專利名稱：鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法。
背景技術(shù)：
中國鵝多數(shù)為白羽中型鵝品種，素以體型大、早期生長(zhǎng)發(fā)育快，抗病力強(qiáng)，耐粗飼、耗料少，肉質(zhì)好等特點(diǎn)，尤其產(chǎn)絨量高，羽絨品質(zhì)好而享譽(yù)國內(nèi)外。中國鵝為季節(jié)性產(chǎn)蛋，但就巢性極強(qiáng)，導(dǎo)致其產(chǎn)蛋量低下。采用產(chǎn)蛋量高的品種作為母本開展雜交，從其綜合生產(chǎn)性能表現(xiàn)來看不能滿足當(dāng)?shù)厣a(chǎn)和市場(chǎng)對(duì)產(chǎn)品的需要，而且還沖淡了地方鵝品種原有的優(yōu)良品質(zhì)，影響了養(yǎng)鵝的經(jīng)濟(jì)效益。因此消除就巢性是提高地方鵝種繁殖性能最有效的方式。
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研究表明，家禽就巢性的發(fā)生是體內(nèi)多種激素或因子共同作用的結(jié)果，這種作用發(fā)生在下丘腦-垂體-性腺軸的各個(gè)水平上。目前比較一致的觀點(diǎn)是禽類的就巢行為是由產(chǎn)蛋過程中卵巢產(chǎn)生的雌激素等作用于下丘腦，促進(jìn)下丘腦分泌血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)等遞質(zhì),促進(jìn)垂體分泌催乳素(Prolactin, PRL)所致。在此過程中，PRL是促發(fā)就巢的最直接的激素。PRL是動(dòng)物垂體前葉分泌的一種激素，禽類的就巢性與血漿PRL水平變化有關(guān)。血漿PRL濃度上升到一定的程度可引發(fā)就巢。就巢開始后，就巢行為本身又促進(jìn)PRL的分泌，高PRL水平進(jìn)而繼續(xù)維持就巢行為；產(chǎn)蛋期火雞注射PRL能使其迅速發(fā)生就巢行為；人為終止火雞的就巢行為將導(dǎo)致血漿PRL水平急劇下降；對(duì)矮腳雞促PRL釋放因子一VIP的被動(dòng)免疫可降低就巢發(fā)生率。說明PRL在血漿中的濃度變化是禽類就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵因素。因此，可通過外源注射PRL的主動(dòng)免疫方法，以提高地方鵝種就巢期PRL的抗體水平，中斷鵝的就巢行為，達(dá)到提高產(chǎn)蛋性能的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，降低鵝的就巢間隔，并提高其產(chǎn)蛋量。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。一種鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，步驟包括(I)通過RT-PCR，從鵝下丘腦和垂體組織總RNA抽提物中擴(kuò)增出全長(zhǎng)PRL靶序列，并插入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)；(2)再插入PMD19-T載體，與pET32a雙酶切并連接，轉(zhuǎn)化DH5a ；(3)使用IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，以分泌型表達(dá)；(4)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌珠經(jīng)高壓超聲破碎，離后上清溶液過Ni-親和層析柱，純化產(chǎn)物透析后凍干濃縮，得到融合催乳素表達(dá)蛋白，經(jīng)蛋白定量后，將濃縮蛋白分別稀釋至I 4mg/ml ；(5)將融合催乳素表達(dá)蛋白與佛氏完全佐劑以I:O. Cl. 2的質(zhì)量比混合；(6)將混合物對(duì)鵝頸部皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為I. 5^2. 5ml。
進(jìn)一步地，上述步驟(3)中，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)后所表達(dá)蛋白產(chǎn)物濃度在30(T350mg/L。進(jìn)一步地，上述步驟(5)中，融合催乳素表達(dá)蛋白與佛氏完全佐劑以1:1的質(zhì)量比混合。進(jìn)一步地,上述步驟(6)中，注射劑量為2ml。進(jìn)一步地，上述鵝選取皖西白鵝。本發(fā)明的有益效果將重組表達(dá)的融合催乳素蛋白應(yīng)用于鵝主動(dòng)免疫，通過調(diào)控體內(nèi)激素水平提高鵝的繁殖性能，不僅可解決常規(guī)選育難以剔除就巢性狀的難題，同時(shí)，也可避免人為注射性激素類物質(zhì)所導(dǎo)致的藥物殘留等問題。
