三是借助與催化有關(guān)部位上表現(xiàn)出高度的結(jié)構(gòu)統(tǒng)一性，保證催化功能的順利進(jìn)行。
實(shí)施例3 提供用野生刺梨果提取SOD的方法，與實(shí)施例2除了以下步驟外均相同步驟104 :稱取粉碎后的野生刺梨果塊2公斤用紗布松散包好，放入100公斤純凈水溶劑里，加溫到90°C保持此溫度不變浸提8小時(shí)，每2小時(shí)人工攪拌一次，得到浸提液。步驟106 :將SOD粗酶液通過(guò)分子量為10000的一級(jí)濾膜，除去大部分小分子物質(zhì)，主要是無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)酸及多糖，收集一級(jí)截留液和一級(jí)通過(guò)液，用純凈水稀釋一級(jí)截留液100倍。步驟107 :將稀釋后的一級(jí)截留液通過(guò)分子量為80000的二級(jí)濾膜，收集二級(jí)截留液和二級(jí)通過(guò)液，再用純凈水把通過(guò)液稀釋100倍。步驟108 :將稀釋后的二級(jí)通過(guò)液通過(guò)分子量為40000的三級(jí)濾膜，收集三級(jí)截留液。將二級(jí)截留液、三級(jí)截留液合并即為SOD溶液，其主要成分是Cu. Zn — S0D、Mn — SOD和 Fe — SOD三種酶的聚合體。步驟109 :用稀釋后的一級(jí)截留液對(duì)SOD溶液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值達(dá)到4. O。步驟110 :將經(jīng)過(guò)PH調(diào)節(jié)的SOD溶液減壓真空濃縮，溫度保持在65°C，濃縮時(shí)間30min，得到SOD濃縮液。步驟111 :將SOD濃縮液離心噴霧干燥，離心噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)口溫度160°C，出料溫度 20。。。SOD是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，作為專一超氧陰離子自由基的清除劑，在疾病的治療、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用。實(shí)施例4 提供用種植刺梨果提取SOD的方法，與實(shí)施例2除了以下步驟外均相同步驟104 :稱取粉碎后的種植刺梨果塊2公斤用紗布松散包好，放入140公斤純凈水溶劑里，加溫到70°C保持此溫度不變浸提12小時(shí)，每2小時(shí)人工攪拌一次，得到浸提液。步驟109 :用稀釋后的一級(jí)截留液對(duì)SOD溶液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值達(dá)到5. 2。步驟110 :將經(jīng)過(guò)PH調(diào)節(jié)的SOD溶液減壓真空濃縮，溫度保持在75°C，濃縮時(shí)間20min，得到SOD濃縮液。步驟111 :將SOD濃縮液離心噴霧干燥，離心噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)口溫度160°C，出料溫度 20。。。用此方法提取出來(lái)的SOD為三種酶的綜合體，第一種為Cu. Zn—SOD含量為65. 3% ；第二種為Mn — SOD含量為14. 4% ;第三種為Fe — SOD含量為20. 3%。實(shí)施例5 提供用野生刺梨果提取SOD的方法，與實(shí)施例2除了以下步驟外均相同步驟102 :將野生刺梨果加熱烘干，同時(shí)每噸野生刺梨果加入6克硫磺做保護(hù)劑，最大限度的保留刺梨干果的生物成分及活性物質(zhì)，達(dá)到含水率為109^20%即可停止烘干。野生刺梨果加入硫磺的量可以根據(jù)實(shí)際需要確定。步驟104 :稱取粉碎后的野生刺梨果塊2公斤用紗布松散包好，放入100公斤純凈水溶劑里，加溫到60°C保持此溫度不變浸提8小時(shí)，每2小時(shí)人工攪拌一次，得到浸提液。步驟109 :用稀釋后的一級(jí)截留液對(duì)SOD溶液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值達(dá)到4. 5。步驟110 :將經(jīng)過(guò)PH調(diào)節(jié)的SOD溶液減壓真空濃縮，溫度保持在70°C，濃縮時(shí)間20min，得到SOD濃縮液。步驟111 :將SOD濃縮液離心噴霧干燥，離心噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)口溫度160°C，出料溫度 20。。。本方法主要是全物理方法提取、分離S0D，只需要常用的簡(jiǎn)單設(shè)備即可完成，工藝簡(jiǎn)單，不存在危險(xiǎn)；且提取過(guò)程中所使用的溫度不高于200°C，條件溫和，成品SOD常溫下能夠保存；由于采用了生物技術(shù)?；罟に?，全物理處理工藝，故既無(wú)環(huán)境污染也沒(méi)有內(nèi)原性化學(xué)污染；降低開發(fā)成本，是一種具備規(guī)模提取植物SOD的方法。實(shí)施例6 提供用野生刺梨果提取SOD的方法，與實(shí)施例2除了以下步驟外均相同步驟102 :將野生刺梨果加熱烘干，同時(shí)每噸野生刺梨果加入6克硫磺做保護(hù)劑，最大限度的保留刺梨干果的生物成分及活性物質(zhì)，達(dá)到含水率為109^20%即可停止烘干。 步驟104 :稱取粉碎后的野生刺梨果塊2公斤用紗布松散包好，放入100公斤純凈水溶劑里，加溫到65°C保持此溫度不變浸提24小時(shí)，每2小時(shí)人工攪拌一次，得到浸提液。步驟109 :用稀釋后的一級(jí)截留液的野生刺梨汁對(duì)SOD溶液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值達(dá)到5.0。步驟110 :將經(jīng)過(guò)PH調(diào)節(jié)的SOD溶液減壓真空濃縮，溫度保持在80°C，濃縮時(shí)間18min,得到SOD濃縮液。步驟111 :將SOD濃縮液離心噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度180°C，出料溫度50°C。該提取方法在國(guó)際市場(chǎng)前景廣闊，而且國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求也很大，許多先進(jìn)國(guó)家只承認(rèn)第三代保健食品，能適應(yīng)發(fā)展的需求和進(jìn)入WTO及國(guó)際市場(chǎng)。為直接利用植物資源的抗氧化產(chǎn)品的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化打開了方便之門。旨在通過(guò)對(duì)功能食品關(guān)鍵技術(shù)的研究與產(chǎn)業(yè)化示范，增強(qiáng)我國(guó)功能食品的原始創(chuàng)新能力和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明提供的技術(shù)方案進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明提供的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾；這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種超氧化物歧化酶SOD的提取方法，其特征在于，包括以下步驟 將刺梨果粉碎，獲得刺梨果塊； 對(duì)刺梨果塊進(jìn)行浸提，得到浸提液； 將浸提液進(jìn)行離心分離，得到SOD粗酶液； 將含有SOD粗酶液進(jìn)行超濾，得到SOD溶液； 將SOD溶液濃縮，得到SOD濃縮液； 將SOD濃縮液離心噴霧干燥得到S0D。
2.如權(quán)利要求I所述的SOD的提取方法，其特征在于，將SOD濃縮液離心噴霧干燥得到粉末狀固體S0D。
3.如權(quán)利要求I所述的SOD的提取方法，其特征在于，將野生刺梨果粉碎，獲得野生刺梨果塊。
4.如權(quán)利要求I所述的SOD的提取方法，其特征在于，在6(T70°C的純凈水中對(duì)刺梨果塊進(jìn)行恒溫浸提8 12h。
5.如權(quán)利要求I所述的SOD的提取方法，其特征在于，將SOD粗酶液進(jìn)行超濾進(jìn)一步包括 將SOD粗酶液通過(guò)一級(jí)濾膜，收集一級(jí)截留液； 用純凈水稀釋一級(jí)截留液后再通過(guò)二級(jí)濾膜，收集二級(jí)通過(guò)液和二級(jí)截留液； 用純凈水稀釋二級(jí)通過(guò)液后再通過(guò)三級(jí)濾膜，收集三級(jí)截留液； 將二級(jí)截留液和三級(jí)截留液合并得到SOD溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的SOD的提取方法，其特征在于，一級(jí)濾膜分子量為5000 10000，二級(jí)濾膜分子量為50000 80000，三級(jí)濾膜分子量為20000 40000。
7.如權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)所述的SOD的提取方法，其特征在于，對(duì)SOD溶液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其范圍在3. 8^5. 2之間。
8.如權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)所述的SOD的提取方法，其特征在于，在將刺梨果粉碎之前，還包括清洗刺梨果的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的SOD的提取方法，其特征在于，在清洗之后對(duì)刺梨果進(jìn)行烘干的步驟，且在烘干過(guò)程中向刺梨果加硫磺。
10.如權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)所述的SOD的提取方法，其特征在于，將SOD溶液減壓真空濃縮18 30min，得到SOD濃縮液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種酶的提取方法，具體涉及一種SOD的提取方法。包括以下步驟將刺梨果粉碎，獲得刺梨果塊；對(duì)刺梨果塊進(jìn)行浸提，得到浸提液；將浸提液進(jìn)行離心分離，得到SOD粗酶液；將SOD粗酶液進(jìn)行超濾，得到SOD溶液；將SOD溶液濃縮，得到SOD濃縮液；將SOD濃縮液離心噴霧干燥得到SOD。本方法是全物理方法提取SOD，采用常用的簡(jiǎn)單設(shè)備即可完成，工藝簡(jiǎn)單，不存在危險(xiǎn)；且提取過(guò)程中所使用的溫度不高，條件溫和，SOD常溫下能夠保存；由于采用了生物技術(shù)?；罟に?，全物理處理工藝，故既無(wú)環(huán)境污染也沒(méi)有內(nèi)原性化學(xué)污染；降低開發(fā)成本，是一種具備規(guī)模提取植物SOD的方法。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102747054SQ201210265598
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者田瑛 申請(qǐng)人:田瑛