Sucla2基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸、分離的多肽、篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法、篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的試劑盒。其中，分離的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有c.C308A突變。通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。
【專利說明】SUCLA2基因突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及SUCLA2基因突變體及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及分離的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸、分離的多肽、篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法、篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]線粒體呼吸鏈復(fù)合酶(Multiplemitochondrial respiratory chain, MRC)缺陷是導(dǎo)致線粒體疾病的重要原因，受多種分子遺傳機(jī)制影響，如線粒體DNA(mtDNA)缺失，線粒體tRNA點(diǎn)突變，線粒體RNA翻譯缺陷，線粒體DNA(mtDNA)耗竭，呼吸鏈亞基組裝或調(diào)節(jié)功能缺陷，線粒體蛋白質(zhì)輸入受損。兒童期發(fā)病的線粒體疾病主要由mtDNA耗竭導(dǎo)致(mitochondrial DNA depletion syndromes, MDS1MIM 251880,線粒體 DNA 耗竭綜合征)，MDS不同于其他線粒體疾病,它是一數(shù)量上出現(xiàn)缺陷的疾病而非質(zhì)量上的問題,表現(xiàn)為mtDNA拷貝數(shù)減少，而線粒體本身數(shù)目可能正常，缺失或是增多，導(dǎo)致細(xì)胞中呼吸鏈復(fù)合體的合成與ATP合成下降，降低了線粒體的能量代謝功能，為常染色體隱性遺傳，具有遺傳和臨床上的異質(zhì)性。臨床上可分為肝腦病變型、肌肉病變型、其他型如Alpers綜合征等三種類型。研究表明，許多核基因編碼的基因突變與上述疾病相關(guān)。
[0003]然而，現(xiàn)階段對線粒體DNA耗竭綜合征的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出線粒體DNA耗竭綜合征·(有時也稱為“MDS”)的致病基因上的新突變。
[0005]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作而完成的:發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗(yàn)證的方法確定了線粒體DNA耗竭綜合征的致病基因上的新突變(SUCLA2，c.C308A)。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸(即SUCLA2基因突變體)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該核酸與SEQ ID Ν0:1相t匕，具有C.C308A突變。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 SUCLA2基因突變體，該突變體與MDS的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該多肽與SEQ ID N0:2相比，具有p.Alal03Asp突變。通過檢測生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:從生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有c.C308A突變是所述生物樣品易感線粒體DNA耗竭綜合征的指示。通過根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征(即MDS)的生物樣品的方法，可以有效地篩選易感MDS的生物樣
品O
[0009]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該系統(tǒng)包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQID NO:1相比，是否具有c.C308A突變，判斷所述生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實(shí)施前述篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒含有:適于檢測SUCLA2基因突變體的試劑，其中與SEQ ID N0:1相比，所述SUCLA2基因突變體具有C.C308A突變。利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒，能夠有效地篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品。
[0011]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0013]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易感MDS的生物樣品的系統(tǒng)及其組成部分的示意圖，其中，A為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易感MDS的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，B為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸提取裝置的示意圖，C為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0014]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的對患者PI的SUCLA2基因c.C308A突變位點(diǎn)的Sanger測序驗(yàn)證峰圖；
[0015]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的對患者PII的SUCLA2基因c.C308A突變位點(diǎn)的Sanger測序驗(yàn)證峰圖；以及
[0016]圖4和圖5分別顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的對患者PI和PII的父母的SUCLA2基因c.C308A突變位點(diǎn)的Sanger測序驗(yàn)證峰圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0018]SUCLA2基因突變體
[0019]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與SEQ ID Ν0:1相比，該核酸具有C.C308A突變。在本文中所使用的表達(dá)方式“編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸”，是指與編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的基因相對應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的編碼基因(即SUCLA2基因突變體)相對應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，前面所述的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸為DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 SUCLA2基因的突變體，該突變體與線粒體DNA耗竭綜合征的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征，也可以通過檢測該突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測生物體是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。
[0020] 該編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸，是本申請的發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗(yàn)證的方法確定的線粒體DNA耗竭綜合征的致病基因上的新突變。并且，在現(xiàn)有技術(shù)中并未見SUCLA2基因上的c.C308A突變與MDS相關(guān)的報道。[0021 ] 野生型SUCLA2基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:
[0022]ATGGCGGCCTCCATGTTCTACGGCAGGCTAGTGGCCGTGGCCACCCTTCGGAACCACCGGCCTCGGACGGCCCAGCGGGCTGCTGCTCAGGTTCTGGGAAGTTCTGGATTGTTTAATAACCATGGACTCCAAGTACAGCAGCAACAGCAAAGGAATCTCTCACTACATGAATACATGAGTATGGAATTATTGCAAGAAGCTGGTGTCTCCGTTCCCAAAGGATATGTGGCAAAGTCACCAGATGAAGCTTATGCAATTGCCAAAAAATTAGGTTCAAAAGATGTCGTGATAAAGGCACAGGTTTTAGCTGGTGGTAGAGGAAAAGGAACATTTGAAAGTGGCCTCAAAGGAGGAGTGAAGATAGTTTTCTCTCCAGAAGAAGCAAAAGCTGTTTCTTCACAAATGATTGGGAAAAAATTGTTTACCAAGCAAACGGGAGAAAAGGGCAGAATATGCAATCAAGTATTGGTCTGTGAGCGAAAATATCCCAGGAGAGAATACTACTTTGCAATAACAATGGAAAGGTCATTTCAAGGTCCTGTATTAATAGGAAGTTCACATGGTGGTGTCAACATTGAAGATGTTGCTGCTGAGTCTCCTGAAGCAATAATTAAAGAACCTATTGATATTGAAGAAGGCATCAAAAAGGAACAAGCTCTCCAGCTTGCACAGAAGATGGGATTTCCACCTAATATTGTGGAATCAGCAGCAGAAAACATGGTCAAGCTTTACAGCCTTTTTCTGAAATACGATGCAACCATGATAGAAATAAATCCAATGGTGGAAGATTCAGATGGAGCTGTATTGTGTATGGATGCAAAGATCAATTTTGACTCTAATTCAGCCTATCGCCAAAAGAAAATCTTTGATCTACAGGACTGGACCCAGGAAGATGAAAGGGACAAAGATGCTGCTAAGGCAAATCTCAACTACATTGGCCTCGATGGAAATATAGGCTGCCTAGTAAATGGTGCTGGTTTGGCTATGGCCACAATGGATATAATAAAACTTCATGGAGGGA`CTCCAGCCAACTTCCTTGATGTTGGTGGTGGTGCTACAGTCCATCAAGTAACAGAAGCATTTAAGCTTATCACTTC`AGATAAAAAGGTACTGGCTATTCTGGTCAACATTTTTGGAGGAATCATGCGCTGTGATGTTATTGCACAGGGTATAGTCATGGCAGTAAAAGACTTGGAAATTAAAATACCTGTTGTGGTACGGTTACAAGGLACACGAGTCGATGATGCLAAGGCACTGATAGCGGACAGTGGACTTAAAATACTTGCTTGTGATGACTTGGATGAAGCTGCTAGAATGGTTGTAAAGCTCTCTGAAATAGTGACCTTAGCGAAGCAAGCACATGTGGATGTGAAATTTCAGTTGCCAATATGACSEQ ID NO:1 )，其編碼的琥珀酸輔酶A連接酶的β亞基具有如下所示的氨基酸序列:
[0023]MAASMFYGRLVAVATLRNHRPRTAQRAAAQVLGSSGLFNNHGLQVQQQQQRNLSLHEYMSMELLQEAGVSVPKGYVAKSPDEAYAIAKKLGSKDVVIKAQVLAGGRGKGTFESGLKGGVKIVFSPEEAKAVSSQMIGKKLFTKQTGEKGRICNQVLVCERKYPRREYYFAITMERSFQGPVLIGSSHGGVNIEDVAAESPEAIIKEPIDIEEGIKKEQALQLAQKMGFPPNIVESAAENMVKLYSLFLKYDATMIEINPMVEDSDGAVLCMDAKINFDSNSAYRQKKIFDLQDWTQEDERDKDAAKANLNYIGLDGNIGCLVNGAGLAMATMD11KLHGGTPANFLDVGGGATVHQVTEAFKLIT SDKKVLAILVNIFGGIMRCDVIAQGIVMAVKDLEIKIPVVVRLQGTRVDDAKALIADSGLKILACDDLDEAARMVVKLSEIVTLAKQAHVDVKFQLPI (SEQ ID NO:2)
[0024]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的SUCLA2基因突變體與SEQ ID NO:1相比，具有c.C308A突變，即相對于野生型SUCLA2基因，本發(fā)明的SUCLA2基因突變體的cDNA中第308位的C突變?yōu)锳，由此，其所編碼的產(chǎn)物與野生型琥珀酸輔酶A連接酶的β亞基(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Alal03Asp突變，即其103位氨基酸從Ala突變?yōu)锳sp。
[0025]SUCLA2 (MM:*603921)位于13號染色體，包含11個外顯子，編碼含463個氨基酸琥珀酸輔酶A連接酶的β亞基，與α亞基通過異二聚化作用形成琥珀酸輔酶A連接酶，參與三羧酸循環(huán)過程。該基因突變會導(dǎo)致線粒體DNA耗竭綜合征(ΜΜ: 612073)，伴甲基丙二酸尿的線粒體腦肌病。截止到目前，僅有25例攜帶SUCLA2基因突變的患者被報道，其中大部分來自法羅群島，為4號內(nèi)含子的剪接微點(diǎn)G>A純合突變，導(dǎo)致4號外顯子被剪接掉。目前尚未有關(guān)于本發(fā)明提出的SUCLA2基因的c.C308A突變導(dǎo)致MDS的報道。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與SEQ ID N0:2相比，該分離的多肽具有p.Alal03Asp突變。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該多肽是由前述分離的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸(即SUCLA2基因突變體)編碼的。通過檢測生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征，也可以通過檢測這些多肽在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測生物體是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。
[0027]篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法
[0028]根據(jù)本發(fā)明的 第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法可以包括以下步驟:
[0029]首先，從生物樣品提取核酸樣本。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，生物樣品的類型并不受特別限制，只要從該生物樣品中能夠提取到反映生物樣品SUCLA2是否存在突變的核酸樣本即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，生物樣品可以為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種。由此，可以方便地進(jìn)行取樣和檢測，從而能夠進(jìn)一步提高篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，這里所使用的術(shù)語“核酸樣本”應(yīng)做廣義理解，其可以是任何能夠反映生物樣品中SUCLA2是否存在突變的樣本，例如可以是從生物樣品中直接提取的全基因組DNA，也可以是該全基因組中包含SUCLA2編碼序列的一部分，可以是從生物樣品中提取的總RNA，也可以是從生物樣品中提取的mRNA。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，所述核酸樣本為全基因組DNA。由此，可以擴(kuò)大生物樣品的來源范圍，并且可以同時對生物樣品的多種信息進(jìn)行確定，從而能夠提高篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，針對采用RNA作為核酸樣本，從生物樣品提取核酸樣本可以進(jìn)一步包括:從生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選RNA樣本為mRNA ；以及基于所得到的RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所得到的cDNA樣本構(gòu)成核酸樣本。由此，可以進(jìn)一步提高利用RNA作為核酸樣本篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的效率。
[0030]接下來，在得到核酸樣本之后，可以對核酸樣本進(jìn)行分析，從而能夠確定所得到核酸樣本的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，確定所得到核酸樣本的核酸序列的方法和設(shè)備并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以通過測序方法，確定核酸樣本的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用于進(jìn)行測序的方法和設(shè)備并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用第二代測序技術(shù)，也可以采用第三代以及第四代或者更先進(jìn)的測序技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以利用選自Hiseq2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種對核酸序列進(jìn)行測序。由此，結(jié)合最新的測序技術(shù)，針對單個位點(diǎn)可以達(dá)到較高的測序深度，檢測靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高，因而能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點(diǎn)，進(jìn)一步提高對核酸樣本進(jìn)行檢測分析的效率。從而，能夠提高后續(xù)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時的精確性和準(zhǔn)確度。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，確定核酸樣本的核酸序列可以進(jìn)一步包括:首先，針對所得到的核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及對所得到的核酸測序文庫進(jìn)行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，可以采用選自Hiseq2000, S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所得到的核酸測序文庫進(jìn)行測序。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以對核酸樣本進(jìn)行篩選，富集SUCLA2外顯子，該篩選富集可以在構(gòu)建測序文庫之前，構(gòu)建測序文庫過程中，或者構(gòu)建測序文庫之后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，針對核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫進(jìn)一步包括:利用SUCLA2基因外顯子特異性引物，對核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及針對所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建核酸測序文庫。由此，可以通過PCR擴(kuò)增，富集SUCLA2外顯子，從而能夠進(jìn)一步提高篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，SUCLA2基因外顯子特異性引物的序列不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，這些SUCLA2基因外顯子特異性引物具有SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列。 [0031]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過采用這些引物，可以在PCR反應(yīng)體系中顯著有效地完成對SUCLA2外顯子尤其是c.C308A所在的3號外顯子與4號外顯子之間的序列的擴(kuò)增。需要說明的是，這些SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列是本發(fā)明的發(fā)明人在付出了艱苦的勞動后，意外獲得的。
[0032]關(guān)于針對核酸樣本，構(gòu)建測序文庫的方法和流程，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)不同的測序技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)選擇，關(guān)于流程的細(xì)節(jié)，可以參見測序儀器的廠商例如Illumina公司所提供的規(guī)程，例如參見 Illumina 公司 Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361;Feb 2010)或 Paired-End SamplePrep Guide (Part#1005063 ；Feb2010),通過參照將其并入本文。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從生物樣品提取核酸樣本的方法和設(shè)備，也不受特別限制，可以采用商品化的核酸提取試劑盒進(jìn)行。
[0033]需要說明的是，在這里所使用的術(shù)語“核酸序列”應(yīng)作廣義理解，其可以是在對核酸樣本進(jìn)行測序得到的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通過對核酸樣本進(jìn)行測序所得到的測序數(shù)據(jù)(reads)作為核酸序列，只要這些核酸序列中含有對應(yīng)SUCLA2的編碼序列即可。
[0034]最后，在確定核酸樣本的核酸序列之后，將所得到的核酸樣本的核酸序列與SEQID NO:1的序列相比對。如果在所得到的核酸序列中具有c.C308A突變，則指示生物樣品易感線粒體DNA耗竭綜合征。由此，通過根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法，可以有效地篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對核酸序列與SEQ ID NO:1進(jìn)行比對的方法和設(shè)備并不受特別限制，可以采用任意常規(guī)的軟件進(jìn)行操作，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，可以采用SOAP軟件進(jìn)行比對。
[0035]需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的“篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法”的用途不受特別限制，例如可以用作非診斷目的的篩選方法。[0036]篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的系統(tǒng)和試劑盒
[0037]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種能夠有效實(shí)施上述篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法的系統(tǒng)。
[0038]參考圖1，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的系統(tǒng)1000包括:核酸提取裝置100、核酸序列確定裝置200以及判斷裝置300。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸提取裝置100用于從生物樣品提取核酸樣本。如前所述，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸樣本的類型并不受特別限制，對于采用RNA作為核酸樣本，則核酸提取裝置進(jìn)一步包括RNA提取單元101和反轉(zhuǎn)錄單元102，其中，提取單元101用于從生物樣品提取RNA樣本，反轉(zhuǎn)錄單元102與RNA提取單元101相連，用于對RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本,所得到的cDNA樣本構(gòu)成核酸樣本。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸序列確定裝置200與核酸提取裝置100相連，用于對核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定核酸樣本的核酸序列。如前所示，可以采用測序的方法確定核酸樣本的核酸序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，所述核酸序列確定裝置200可以進(jìn)一步包括:文庫構(gòu)建單元201以及測序單元202。文庫構(gòu)建單元201用于針對核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；測序單元202與文庫構(gòu)建單元201相連，用于對核酸測序文庫進(jìn)行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果。如前所述，可以通過PCR擴(kuò)增，富集SUCLA2外顯子，進(jìn)一步提聞篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的效率。由此，文庫構(gòu)建單兀201可以進(jìn)一步包括PCR擴(kuò)增模塊(圖中未示出)，在該P(yáng)CR擴(kuò)增模塊中設(shè)置有SUCLA2基因外顯子特異性引物，以便利用SUCLA2基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，SUCLA2基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:3_4所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，測序單元202可以包括選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種。由此，結(jié)合最新的測序技術(shù)，針對單個位點(diǎn)可以達(dá)到較高的測序深度，檢測靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高，因而能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點(diǎn)，進(jìn)一步提高對核酸樣本進(jìn)`行檢測分析的效率。從而，提高后續(xù)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時的精確性和準(zhǔn)確度。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，判斷裝置300與核酸序列確定裝置200相連，適于將核酸樣本的核酸序列進(jìn)行比對，以便基于核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1的區(qū)別判斷生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。具體地，基于核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相t匕，是否具有c.C308A突變，判斷生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。如前所述，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，具有C.C308A突變，是生物樣品易感線粒體DNA耗竭綜合征的指示。如前所述，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對核酸序列與SEQ ID NO:1進(jìn)行比對的設(shè)備并不受特別限制，可以采用任意常規(guī)的軟件進(jìn)行操作，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，可以采用SOAP軟件進(jìn)行比對。
[0042]由此，利用該系統(tǒng)，能夠有效地實(shí)施前述篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該用于篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的試劑盒包括:適于檢測SUCLA2基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，該SUCLA2基因突變體具有c.C308A突變。利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒，能夠有效地篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品。在本文中，所使用的術(shù)語“適于檢測SUCLA2基因突變體的試劑”應(yīng)做廣義理解，即可以是檢測SUCLA2編碼基因的試劑，也可以是檢測琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的試劑，例如可以采用識別特異性位點(diǎn)的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，所述試劑為核酸探針，由此，可以高效地篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品。
[0044]需要說明的是，在本文前面篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法部分中所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的系統(tǒng)或者試劑盒，在此不再贅述。
[0045]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在本文中所使用的術(shù)語“核酸序列”，實(shí)際包括互補(bǔ)雙鏈的任意一條，或者兩條。為了描述方便，在本說明書和權(quán)利要求書中，多數(shù)情況下只給出了一條鏈，但實(shí)際上也公開了與之互補(bǔ)的另一條鏈。具體地，例如，在本文中所使用的表達(dá)方式“核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有c.C308A突變是所述生物樣品易感線粒體DNA耗竭綜合征的指示”，其中所述的“核酸樣本的核酸序列”包括其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測與其互補(bǔ)的另一條鏈，反之亦然。并且，在本文中，“核酸序列”包括DNA形式或RNA形式，公開其中一種形式的序列，則意味著另一種形式的序列也被公開。例如，公開了 SUCLA2基因的cDNA序列，實(shí)際也就公開了其相應(yīng)的RNA序列。
[0046]下面參考具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0047]若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0048]實(shí)施例1全外顯子組測序確定致病基因及突變位點(diǎn)
[0049]1、樣本收集:
[0050]發(fā)明人收集到一個意大利的近親結(jié)婚家系，父母為表親結(jié)婚，父母均正常，兩個女兒患病:
[0051]第一例先癥者(PI)主要臨床表現(xiàn)為:孕期和產(chǎn)褥期皆未見異常。出生I個月出現(xiàn)肌無力，生長遲緩，體重增加較慢，頻繁嘔吐。出生8個月時，神經(jīng)系統(tǒng)檢查提示:腦神經(jīng)檢查正常、視覺檢查良好；但是近端軀干肌無力，行動遲緩、腱反射亢進(jìn)；吞咽困難，開始鼻飼。生化檢查顯示:血漿和腦脊髓液中乳酸鹽(分別是3057 μ mol/1,193 μ mol/1)和丙酮酸鹽(分別是2262μπι01/1，144μπι01/1)含量升高，短鏈脂酰肉毒堿輕度升高到20nmol/ml (正常參考值:3.4-10nmol/l)，未進(jìn)行尿液中甲基丙二尿酸的檢測。聽性誘發(fā)電位測試顯示中樞傳導(dǎo)異常。腦部MRI檢查顯示:雙側(cè)尾狀核和齒狀核影像異常(這一點(diǎn)在兩歲時做NMR檢查得到進(jìn)一步確診)。患者出生18個月時，病情持續(xù)惡化:肌張力低下，雙側(cè)上瞼下垂，眼外肌麻痹明顯，伴有嚴(yán)重的認(rèn)知障礙及語言發(fā)育障礙?；颊叨嗄甑臓I養(yǎng)攝入都依靠鼻飼，7歲時做了經(jīng)皮胃造瘺術(shù) 。雖然患者病情嚴(yán)重，但其腦電圖一直正常，并從未出現(xiàn)代謝衰竭。10歲開始，患者逐漸出現(xiàn)多重腱回縮和脊柱側(cè)凸，之后病情逐漸惡化。14歲時臨床評估顯示:患者生長指標(biāo)正常，上瞼下垂嚴(yán)重，眼外肌完全癱瘓，視覺和觸覺反應(yīng)不佳，彌漫性肌肉萎縮，軀干和四肢肌張力減退，腱反射消失，行動遲緩并表現(xiàn)出肌張力障礙姿態(tài)，脊柱側(cè)凸嚴(yán)重。患者15歲時死于肺炎引發(fā)呼吸并發(fā)癥。
[0052]先癥者7歲的妹妹(PU)出現(xiàn)完全相同的臨床癥狀:孕期及產(chǎn)褥期未見異常，出生后就表現(xiàn)出明顯的彌漫性肌張力減退。2個月出現(xiàn)軀干及四肢肌張力減退，腱反射亢進(jìn)并表現(xiàn)出肌張力障礙姿態(tài)。血漿乳酸鹽含量達(dá)到3500 μ mol/1，但尿液中的甲基丙二尿酸MMA在正常范圍。到I歲時，其體重幾乎沒有增長，并逐漸出現(xiàn)精神退化。由于反復(fù)嘔吐，患者需要通過鼻飼進(jìn)食。14個月時，大腦MRI檢查提示雙側(cè)尾狀核、豆?fàn)詈?、齒狀核異常。5歲時，其臨床癥狀與其姐姐當(dāng)時的癥狀類似:雙側(cè)上瞼下垂嚴(yán)重，不完全眼肌癱瘓，四肢麻痹、肌張力障礙，頭部不能自控，脊柱側(cè)凸，無代謝衰竭。
[0053]從患者的臨床癥狀初步判定為線粒體疾病，肌活組織檢查證實(shí)線粒體呼吸鏈多種酶缺失，主要表現(xiàn)為:PI的復(fù)合酶1、II1、IV缺失，以及PII的復(fù)合酶Cl、II1、IV、V缺失。接著取患者進(jìn)行肌肉活檢時的組織，抽取其總DNA，分離mtDNA。對整個mtDNA進(jìn)行了測序，未發(fā)現(xiàn)mtDNA基因突變，排除了 mtDNA基因突變致病。接下來采用DNA印跡和Real-TimePCR對mtDNA進(jìn)行定量分析，兩者的結(jié)果均顯示患者PI和PII的mtDNA耗竭。由此可以推斷患者所患疾病為MDS。
[0054]2、全外顯子組測序確定致病基因及突變位點(diǎn)
[0055]發(fā)明人利用Nimblegen EZ SeqCap44M Kit結(jié)合Solexa高通量測序技術(shù)對病例PII進(jìn)行了外顯子測序， 具體步驟如下:
[0056]2.1樣品制備
[0057]取患者PII皮膚成纖維細(xì)胞，利用常規(guī)酚-氯仿法抽提抽提基因組DNA，用于高通量測序。利用分光光度計(jì)測量DNA的濃度及純度，所得的每個標(biāo)本基因組DNA的0D260/0D280均位于1.7-2.0之間，濃度不少于200ng/μ 1，總量不少于30 μ g。
[0058]2.2文庫構(gòu)建及測序
[0059]利用超聲波儀(CovarisS2, Massachusetts, USA)將各基因組DNA樣本隨機(jī)打斷成200-300bp左右的片段，隨后按照制造商提供的操作說明書，在片段兩端分別連接上接頭制備文庫(可參見:http://www.1llumina.com/提供的Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫說明書,通過參照將其全文并入本文)。文庫經(jīng)純化后經(jīng)過Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的線性擴(kuò)增與 SureSelect Biotiny lated RNA Library (BAITS)進(jìn)行雜交富集,再經(jīng)過 LM-PCR 的線性擴(kuò)增，文庫檢測合格后即可上機(jī)測序，以便獲得原始測序數(shù)據(jù)。其中，參照Illumina標(biāo)準(zhǔn)的成簇和測序的protocol進(jìn)行測序,測序平臺為Illumina Hiseq2000,讀取長度為90bp,樣本的平均測序深度為71.94X。
[0060]2.3變異檢測、注釋及數(shù)據(jù)庫比較
[0061]利用Illumina basecalling Softwarel.7對上述獲得的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，經(jīng)過過濾去污染后，使用S0APaligner/S0AP2 (可參見:Li R, Li Y, KristiansenK，et al，SOAP: short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008，24 (5):713-714 ;Li R，Yu C，Li Y，ea al，S0AP2:an improved ultrafast tool forshort read alignment.Bioinformatics 2009，25 (15): 1966-1967.，通過參照將其全文并入本文)比對到參考基因組Hgl9(snpl32)，以便獲得比對到基因組上的唯一比對序列。然后利用 SOAPsnp (可參見:Li R, Li Y, Fang X，Yang H, et al, SNP detection for massivelyparallel who I e-genome resequencing.Genome Res2009, 19 (6): 1124-1132.,通過參照將其全文并入本文)確定靶區(qū)域的基因型。
[0062]結(jié)果，發(fā)明人在病例PII中發(fā)現(xiàn)有94363個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和6733處的插入 / 缺失。隨后通過 dbSNP 數(shù)據(jù)庫(http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/proiects/SNP/snpsummary, cgi ).千人因會^[據(jù)庫(www.lOOOgenomes.0rg/)、HapMap8 )? (http: //hapmap.ncb1.nlm.nih.rov/)等公共數(shù)據(jù)庫的過濾，去掉所有已知的且在數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率大于0.005的變異。去掉同義突變，將剩下的非同義/剪接位點(diǎn)突變和微小插入缺失根據(jù)以下特征進(jìn)行優(yōu)先選擇:(a)根據(jù)隱性遺傳方式和父母近親結(jié)婚關(guān)系，優(yōu)先考慮純合突變；(b)與線粒體蛋白數(shù)據(jù)庫MitoCarta進(jìn)行比較,得到可能或確定定位于線粒體的蛋白。
[0063]2.4純合子定位
[0064]發(fā)明人通過近親家系純合子定位分析的生物信息學(xué)方法，進(jìn)一步縮小了候選基因范圍，方法如下:選擇單個樣品中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)和位于公共數(shù)據(jù)庫dbSNP中的位點(diǎn)作為基因標(biāo)記。雜合標(biāo)記選取標(biāo)準(zhǔn):測序深度大于等于10X，30% -70%的reads支持率；純合標(biāo)記:測序深度大于等于5X，95%的reads支持率。通過此標(biāo)準(zhǔn)能有效降低測序錯誤的影響。基因標(biāo)記選好后，按照每500個標(biāo)記組成的窗口最多允許2個雜合標(biāo)記和相鄰標(biāo)記的距離不超過500Kb的標(biāo)準(zhǔn)，大于IM的區(qū)域定義為純合子區(qū)域(大于5M的區(qū)域認(rèn)為更可信)?？紤]到外顯子的長度和分布對分析的影響，只有相鄰?fù)怙@子連接后總長度超過IMb才進(jìn)行分析，并且相鄰?fù)怙@子的距離不超過500Kb，其余外顯子區(qū)域仍被保留為候選區(qū)域。
[0065]結(jié)果，發(fā)明人在病例PII中發(fā)現(xiàn)約399M的區(qū)域定位為純合子區(qū)域，占整個基因組的14.23%。純合子區(qū)域平均值及中位數(shù)的長度分別是1.71MB和1.33MB，最終有25個純合變異位點(diǎn)定位在純合子區(qū)域。其中有2個突變位點(diǎn)位于編碼線粒體蛋白質(zhì)的基因:T0P1MT和SUCLA2。其中，T0P1MT基因編碼線粒體拓?fù)洚悩?gòu)酶，T to C錯義突變，導(dǎo)致Ile448Met的氨基酸改變；SUCLA2基因 編碼琥珀酸輔酶A連接酶的β亞基，308C>A錯義突變，導(dǎo)致Alal03Asp的氨基酸改變。UCSC預(yù)測該位點(diǎn)位于高度保守的氨基酸殘基序列中，突變將導(dǎo)致SUCLA2蛋白的功能受到影響。
[0066]然后，發(fā)明人又通過Polyphen、SIFT、Mutpred、Pmut和Panther等軟件預(yù)測，進(jìn)一步確認(rèn)了上述2個突變基因。
[0067]由于外顯子組測序存在一定程度的假陽性，接下來，發(fā)明人又利用Sanger測序方法，對這兩個基因的突變位點(diǎn)在家系內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證，T0P1MTATA=>ATG突變在PI中是雜合突變，因此被排除。SUCLA2GCT=>GAT在PI和PII中是純合突變，而在患者父母中為雜合突變，且在 EVS 外顯子數(shù)據(jù)庫(http: //evs.gs.Washington.edu/EVS,截至 2012 年 6 月 20 日該數(shù)據(jù)庫包括2203個非裔美國人和4300個歐裔美國人的個體樣本)中未發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)。Sanger測序中，對SUCLA2基因的11個外顯子的測序覆蓋度均為100%。
[0068]此外，已知，SUCLA2 (MM:*603921)位于13號染色體，包含11個外顯子，編碼含463個氨基酸琥珀酸輔酶A連接酶的β亞基，與α亞基通過異二聚化作用形成琥珀酸輔酶A連接酶，參與三羧酸循環(huán)過程。該基因突變會導(dǎo)致線粒體DNA耗竭綜合征(MM: 612073)，伴甲基丙二酸尿的線粒體腦肌病。截止到目前，僅有25例攜帶SUCLA2基因突變的患者被報道，其中大部分來自法羅群島，4號內(nèi)含子的剪接微點(diǎn)G>A純合突變，導(dǎo)致4號外顯子被剪接掉。2005年Elpeleg等首次報道在來自穆斯林的MDS患者中發(fā)現(xiàn)SUCLA2基因的純合indel突變g.32720del43ins5。Ostergaard等2007年報道法羅群島的10名患者伴有線粒體腦肌病和MMA含量增加的癥狀，其中僅有I例患者NMR檢查出現(xiàn)基底核的異常影像。另一個來自法羅群島的大家系中，10名患者均有基底核異常影像的癥狀(18)。后來在3個意大利家系中，發(fā)現(xiàn)SUCLA2基因的突變。發(fā)明人所研究的家系中患者的癥狀與意大利家系中患者的癥狀較為相似。SUCLA2突變導(dǎo)致的典型的癥狀是尿液中MMA出現(xiàn)異常。而在發(fā)明人所研究的家系中，患者PI未進(jìn)行MMA檢測，PII曾在2個月時做過MMA檢測，結(jié)果顯示正常。這與已報道的SUCLA2突變導(dǎo)致的MMA升高不符，因此發(fā)明人重新回到臨床上去分析。由于患者PI剛好在醫(yī)院治療，因此對PI進(jìn)行了 MMA檢測，發(fā)現(xiàn)PI中MMA為11 (參考值〈5)，這就與文獻(xiàn)中報道的基本一致。
[0069]因此，綜上所述，發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明找到的SULCA2基因上的c.C308A突變是MDS
的另一致病突變位點(diǎn)。
[0070]實(shí)施例2Sanger法測序驗(yàn)證(家系內(nèi)、家系外、散發(fā)等樣本驗(yàn)證情況)
[0071]采集家系內(nèi)的患者PI (2011年取得并保存的其外周血)和PII及其父母的外周血，利用常規(guī)酚-氯仿法抽提外周血白細(xì)胞中的基因組DNA，并利用分光光度計(jì)測量DNA的濃度及純度，所得的每個標(biāo)本基因組DNA的0D260/0D280均位于1.7-2.0之間，濃度不少于200ng/ μ I，總量不少于30 μ go
[0072]然后，分別對家系內(nèi)2名 患者(PI和PII)和2名家系內(nèi)正常人(患者的父母，他們均未發(fā)病)進(jìn)行檢測，針對SUCLA2基因3號和4號外顯子之間的序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、測序的方法獲得SUCLA2基因有關(guān)序列，并根據(jù)序列測定結(jié)果屬于突變型還是野生型,驗(yàn)證SUCLA2與MDS之間的相關(guān)性。具體方法步驟如下:
[0073]1、DNA 提取:
[0074]分別采取2名患者和2名家系內(nèi)正常人的外周靜脈血，按照實(shí)施例1的方法提取基因組DNA，分光光度計(jì)測定DNA含量。
[0075]2、引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0076]參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫GRCh37/hgl9設(shè)計(jì)SUCLA2基因外顯子特異性引物，具體見下表。
[0077]a)引物序列:
[0078]
上游引物(5，~ 3’，SEQ ID NO:)|下游引物(5’ ~ 3’，SEQ ID NO:)
CATGCTGCTCCATGCTTCAT(3)CATGCTCATGACATACAAACA (4)
[0079]b)接著，按以下配比分別配置各基因組DNA樣本的PCR反應(yīng)體系:
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的編碼琥珀酸輔酶A連接酶β亞基突變體的核酸，其特征在于，與SEQ IDNO:1相比，所述核酸具有c.C308A突變， 任選地，所述核酸為DNA。
2.一種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID Ν0:2相比，所述分離的多肽具有p.Alal03Asp 突變， 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。
3.一種篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，具有C.C308A突變是所述生物樣品易感線粒體DNA耗竭綜合征的指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液、皮膚、毛發(fā)和肌肉的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進(jìn)一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進(jìn)一步包括: 針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進(jìn)行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果，任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測序文庫進(jìn)行測序， 任選地,針對所述核酸樣本,構(gòu)建核酸測序文庫進(jìn)一步包括: 利用SUCLA2基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及 針對所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測序文庫， 任選地，所述SUCLA2基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:3_4所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有c.C308A突變，判斷所述生物樣品是否易感線粒體DNA耗竭綜合征。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括: RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對所述RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括: 文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進(jìn)行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果， 任選地,所述文庫構(gòu)建單元進(jìn)一步包括: PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置有SUCLA2基因外顯子特異性引物，以便利用SUCLA2基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 任選地，所述SUCLA2基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:3_4所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種。
9.一種用于篩選易感線粒體DNA耗竭綜合征的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有: 適于檢測SUCLA2基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述SUCLA2基因突變 體具有c.C308A突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑為核酸探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571854SQ201210249131
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月18日
【發(fā)明者】方明艷, 劉軒竹, 王海榮, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請人:深圳華大基因科技有限公司