專利名稱：一種提高l-5-甲基四氫葉酸累積量的生物合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于代謝工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的生物合成方法。
背景技術(shù)：
L-5-甲基四氫葉酸又名(6S)-5-甲基四氫葉酸，化學名稱為(6S) _N_[4_[ [ (2_氨基-I，4，5，6，7，8-六氫-4-氧-5-甲基_6_喋啶基)甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸。L-5-甲基四氫葉酸是葉酸最具生物活性和功能的形式，在人生命活動中起著不可或缺的作用。普通葉酸只有轉(zhuǎn)換為L-5-甲基四氫葉酸才能參與甲基化過程及DNA合成。L-5-甲基四氫葉酸是體內(nèi)重要的甲基供體，可參與體內(nèi)多種生化反應。例如，·L-5-甲基四氫葉酸是葉酸循環(huán)中的主要形式，也是同型半胱氨酸甲基化合成蛋氨酸反應的甲基供體，如果缺乏則導致體內(nèi)同型半胱氨酸含量的升高，造成高同型半胱氨酸血癥。高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化、血栓栓塞、血管損傷的獨立致病因素，并與高血脂、腦血管疾病、腎臟疾病、糖尿病、冠狀動脈疾病、周圍血管病、類風濕關(guān)節(jié)炎、自然流產(chǎn)及阿爾茨海默癥高度相關(guān)。L-5-甲基四氫葉酸是人體血漿和細胞內(nèi)游離葉酸存在的唯一形式，也是唯一可以穿透血腦屏障的葉酸類藥物，并對阿茲海默癥有很好的防治作用。此外它還可以與抗癌藥物甲酰蝶呤等配伍使用，降低藥物的毒副作用。L-5-甲基四氫葉酸也被用于巨幼紅細胞性貧血、風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療。葉酸也在腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。一方面，葉酸受體正成為值得期待的腫瘤治療靶點，常用的載體為葉酸和葉酸類似物，葉酸類似物主要有L-5-甲基四氫葉酸、亞甲基四氫葉酸等。葉酸與葉酸類似物在其Y羧基與效應分子結(jié)合形成葉酸偶聯(lián)物的過程中，大分子物質(zhì)的生物活性不會受到破壞。另一方面，葉酸在人體中的主要功能是作為一碳單位載體參與核酸代謝，葉酸缺乏導致腫瘤發(fā)生可能有兩個機制影響核酸甲基化和破壞DNA完整性。美國、日本和歐洲已經(jīng)批準將L-5-甲基四氫葉酸上市，作為一種食品添加劑添加到各種食品中，使得其市場需求量劇增。目前，L-5-甲基四氫葉酸的生產(chǎn)主要依靠化學方法合成，但由于其自身穩(wěn)定性很差，合成工藝復雜，所以并未得到普遍工業(yè)化。在合成L-5-甲基四氫葉酸過程中會不可避免的產(chǎn)生難以拆分的光學異構(gòu)體D-5-甲基四氫葉酸，該異構(gòu)體不能被人體吸收利用，無治療保健作用。雖然目前的拆分方法已有不少報道，包括微生物拆分法、化學拆分法、高效液相色譜拆分法等，但拆分效率都不理想，收率也不高。由于化學合成對合成工藝的要求極高，使得生產(chǎn)成本也較高,因此,需要尋找一種新方法降低生產(chǎn)成本，并且得到光學純度較高的L-5-甲基四氫葉酸。微生物一般都能在常溫常壓下，利用簡單的營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖，而且代謝旺盛。目前L-5-甲基四氫葉酸的生物合成研究較少。生物體的代謝由酶促反應組成，酶促反應具有高度特異性，一種酶只能特異地產(chǎn)生唯一產(chǎn)物，而不會產(chǎn)生異構(gòu)體。因此利用生物體的代謝反應，在生物體中合成L-5-甲基四氫葉酸，可以產(chǎn)生唯一的代謝產(chǎn)物，從而解決化學方法難以達到的對光學純度要求高的難題，是未來發(fā)展的趨勢，為生物法合成L-5-甲基四氫葉酸的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒，以用于轉(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸的原始細菌株。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒的應用。 本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的方法。本發(fā)明提供的L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒包括二氫葉酸還原酶基因folA序列、亞甲基四氫葉酸還原酶基因metF和一個合適的載體片段；所述folA和metF序列分別如NCBI上Gene ID為944790和948432的序列所示。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，在L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒中，folA和metF編碼區(qū)置于T7啟動子和Iac操縱子之下。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例，所述L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒還包括一個卡那霉素抗性基因(nptll)，用以篩選重組菌。本發(fā)明提供的L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟A) PCR擴增獲得folA和metF序列；B)將folA和metF序列共同克隆入合適的表達載體。本發(fā)明提供的L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸的原始細菌株。本發(fā)明提供的提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的生物合成方法包括通過將本發(fā)明提供的L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸原始細菌株的步驟，獲得重組菌。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，通過發(fā)酵培養(yǎng)該重組菌，提高L-5-甲基四氫葉酸
累積量。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例，該重組菌為大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例，提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的生物合成方法還通過，在發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，用誘導劑誘導L-5-甲基四氫葉酸代謝途徑中的兩個關(guān)鍵酶基因-folA和metF的表達。使用本發(fā)明提供的L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸的原始細菌株，獲得的重組菌發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物中L-5-甲基四氫葉酸累積量顯著高于累積L-5-甲基四氫葉酸的原始細菌株E. coli BL21(DE3)。說明采用本發(fā)明提供的提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的方法，提高了原料利用率，降低了生產(chǎn)成本和能耗，可為進一步研究生物法合成L-5-甲基四氫葉酸建立一個基礎(chǔ)模型，為生物法合成L-5-甲基四氫葉酸的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。


圖I是PCR擴增獲得的folA的檢測結(jié)果，其中泳道I為folA。圖2是PCR擴增獲得的metF的檢測結(jié)果，其中泳道I為metF。圖3是質(zhì)粒pETfοIAmetF的三酶切凝膠電泳檢測結(jié)果，其中，5350bp左右的條帶為質(zhì)粒pET-28a(+)的DNA片段，900bp左右的條帶為基因metF的DNA片段，500bp左右的條帶為基因folA的DNA片段。圖4是質(zhì)粒pETfolAmetF的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是含pETfolAmetF、pETfolA和pETmetF質(zhì)粒的菌株的可溶性蛋白SDS-PAGE·檢測結(jié)果，其中泳道I為含pETfolAmetF質(zhì)粒的菌株，泳道2為含pETmetF質(zhì)粒的菌株，泳道3為含pETfolA質(zhì)粒的菌株，泳道4為含pET-28a(+)質(zhì)粒的空白對照菌株。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中為注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南精編版》(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2006)中所述的條件或廠商提供的方案進行。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒均購自生工生物公司。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的pMD-18TSimple Vector,Hind III,Sac I,BamH
I,Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，DNA Marker,蛋白質(zhì)Marker,均購自Takara公司。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的表達載體pET_28a (+)，菌種E. coI i BL21 (DE3)、E.coli DH5a，為中國藥科大學生化教研室保存，其中菌種E. coli BL21(DE3)的ATCC編號為 BAA-1025 。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞、E. coli DH5 a感受態(tài)細胞，購自天根生化科技有限公司。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的LB培養(yǎng)基的配方為1%胰蛋白棟，0.5%酵母浸粉，I % NaCl ;使用的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為0. 5%蔗糖，0.4%酵母浸粉，0. 1%(NH4)2SO47O. 3% K2HPO4 ;使用的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為1. 2%蔗糖，0. 5%酵母浸粉，
0.2% (NH4)2SO47O. 5% K2HPO4,0. 01% MgS04,0. 3% NaCl。配置固體 LB 平板培養(yǎng)基時，按照上述配方添加I %瓊脂粉。在本發(fā)明的下述實施例中，感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化，按照Invitrogen公司Pichia Expression Kit手冊中提供的方法進行。在本發(fā)明的下述實施例中，L-5-甲基四氫葉酸累積量的檢測參照JelenaJastrebova, Anders Grahn, Ulla Svensson, et al. HPLC determination of folates inraw and processed beetroots[J]. Food Chemistry，2003，80 :579-588.實施例I共表汰質(zhì)粒的構(gòu)建
I. I引物設(shè)計根據(jù)NCBI報道的folA和metF序列，設(shè)計以下4條引物fοIAUP GAGCTCGGGATAATGATCAGTCTGATTGCGGCfο IADOffN AAGCTTTTACCGCCGCTCCAGAATCTCAAmetFUP GGATCCATGAGCTTTTTTCACGCCAGCCAGCGmetFDOWN GAGCTCTTATAAACCAGGTCGAACCCCCA其中folAUP和fο 1AD0WN用于擴增folA編碼區(qū)；metFUP和metFDOWN用于擴增metF 編碼區(qū)；folAUP、foIADOffN, metFUP、metFDOWN 上的下劃線表示在 folAUP、foIADOffN, metFUP、metFDOWN上分別引入的Sac I酶切位點、Hind III酶切位點、BamH I酶切位點和Sac I酶切位點。I. 2 PCR 擴增 folA 和 metF 序列抽提得到大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)基因組。以大腸桿菌E.coli BL21(DE3)基因組為模板，分別以步驟I. I中設(shè)計的引物對folAUP和folADOWN以及引物對metFUP和metFDOWN為引物對，進行PCR擴增，具體如下擴增folA和 metF 的反應體系均為10 X PCR Buffer 5μ L,2mM dNTPs 2μ L,25mMMgSO4 lyL，上下游引物(10 μ Μ)各 lyL’E.coli BL21(DE3)基因組 DNA 5 μ L, Taq DNA 聚合酶0. 5 μ L，加入去離子水,至體系總體積為50 μ L0擴增folA 的反應條件94°C 5min ；94°C lmin, 50°C Imin, 72°C 5min, 25 個循環(huán)；72°C IOmin。擴增metF 的反應條件94°C 5min ；94°C lmin, 50°C 2min, 72°C 5min, 25 個循環(huán)；72°C IOmin。PCR擴增產(chǎn)物分別進行凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖I和圖2所示。根據(jù)圖I和圖2的結(jié)果，獲得的產(chǎn)物的大小分別為500bp和900bp，符合folA和metF產(chǎn)物的預期大小。I. 3表達載體的構(gòu)建I. 3. I構(gòu)建預處理使用膠回收試劑盒純化步驟I. 2中獲得的PCR產(chǎn)物，然后和pMD-18T SimpLe載體，用T4 DNA連接酶連接過夜，反應體系如下I μ L 的 PCR 產(chǎn)物，4 μ L pMD_18T SimpLe 載體，5 μ L SoLution I。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α并涂布含有20 μ g/mL氨芐青霉素的固體LB平板，37°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出。其中E.coli DH5a是無氨芐青霉素抗性菌株，不能在含有氨芐青霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉(zhuǎn)化子均為轉(zhuǎn)化了 pMDfolA或pMDmetF質(zhì)粒的大腸桿菌。挑取轉(zhuǎn)化子鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果，最終獲得兩個質(zhì)粒pMDfolA和pMDmetF。質(zhì)粒pMDfolA和pMDmetF經(jīng)測序驗證，分別包含folA、metF編碼區(qū)(folA、metF編碼區(qū)序列分別如SQ ID NO. I和SQ ID NO. 2所示)，而且編碼區(qū)無氨基酸殘基突變。I. 3. 2表達載體的構(gòu)建將I. 3. I中雙酶切產(chǎn)物folA和metF凝膠回收純化，分別與Sac I/Hind III酶切的表達載體pET-28a(+)和BamH I/Sac I酶切的表達載體pET_28a (+)連接，將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化入宿主菌E. coli DH5a，并涂布含有20μ g/mL卡那霉素的固體LB平板，37°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出。其中E.coli DH5a是無氨芐青霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉(zhuǎn)化子均為轉(zhuǎn)化了 pETfolA或pETmetF質(zhì)粒的大腸桿菌。挑取轉(zhuǎn)化子鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果，最終獲得兩個質(zhì)粒pETfolA和pETmetF。質(zhì)粒pETfolA和pETmetF經(jīng)測序驗證,分別包含folA、metF編碼區(qū)(folA、metF編碼區(qū)序列分別如SQ ID NO. I和SQ ID NO. 2所示)，其中folA、metF編碼區(qū)分別置于T7啟動子和Iac操縱子之下，而且編碼區(qū)無氨基酸殘基突變。由于T7啟動子是強轉(zhuǎn)錄和翻譯信號，因此，在合適濃度的誘導劑誘導下，這兩個質(zhì)?？梢苑謩e高水平表達folA和metF。I. 4共表達質(zhì)粒的構(gòu)建BamH I/Sac I酶切質(zhì)粒pETmetF，獲得metF表達框，然后將其連入使用BamH I/Sac I酶切的質(zhì)粒pETfolA,獲得質(zhì)粒pETfolAmetF。質(zhì)粒pETfolAmetF的三酶切鑒定提取陽性克隆的質(zhì)粒pETfolAmetF,并用Sac I/Hind III/BamH I 進行三酶切，酶切體系為Sac I 5 μ L, BamH I 5 μ L, Hind III 5yL，質(zhì)·SpETfolAmetF10yL，10XK Buffer 5yL，補水至 50yL。酶切時間為 5min，將酶切產(chǎn)物凝膠電泳，結(jié)果如圖3。根據(jù)圖3的結(jié)果，獲得的產(chǎn)物的大小分別為500bp、900bp和5350bp的DNA片段，符合folA和metF產(chǎn)物的預期大小。經(jīng)測序，并對測序結(jié)果進行分析獲得pETfolAmetF質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，結(jié)果如圖4所示。該質(zhì)粒中，folA和metF編碼區(qū)(folA、metF編碼區(qū)序列分別如SQ ID NO. I和SQ IDNO. 2所示)串聯(lián)排列在質(zhì)粒pETfolAmetF的T7啟動子和Iac操縱子之下,而且編碼區(qū)無氨基酸殘基突變。根據(jù)圖4、SDS-PAGE的檢測結(jié)果以及T7啟動子的強轉(zhuǎn)錄和翻譯信號，在合適濃度的乳糖誘導下，質(zhì)粒pETfolAmetF可以高水平共表達folA和metF。實施例2表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸細菌株將質(zhì)粒pETfolAmetF、pETfolA、pETmetF 和 pET_28a(+)分別轉(zhuǎn)化入宿主菌 E. coliBL21 (DE3)，各自命名為PAF01、PA02、PF03和P04，并涂布含有20 μ g/mL卡那霉素的固體LB平板，37°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出。其中E.coli BL21(DE3)是無卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉(zhuǎn)化子為轉(zhuǎn)化了 pETfolAmetF、pETfolA、pETmetF 和 pET_28a(+)質(zhì)粒的大腸桿菌。分別隨機挑取PAF01、PA02、PF03和P04的轉(zhuǎn)化子，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，在適當時間添加誘導劑，繼續(xù)培養(yǎng)3-8h，超聲破碎細胞，對可溶性蛋白進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖5。根據(jù)圖5的結(jié)果，PAFOU PA02和PF03分別高水平表達了 folA和metF、folA、metF，符合folA和metF產(chǎn)物的預期大?。欢鳳04既沒有大量表達folA，也沒有大量表達metF。抽提PAF01、PA02 和 PF03 的質(zhì)粒 DNA，分別使用引物 folAUP 和 folADOWN、metFUP和metFDOWN作為引物對，進行PCR反應，分別擴增獲得了長度為500bp和900bp的DNA片段、500bp的DNA片段、900bp的DNA片段、Obp的DNA片段。經(jīng)質(zhì)粒測序驗證，folA和metF表達框插入了質(zhì)粒pETfolAmetF, folA表達框插入了質(zhì)粒pETfolA,metF表達框插入了質(zhì)粒pETmetF。根據(jù)上述結(jié)果，質(zhì)粒pETfolAmetF、pETfolA和pETmetF均成功轉(zhuǎn)化入宿主菌E. coli BL21 (DE3)，分別命名為 PAFOU PA02 和 PF03。實施例3 PAF01、PA02、PF03和E.coli RL21(DE3)搖瓶發(fā)酵L_5_甲基四氫葉酸將于37°C固體 LB 平板上生長過夜的 PAFOI、PAO2、PFO3 和 E. coli BL21 (DE3)(原始菌，命名為BL21)的單菌落，分別接入液體LB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)過夜。分別取適量菌液轉(zhuǎn)接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)10h。其中，在適當時間加入誘導劑；適時添加前體葉酸O. 05g和甘油8%，并于發(fā)酵4h、6h、8h、10h取樣，檢測發(fā)酵產(chǎn)物中L-5-甲基四氫葉酸的累積量，檢測結(jié)果如表I所示。根據(jù)表I的結(jié)果，PAF01、PA02、PR)3和BL21中的L_5_甲基四氫葉酸的累積量，在發(fā)酵IOh時達到最高，分別達到原始菌的大約11倍、5倍、I. 5倍，且菌株P(guān)AFOl的累積量最大。因此，在下一實施例中，僅選取搖瓶發(fā)酵后期累積量最高的PAFOl進行發(fā)酵罐發(fā)酵。表I PAFOl、PA02、PF03和BL21中L_5_甲基四氫葉酸的累積量隨培養(yǎng)時間的變化
權(quán)利要求
1.一種L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒，其特征在于，共表達重組質(zhì)粒包括二氫葉酸還原酶基因folA序列、亞甲基四氫葉酸還原酶基因metF序列和一合適的載體片段，所述folA和metF序列分別如NCBI上Gene ID為944790和948432的序列所示。
2.如權(quán)利要求I所述的共表達重組質(zhì)粒，其特征在于，所述folA和metF序列置于T7啟動子和Iac操縱子之下。
3.如權(quán)利要求I或2所述的共表達重組質(zhì)粒，其特征在于，所述共表達重組質(zhì)粒還包括一段抗性基因片段一卡那霉素抗性基因(nptll)。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的共表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 A)PCR擴增獲得folA和metF序列； B)將folA和metF序列共同克隆到合適的表達載體。
5.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的共表達重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸的原始細菌株的應用。
6.一種提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的生物合成方法，其特征在于，所述方法為，將權(quán)力要求1-3中任一項所述的共表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸原始細菌株，獲得重組菌。
7.如權(quán)利要求5所述的應用和權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述累積L-5-甲基四氫葉酸的原始細菌株為大腸桿菌。
8.如權(quán)利要求7所述的應用和方法，其特征在于，所述大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過發(fā)酵培養(yǎng)所述重組菌，并在發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，用誘導劑誘導L-5-甲基四氫葉酸代謝途徑中的兩個關(guān)鍵酶基因folA和metF的表達，提高L-5-甲基四氫葉酸的累積量。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所用誘導劑為乳糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的生物合成方法和一種L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應用。本發(fā)明提供的L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因folA和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因metF序列。本發(fā)明提供的提高L-5-甲基四氫葉酸累積量的生物合成方法為，將L-5-甲基四氫葉酸合成酶系共表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化累積L-5-甲基四氫葉酸原始細菌株，獲得重組菌并發(fā)酵該重組菌。最終發(fā)酵產(chǎn)物中L-5-甲基四氫葉酸累積量顯著高于原始細菌株，提高了原料利用率，降低了生產(chǎn)成本和能耗，為生物法合成L-5-甲基四氫葉酸的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/70GK102776217SQ20121024556
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者劉婭梅, 卞筱泓, 許激揚, 邵飛 申請人:中國藥科大學