具體實(shí)施例方式下面根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。一種鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，步驟包括(I)通過RT-PCR，從鵝下丘腦和垂體組織總RNA抽提物中擴(kuò)增出全長(zhǎng)PRL靶序列，并插入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)；(2)再插入PMD19-T載體，與pET32a雙酶切并連接，轉(zhuǎn)化DH5a ；(3)使用IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，以分泌型表達(dá)，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)后所表達(dá)蛋白產(chǎn)物濃度在300 350mg/L ；(4)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌珠經(jīng)高壓超聲破碎，離后上清溶液過Ni-親和層析柱，純化產(chǎn)物透析后凍干濃縮，得到融合催乳素表達(dá)蛋白，經(jīng)蛋白定量后，將濃縮蛋白分別稀釋至I 4mg/ml ；(5)將融合催乳素表達(dá)蛋白與佛氏完全佐劑以1:0. 8^1. 2的質(zhì)量比混合，優(yōu)選1:1的質(zhì)量比；(6)將混合物對(duì)鵝頸部皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為I. 5^2. 5ml，優(yōu)選2ml。在本實(shí)施案例中，鵝選取皖西白鵝作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。選擇就巢期皖西白鵝80只，分成4組，組I注射lmg/ml融合催乳素蛋白，組2注射2mg/ml融合催乳素蛋白，組3注射4mg/ml融合催乳素蛋白，組4注射同體積的生理鹽水。10天后融合催乳素蛋白與佛氏不完全佐劑混合完全，繼續(xù)以相應(yīng)劑量注射各組鵝群。二次加強(qiáng)免疫后統(tǒng)計(jì)各組鵝群產(chǎn)蛋和就巢情況，其結(jié)果如下a、觀察到組I就巢鵝占18. 78%，產(chǎn)蛋鵝占35. 53% ;組2就巢鵝點(diǎn)23. 5%，產(chǎn)蛋鵝占41. 5% ;組3就巢鵝占20. 56%，36. 11% ;對(duì)照組4就巢鵝點(diǎn)43. 5%，產(chǎn)蛋鵝占25. 5% (表I)。b、二次加強(qiáng)免疫后10天內(nèi)組I產(chǎn)蛋量為70枚，組2產(chǎn)蛋量為83枚，組3產(chǎn)蛋量為65枚，對(duì)照組4產(chǎn)蛋量為51枚；二次加強(qiáng)免疫后25天內(nèi)組I產(chǎn)蛋量為115枚，組2產(chǎn)蛋量為126枚，組3產(chǎn)蛋量為105枚，對(duì)照組4產(chǎn)蛋量為63枚(表I)。表I皖西白鵝主動(dòng)免疫產(chǎn)蛋情況比較
權(quán)利要求
1.一種鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，其特征在于，步驟包括 (1)通過RT-PCR，從鵝下丘腦和垂體組織總RNA抽提物中擴(kuò)增出全長(zhǎng)PRL靶序列，并插入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)； (2)再插入PMD19-T載體，與pET32a雙酶切并連接，轉(zhuǎn)化DH5a； (3)使用IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，以分泌型表達(dá)； (4)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌珠經(jīng)高壓超聲破碎，離后上清溶液過Ni-親和層析柱，純化產(chǎn)物透析后凍干濃縮，得到融合催乳素表達(dá)蛋白，經(jīng)蛋白定量后，將濃縮蛋白分別稀釋至Ilmg/ml ； (5)將融合催乳素表達(dá)蛋白與佛氏完全佐劑以1:0.Cl. 2的質(zhì)量比混合； (6)將混合物對(duì)鵝頸部皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為I.5^2. 5ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，其特征在于，所述步驟(3)中，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)后所表達(dá)蛋白產(chǎn)物濃度在30(T350mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，其特征在于，所述步驟(5)中，融合催乳素表達(dá)蛋白與佛氏完全佐劑以1:1的質(zhì)量比混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，其特征在于，所述步驟(6)中，注射劑量為2ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，其特征在于，所述鵝選取皖西白鵝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鵝產(chǎn)蛋的融合催乳素蛋白主動(dòng)免疫調(diào)控方法，簡(jiǎn)略步驟包括提取、酶切、誘導(dