專利名稱：一種抗cd3/抗cd133雙特異性抗體及該雙抗裝載的cik細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種雙特異性抗體，具體講，涉及ー種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體及該雙抗裝載的CIK細(xì)胞。
背景技術(shù)：
越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸、抵抗放、化療和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起到了至關(guān)重要作用，因此治療腫瘤需要創(chuàng)建有效靶向殺滅腫瘤干細(xì)胞的新策略才有可能根治腫瘤，靶向腫瘤干細(xì)胞的免疫治療在單克隆抗體和干細(xì)胞疫苗研究方面已經(jīng)開展了積極的探索。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物非常稀少，而CD133則是目前所發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中最常見的標(biāo)志物之一，在腦瘤、白血病、黑色素瘤、腎癌、大腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌和卵巣癌等多種腫瘤干細(xì)胞中存在，它的高表達(dá)與腫瘤病人的低生存率密切相關(guān)。由此本發(fā)明選擇CD133作為針對CD133陽性腫瘤干細(xì)胞治療研究的新靶點(diǎn)，構(gòu)建了靶向⑶133靶點(diǎn)的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體。過繼免疫治療中，CIK作為新一代細(xì)胞所兼具的T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性與NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤特征，在臨床取得了很大的進(jìn)展，但是治療效果仍然有限，其原因是CIK細(xì)胞缺乏特異性靶向殺傷作用。本發(fā)明構(gòu)建了抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于提出ー種抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體；本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出裝備有該雙抗的CIK細(xì)胞。為了完成本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及ー種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體，其特征在于，所述的雙特異性抗體含有抗CD3的單克隆抗體和抗CD133的單克隆抗體。本發(fā)明中抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體的制備方法，包括以下步驟(I)將抗CD3的單克隆抗體溶解于Traut’ s試劑，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體；(2)CD133/1單克隆抗體溶于交聯(lián)劑Sulfo-SMCC，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體；(3)將步驟(I)步驟(2)得到的交聯(lián)后的單克隆抗體混合，I 4°C下作用12 18小吋。本發(fā)明還涉及ー種抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞。該抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟(I) CIK細(xì)胞的培養(yǎng)取健康外周靜脈血IOml，肝素抗凝，用生理鹽水I : I稀釋后，加至淋巴細(xì)胞分離液上層，離心收集單個核細(xì)胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2X106個/ml，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 24h，然后加入rhIL-1 a 100U/ml、鼠抗人CD3McAb50 ng/ml，rhIL-21000U/ml，每兩天添加 rhIL_21000U/ml，在培養(yǎng)第 14 天，檢查 CD3、CD4、CD8和CD56收獲CIK細(xì)胞；(2) CIK細(xì)胞表型的檢測調(diào)整培養(yǎng)0天和14天的CIK細(xì)胞濃度為5 X IO6個/ml，各取200 ill加入離心管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標(biāo)抗體及同型對照IgGl單抗各5 U 1，混勻，在4°C暗室反應(yīng)20 40min后，PBS洗滌I 3次，流式細(xì)胞儀檢測CIK細(xì)胞中CD3陽性細(xì)胞彡85%，CD3和CD8雙陽性細(xì)胞彡60%, CD3和CD56雙陽性細(xì)胞彡20% ；(3)抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載CIK細(xì)胞離心收集培養(yǎng)14天并經(jīng)表型檢測的CIK細(xì)胞，PBS洗滌I 3次，按
IX 106CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤肟耿?/抗⑶133雙特異性抗體，混勻后室溫靜置40 80分鐘，PBS洗滌I 3次。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)ー步的解釋和說明本發(fā)明提出并構(gòu)建了ー種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體；并將所構(gòu)建的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝載到CIK細(xì)胞表面，使其雙抗體與CIK細(xì)胞融為一體發(fā)揮靶向殺傷作用，篩選出高表達(dá)CD133陽性細(xì)胞的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990作為靶細(xì)胞，在體外和動物體內(nèi)對靶向治療高表達(dá)CD133人胰腺癌進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與單純CIK細(xì)胞的治療比較，抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞能夠更有效地殺傷高表達(dá)⑶133陽性的人胰腺癌細(xì)胞。本發(fā)明所制備的裝載了雙抗的CIK細(xì)胞，通過雙功能抗體的橋聯(lián)和靶向結(jié)合作用，在腫瘤局部發(fā)揮抗體和CIK細(xì)胞的雙重靶向殺傷作用，有可能消滅包括CD133陽性腫瘤干細(xì)胞在內(nèi)的全部腫瘤細(xì)胞，從而有效地解決CIK細(xì)胞免疫治療不能消滅具有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移種子-腫瘤干細(xì)胞的缺陷，本發(fā)明為高效靶向消滅腫瘤干細(xì)胞的新型免疫治療提供了新的方案，為臨床試驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。由于直接作用于腫瘤干細(xì)胞的CTL細(xì)胞治療腫瘤的方法還沒有問世，而單純CIK細(xì)胞又不能靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞，所以本發(fā)明利用單克隆抗體的靶向殺傷作用和CIK細(xì)胞所具有的非MHC限制性強(qiáng)大殺瘤活性的特性，成功構(gòu)建了抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備CIK的新型抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞，在體外和動物體內(nèi)開展了靶向治療高表達(dá)CD133胰腺癌的研究。通過用抗⑶133抗體對10種人腫瘤細(xì)胞株的⑶133抗原表達(dá)的篩查后，選擇了兩對配對腫瘤細(xì)胞株作為靶細(xì)胞ー對是高表達(dá)⑶133人胰腺癌細(xì)胞株SW1990和低表達(dá)⑶133的人胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2配對，另ー對是高表達(dá)⑶133人肝癌細(xì)胞株H印-3B和低表達(dá)⑶133人肝癌細(xì)胞株HepG2配對，通過體外殺傷試驗(yàn)的比較發(fā)現(xiàn)，在同一個效靶比濃度下，抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細(xì)胞對高表達(dá)⑶133靶細(xì)胞SW1990細(xì)胞和H印-3B細(xì)胞的殺瘤效果要明顯強(qiáng)于單純CIK細(xì)胞組，p < 0. 05。而在低表達(dá)⑶133靶細(xì)胞Capan2和H印G2細(xì)胞，抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細(xì)胞與單純CIK細(xì)胞之間殺瘤效果差異不顯著。通過用抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞治療高表達(dá)⑶133的胰腺癌細(xì)胞系SW1990制備的裸鼠皮下移植瘤，發(fā)現(xiàn)抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞比單純CIK具有更強(qiáng)的抑制腫瘤生長的作用，p〈0. 05。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CIK細(xì)胞在裝備了抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體之后，CIK細(xì)胞不僅發(fā)揮廣譜直接殺傷腫瘤細(xì)胞的治療作用，而且利用雙功能抗體的橋聯(lián)作用將效應(yīng)細(xì)胞和高表達(dá)CD133的腫瘤靶細(xì)胞有機(jī)的結(jié)合到一起，形成殺傷組合體，發(fā)揮了抗體靶向打擊消滅CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞的作用。雙抗體不僅將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍，而且可以模擬天然配體的作用，與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合，激活效應(yīng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向性的殺傷，由于抗體對抗原的識別不需要抗原提呈及MHC的表達(dá)，因此CIK裝備特異性雙抗的治療方案不但能夠有效地解決腫瘤干細(xì)胞對宿主免疫監(jiān)視逃逸和耐藥性等影響療效的關(guān)鍵難題，而且能夠修補(bǔ)CIK細(xì)胞免疫治療不能消滅具有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的種子ー腫瘤干細(xì)胞的缺陷。本發(fā)明的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞不僅可以靶向治療高表達(dá)⑶133胰腺癌，還可以有效抑制高表達(dá)⑶133的H印3B肝癌細(xì)胞，該結(jié)果與應(yīng)用⑶133單抗結(jié)合細(xì)胞毒藥物monomethyl auristatin F (MMAF)有效殺傷高表達(dá)⑶133Hep3B肝癌細(xì) 胞和KATO-III胃癌細(xì)胞的結(jié)果相一致。由此可知抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞不僅能夠打擊⑶133高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞，而且有可能對各種腫瘤中的表達(dá)⑶133的干細(xì)胞細(xì)胞亞群進(jìn)行有效抑制。發(fā)明人對加入雙抗裝備CIK或單純CIK共同培養(yǎng)前后的高表達(dá)⑶133胰腺癌細(xì)胞系SW1990的基因芯片表達(dá)譜進(jìn)行分析。通過熒光定量PCR證實(shí)雙抗裝備的CIK細(xì)胞能夠使SW1990癌細(xì)胞中的S100P基因明顯下調(diào)和STATl顯著上調(diào)。結(jié)果表明這些基因表達(dá)的改變與雙抗裝備CIK細(xì)胞的增效作用密切相關(guān)。本發(fā)明的雙抗裝備CIK細(xì)胞，在作用高表達(dá)⑶133胰腺癌細(xì)胞SW199024小時后，該細(xì)胞中S100P基因表達(dá)明顯下調(diào)，是未處理親本腫瘤細(xì)胞的0. 26倍，單純CIK組的0. 18倍(p〈0. 01)。由于該基因下調(diào)在單純CIK細(xì)胞與裝備了雙抗CIK的細(xì)胞之間差異顯著，因此抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的靶向殺傷作用與胰腺癌細(xì)胞中S100P基因水平顯著下調(diào)密切相關(guān)。S100P基因是調(diào)控細(xì)胞増殖周期的基因，近年來關(guān)于S100P在腫瘤組織中的異常表達(dá)受到重視，S100P在多種腫瘤組織中均有明顯的高表達(dá)水平，如胰腺癌、肺腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巣癌、宮頸癌等，并且與部分腫瘤的分期、預(yù)后、治療等有一定的相關(guān)性。S100P在大約90%的胰腺腫瘤中均有表達(dá)，通過SiRNA敲除胰腺癌中S100P的表達(dá)之后，論證了 S100P在體外有著促進(jìn)腫瘤生長、延緩腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤遷移及侵襲的作用。用轉(zhuǎn)染了 S100P基因的胰腺癌細(xì)胞接種裸鼠，腫瘤生長5倍大于對照組；而敲除了S100P基因的腫瘤細(xì)胞接種裸鼠后，腫瘤體積不僅明顯小于對照組，而且出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率也明顯減少。這些研究證明了 S100P與腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本發(fā)明證明靶向CD133陽性胰腺癌細(xì)胞的雙抗聯(lián)合CIK免疫靶向治療作用機(jī)理直接涉及到了與促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長、延緩凋亡、促進(jìn)遷移及侵襲的關(guān)鍵基因S100P的分子機(jī)制，胰腺癌靶細(xì)胞中該基因的顯著下調(diào)與該方案抗腫瘤效果直接關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)，伴有IFN- y的分泌量増加，以雙抗裝備CIK組數(shù)值最高，三組間比較差異顯著。免疫效應(yīng)細(xì)胞通過分泌干擾素能夠在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)雙抗裝備CIK細(xì)胞不但對高表達(dá)CD133的胰腺癌和肝癌細(xì)胞有更強(qiáng)大的靶向殺傷作用，同時，當(dāng)BsAb-CIK效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤靶細(xì)胞相互作用吋，免疫效應(yīng)細(xì)胞能夠分泌更多的IFN- y，從而實(shí)現(xiàn)了 BsAb-CIK免疫細(xì)胞強(qiáng)力打擊腫瘤靶細(xì)胞的殺傷作用。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)經(jīng)BsAb-CIK效應(yīng)細(xì)胞作用的腫瘤靶細(xì)胞自身的STATl基因表達(dá)顯著上調(diào)，經(jīng)基因表達(dá)譜芯片分析和熒光定量PCR檢測證實(shí)，胰腺癌細(xì)胞經(jīng)單純CIK處理后，STATl基因表達(dá)顯著上調(diào)為11. 91倍，而雙特異性抗體裝備的CIK作用后的腫瘤細(xì)胞STATl基因表達(dá)顯著上調(diào)為17. 11倍，兩治療組差異顯著，p〈0. 05。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STATs是ー個轉(zhuǎn)錄因子家族，是對細(xì)胞增殖、存活和分化所必須的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子的受體信號。STATl在細(xì)胞內(nèi)能夠有效地阻止乳腺上皮的増殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對不同小鼠移植模型的研究驗(yàn)證，無論是在ErbB2/HER2陽性或陰性小鼠模型和STATl-/-小鼠中都證實(shí)了 STATl具有抑制小鼠體內(nèi)腫瘤形成的作用，而且在floxed statl等位基因的小鼠進(jìn)ー步證實(shí)了 STATl抑制腫瘤形成的作用是通過細(xì)胞自治實(shí)現(xiàn)的。因此目前認(rèn)為STATl是ー個通用型的腫瘤抑制基因或抗癌基因。研究發(fā)現(xiàn)喪失STATl的腫瘤細(xì)胞會失去對干擾素 介導(dǎo)的生長抑制反應(yīng)，而且可能導(dǎo)致MHC表達(dá)下調(diào)，從而逃避CTL介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者細(xì)胞內(nèi)STATl激活的低水平與預(yù)后較差關(guān)系密切。而我們的發(fā)明證實(shí)了在BsAb-CIK的靶向殺傷作用是與腫瘤靶細(xì)胞自身STATl基因表達(dá)顯著上調(diào)是一致的。本發(fā)明從免疫細(xì)胞治療學(xué)的角度首次證實(shí)了 anti-⑶3/anti_CD133BsAb裝備CIK細(xì)胞強(qiáng)大靶向殺傷作用與CD133高表達(dá)胰腺癌靶細(xì)胞自身所發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化基因S100P基因明顯下調(diào)和statl抗癌基因的顯著上調(diào)的作用機(jī)制密切相關(guān)，從而使該治療得到更好的靶向治療效果。該方法不但適用于⑶133高表達(dá)的胰腺癌,而且也可能對其它高表達(dá)⑶133的腫瘤靶細(xì)胞具有療效，而且免疫效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-Y細(xì)胞因子水平和腫瘤靶細(xì)胞內(nèi)抗癌基因statl和S100P基因變化規(guī)律也可能作為監(jiān)測該項(xiàng)免疫細(xì)胞治療的有效指標(biāo)，值得進(jìn)ー步深入研究。本發(fā)明研究表明通過Anti-⑶133xAnti_⑶3BsAb裝備的CIK細(xì)胞能夠在體內(nèi)外有效的靶向殺傷高表達(dá)CD133的腫瘤細(xì)胞，為創(chuàng)建高效靶向消滅CD133陽性腫瘤干細(xì)胞的新型免疫治療策略與方案提供了重要科學(xué)論據(jù)，為深入探討增效殺瘤作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。綜上，本發(fā)明的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞可應(yīng)用于制備治療靶向殺傷高表達(dá)CD133的癌細(xì)胞的制劑，還可應(yīng)用于制備治療靶向殺傷高表達(dá)CD133的腫瘤干細(xì)胞的制劑，還可應(yīng)用制備抑制腫瘤生長的制劑。本發(fā)明的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞還可降低癌細(xì)胞中的S100P基因表達(dá)，増加癌細(xì)胞中的STATl基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用，癌細(xì)胞包括胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、卵巣癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞。


圖I為抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體產(chǎn)物8%非還原變性SDS-聚丙烯胺凝膠電泳圖；圖2為FACS檢測CIK細(xì)胞表型結(jié)果圖，培養(yǎng)第I天；圖3為FACS檢測CIK細(xì)胞表型結(jié)果圖，培養(yǎng)第14天；圖4為抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備CIK細(xì)胞熒光顯微鏡檢測結(jié)果；圖5為正常人的雙抗裝備的CIK細(xì)胞對SW1990細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6為腫瘤病人的雙抗裝備的CIK細(xì)胞對SW1990細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖7為正常人的雙抗裝備的CIK細(xì)胞對Capan-2殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖8為正常人的雙抗裝備的CIK細(xì)胞對H印3B殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖9為正常人的雙抗裝備的CIK細(xì)胞對HepG2殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖10細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-gamma分泌的結(jié)果圖；圖11為裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；圖12為雙抗裝備的CIK細(xì)胞治療對基因的熒光定量RT-PCR分析的結(jié)果圖，左圖為S100P、右圖為STATl0本發(fā)明的具體實(shí)施方式
僅限于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一歩的解釋和說明，并不對本發(fā)明 的內(nèi)容構(gòu)成限制。
具體實(shí)施例方式主要試劑及儀器RPMI1640 購自 GIBCO 公司(Grand Island, NY)；胎牛血清購單克隆抗體購于Ortho Biotech公司，Tokyo, Japan鼠抗人CD133/1 (AC133)單克隆抗體購于 Miltenyi Biotech 公司,Bergisch Gladbach, Germany ；鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標(biāo)抗體及同型對照IgGl購自BDpharmingen 公 ロ]；鼠抗人⑶133-PE抗體購自Miltenyi Biotec公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CellCounting Kit-8, CCK-8)購于 D0JIND0，WSTe 公司；人IFN- y ELISA 試劑盒購自 R & D pharmingen ；流式細(xì)胞儀購自R & D pharmingen o實(shí)施例I :雙特異性抗體的制備I.取鼠抗人⑶3單克隆抗體0KT3抗體(Img)溶于5倍摩爾濃度的交聯(lián)劑Traut’s試劑(2-iminothiolane HCl;Pierce, Rockford, IL) 500 u I,室溫下作用 I 小時；用 PD-10柱(Pharmacia, Uppsala, Sweden)過濾,移除未交聯(lián)的單克隆抗體，2.取鼠抗人⑶133/1單克隆抗體(Img)溶于4倍摩爾濃度的交聯(lián)劑Sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl4_(N_ma丄eimidomethyl)cyclohexane—l—carboxylate) 500 U I,至溫下作用I小時后，用F1D-IO柱(Pharmacia, Uppsala, Sweden)過濾,移除未交聯(lián)的單克隆抗體；3.將已交聯(lián)的0KT3和鼠抗人⑶133/1單抗混合后4°C過夜，制備得到抗⑶3/抗CD 133雙特異性抗體?？耿?/抗⑶133雙抗體蛋白產(chǎn)物通過8%非還原、變性SDS-聚丙烯胺凝膠電泳圖，考馬斯亮藍(lán)染色檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖I所示；其中第I電泳帶為蛋白marker，2為IOug的0KT3單克隆抗體，3為IOug的⑶133/1單克隆抗體，4為30ug的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體。通過蛋白電泳檢測，證實(shí)抗⑶3/抗⑶133兩種抗體交聯(lián)的雙體蛋白條帶為300KD，而單體為150KD。蛋白定量用BCA(Pierce)試劑盒,按說明書要求操作,檢測雙抗的蛋白含量。
實(shí)施例2 :抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細(xì)胞I. CIK細(xì)胞的培養(yǎng)取健康志愿者外周靜脈血10ml，肝素抗凝，用生理鹽水I : I稀釋后，加至淋巴細(xì)胞分離液上層，離心收集單個核細(xì)胞(PBMC)，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2 X IO5個/ml，并加入IFN- y終濃度為1，000單位/mL，置于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入rhIL-1 a終濃度為1000U/ml、鼠抗人CD3McAb終濃度為50ng/ml，rhIL_2終濃度為1000U/ml，每2d加液補(bǔ)充rhIL-2，在培養(yǎng)第14天，流式細(xì)胞儀檢查培養(yǎng)細(xì)胞⑶3、⑶4、⑶8和⑶56表型，收獲CIK細(xì)胞。2. CIK細(xì)胞表型的檢測

將培養(yǎng)I天和14天的CIK細(xì)胞調(diào)整濃度為5 X IO6個/ml，各取200 U I加入Falcon管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標(biāo)抗體及同型對照IgGl單抗各5 yl，混勻，在4°C暗室反應(yīng)30min后，PBS洗滌2次，上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖
2、圖3所示。3.特異性抗體抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細(xì)胞離心收集培養(yǎng)14天并經(jīng)表型檢測的CIK細(xì)胞，PBS洗滌兩次，按IX 106CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤雽?shí)施例I制備的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體，混勻后室溫靜置60分鐘，PBS洗滌CIK細(xì)胞沒有結(jié)合上的游離抗體，離心后經(jīng)熒光顯微鏡檢測雙特異性抗體裝載CIK細(xì)胞的狀態(tài)。4.熒光顯微鏡檢測熒光抗體標(biāo)記的雙抗裝備CIK細(xì)胞雙標(biāo)記法將抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞PBS洗滌離心后加入抗小鼠FITC-IgG2a單克隆抗體(抗小鼠IgG2a單抗針對Anti_CD3單抗，)和抗小鼠PE-IgGl單克隆抗體(抗小鼠IgGl單抗，針對Anti-⑶133單抗)4°C避光孵育30分鐘后，PBS洗滌兩次，熒光顯微鏡下檢查細(xì)胞熒光顏色。同時采用I X IO6CIK細(xì)胞做對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在圖B中，⑶133抗體在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光；在圖C中，CD3抗體在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光；在圖D中，雙抗裝載的細(xì)胞紅綠顏色重合在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)橙色熒光。實(shí)施例3 :檢測雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞對SW1990的細(xì)胞毒作用以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以人胰腺癌細(xì)胞系SW1990作為靶細(xì)胞，檢測對比抗⑶3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞的殺傷作用。分別取10份正常人和10份腫瘤病人的外周靜脈血制備CIK細(xì)胞，并且將每一例CIK細(xì)胞裝載抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體，分別對比檢測CIK細(xì)胞和裝載了抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體的CIK細(xì)胞對SW1990細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟為取對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，5000個細(xì)胞/孔鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，第二天分別加入CIK細(xì)胞、實(shí)施例2制備的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞，50ng/l X IO6CIK細(xì)胞，以效靶比2: I、10:1和50:1的濃度共同培養(yǎng)72h,每個濃度3個平行孔；棄上清液，PBS漂洗細(xì)胞兩次后，加入Cell counting Kit CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒中應(yīng)用液繼續(xù)培養(yǎng)4小吋，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入酶聯(lián)儀檢測在450nm處吸光度OD值，按公式計(jì)算細(xì)胞殺傷率殺傷率(%) = [!-(實(shí)驗(yàn)組OD值)/CIK對照OD值+靶細(xì)胞對照OD值]X 100%。
實(shí)驗(yàn)同時設(shè)單純CIK細(xì)胞對照組、靶細(xì)胞對照組和空白組。細(xì)胞毒作用的檢測對各實(shí)驗(yàn)組采用t檢驗(yàn)，以P〈0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常人的CIK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5所示。病人的的CIK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在2: I、10 :1和50 1的不同效靶比條件下，在同一個效靶比濃度下，抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞對胰腺癌靶細(xì)胞的殺傷作用均大于單純CIK 組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明無論是正常人的還是病人的CIK，經(jīng)過雙抗裝備的CIK細(xì)胞對高表達(dá)⑶133的胰腺癌細(xì)胞系SW1990的殺傷作用對明顯大于單純CIK組，p〈0. 05。CIK細(xì)胞和雙抗裝備的CIK細(xì)胞，殺傷靶細(xì)胞的作用與效應(yīng)細(xì)胞的濃度呈正相關(guān)，濃度越大，殺瘤 作用越強(qiáng)。實(shí)施例4 :檢測雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞對人胰腺癌細(xì)胞系Capan-2的細(xì)胞
毒作用以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以低表達(dá)⑶133的人胰腺癌細(xì)胞系Capan-2作為靶細(xì)胞，檢測對比裝備了抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的CIK細(xì)胞的殺傷作用。以正常人外周靜脈血制備的CIK細(xì)胞分別對Capan-2殺傷實(shí)驗(yàn)做了 10人次實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3 :實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在2 :I、10 :1和50 1的不同效靶比條件下，在同一個效靶比濃度下，雙抗裝備的CIK對低表達(dá)D133的胰腺癌細(xì)胞系Capan2細(xì)胞殺傷作用均大于單純CIK組，但是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組的殺傷作用差異不顯著，P>0. 05。實(shí)驗(yàn)例5 :檢測雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞對人肝癌細(xì)胞系Ifep3B和H印G2的細(xì)胞毒作用以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以人肝癌細(xì)胞系H印3B和H印G2作為靶細(xì)胞，檢測對比抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞的殺傷作用。以正常人外周靜脈血制備的CIK細(xì)胞分別對Ifep3B和IfepG2殺傷實(shí)驗(yàn)做了 20人次實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3 :實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8、9所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是在2: I、10 :1和50 1的不同效靶比條件下，在同一個效靶比濃度下，雙抗裝備的CIK細(xì)胞對肝癌系靶細(xì)胞的殺傷作用均大于單純CIK組。經(jīng)過抗⑶3/抗CD 133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞對高表達(dá)CD133肝癌細(xì)胞系Hep3B具有更強(qiáng)的殺傷作用，與單純CIK細(xì)胞相比有顯著差異，p〈0. 05，而對低表達(dá)⑶133肝癌細(xì)胞系H印G2的殺傷作用差異不顯著，p>0. 05。CIK細(xì)胞和裝備了抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體的CIK細(xì)胞，其殺傷靶細(xì)胞的作用與效應(yīng)細(xì)胞的濃度呈正相關(guān)，濃度大，殺瘤作用越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)例6 :細(xì)胞因子檢測取對數(shù)生長期人胰腺癌細(xì)胞系SW1990以5000個細(xì)胞/孔鋪96孔，第二天加入CIK細(xì)胞或抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK，以效靶比2:1、10:1和50:1的濃度共同培養(yǎng) 72 小時，收集上清液,用 ELISA Kit Human IFN- y (R & D pharmingen (San Diege,U. S. A))檢測細(xì)胞IFN- y分泌水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。
雙抗裝備的CIK細(xì)胞與四種不同的靶細(xì)胞共同培養(yǎng)72小時后，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液，均伴有Y -干擾素分泌水平明顯增高，與單純CIK組比較差異顯著，p〈0. 05。同時還檢測了 TNF-a、IL-12、IL_4、IL-10和TGF-B的分泌水平，但是各組間與對照組無明顯差異，無可見陽性試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與INF-Y分泌水平密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)例7 :雙抗裝備的CIK細(xì)胞治療裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)取8周齡雌裸鼠33只，每只裸鼠右腋下皮下注射2X IO6人胰腺癌細(xì)胞系SW1990細(xì)胞，10天后腫瘤長到0. 3cm大小，隨機(jī)分成3組對照組，單純CIK組和抗⑶3/抗⑶133裝備的CIK組，單純CIK組腹腔內(nèi)注射CIK細(xì)胞I X IO7次/周，每周2次；雙抗裝備CIK組腹腔內(nèi)注射BsAb+CIKl X IO7次/周，每周2次；對照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水200ul次/周， 每周2次。40天處死小鼠，統(tǒng)計(jì)各組瘤重平均值與SD為對照組0. 4592±0. 046克，CIK組
0.2683±0. 0733，雙抗裝備組0. 1197±0. 074，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，與單純CIK治療組比較，經(jīng)雙抗裝備的CIK細(xì)胞對小鼠高表達(dá)⑶133SW1990細(xì)胞皮下移植瘤的生長抑制作用更加顯著，對照組與CIK組比較p=0. 01，對照組與雙抗裝備的CIK細(xì)胞組比較p=0. 003，CIK組與雙抗裝備的CIK細(xì)胞組p=0. 013。統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖11所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，裝備有雙抗的CIK細(xì)胞對腫瘤的生長期到非常明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)例8 熒光定量RT-PCR人胰腺癌細(xì)胞系SW1990以2X106個細(xì)胞種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，第二天分別加入
2X IO7CIK細(xì)胞或抗⑶3/抗⑶133裝備的CIK (效靶比濃度10 :1)，留ー瓶未處理的腫瘤細(xì)胞做空白對照，共同培養(yǎng)24小時，棄上清液，PBS漂洗細(xì)胞兩次，加入TRIZOLlml，收集細(xì)胞裂解液，用總RNA試劑盒提取總RNA，以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用ABI-Prism7000Sequence Detector system 做突光定量 PCR 檢測；合成引物序列S100P 上游引物SEQ ID NO: 1GCAGCACGCAGACCCTGACCAA ；S100P 下游引物SEQ ID NO: 2GCAGCCACGAACACGATGAAC ；STATl 上游引物SEQ ID NO:3GTTAGGCTATTCACAACCACTC ；STATl 下游引物SEQ ID NO: 4ACTTCACGAAACATCATCCAC ；P -actin 上游引物SEQ ID NO: 5AGCGAGCATCCCCCAAAGTT ；P -actin 下游引物SEQ ID NO: 6GGGCACGAAGGCTCATCATT ；上述引物序列由百維信生物invitrogen公司合成。反應(yīng)體系10XBufferlul，dNTP (IOmM) 0. 25ul，primer2ul，Taq 酶 0. Iul，SYBRGreen 10. 5ul,模板 cDNAlul, ddH205. 15ul,總體積 IOul。反應(yīng)程序預(yù)變性95°C 2mi,30個循環(huán)變性94°C，lOsec，退火55°C，IOsec延伸72°C，30sec。數(shù)據(jù)處理計(jì)算Folds=2-AA ct, AA Ct= (Ctl-Ct2) - (Ct3_Ct4)，Ctl :處通樣品待測基因的；Ct2 :處通樣品看豕基因的；Ct3 :對照樣品待測基因的；Ct4 :對照樣品。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS11. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析和t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a =0. 05，以？ < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析結(jié)果 如圖12所示(*p< 0. 05，#p < 0. 01)，其中，左圖為 S100P、右圖為 STATl0
權(quán)利要求
1.一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體，其特征在于，所述的雙特異性抗體含有抗CD3的單克隆抗體和抗CD133的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將抗⑶3的單克隆抗體Img溶解于Traut's試劑，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體； (2)CD133/1單克隆抗體Img溶于交聯(lián)劑Sulfo-SMCC，15 25°C下作用I 2小時；用F1D-IO柱過濾,除去未交聯(lián)的單克隆抗體； (3)將步驟(I)步驟(2)得到的交聯(lián)后的單克隆抗體混合，I 4°C下作用12 18小時。
3.—種權(quán)利要求I所述的抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)CIK細(xì)胞的培養(yǎng) 取健康外周靜脈血10ml，肝素抗凝，用生理鹽水I :1稀釋后，加至淋巴細(xì)胞分離液上層，離心收集單個核細(xì)胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2X106個/ml，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 24h，然后加入rhIL-1 a 100U/ml、鼠抗人CD3McAb 50ng/ml,rhIL-2 1000U/ml，每兩天添加 rhIL-2 1000U/ml，在培養(yǎng)第 14 天，檢查 CD3、CD4、CD8和⑶56，收獲CIK細(xì)胞； (2)CIK細(xì)胞表型的檢測 調(diào)整培養(yǎng)O天和14天的CIK細(xì)胞濃度為5 X IO6個/ml，各取200 μ I加入離心管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標(biāo)抗體及同型對照IgGl單抗各5 μ 1，混勻，在4°C暗室反應(yīng)20 40min后，PBS洗滌I 3次，流式細(xì)胞儀檢測CIK細(xì)胞中⑶3陽性細(xì)胞彡85%，CD3和CD8雙陽性細(xì)胞彡60%, CD3和CD56雙陽性細(xì)胞彡20% ； (3)抗⑶3/抗⑶133雙特異性抗體裝備CIK細(xì)胞 離心收集培養(yǎng)14天并經(jīng)表型檢測的CIK細(xì)胞，PBS洗滌I 3次，按IX 106CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤肟耿?/抗⑶133雙特異性抗體，混勻后室溫靜置40 80分鐘，PBS洗滌I 3次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙特異性抗體，具體講，涉及一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體及該雙抗裝備的CIK細(xì)胞，及其制備方法。本發(fā)明的雙特異性抗體含有抗CD3的單克隆抗體和抗CD133的單克隆抗體。本發(fā)明的該雙抗裝備的CIK細(xì)胞可靶向殺傷高表達(dá)CD133的癌細(xì)胞，并具有很強(qiáng)的抑制腫瘤生長的作用。
文檔編號C12N5/0783GK102775494SQ20121023852
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者黃建華 申請人:黃建華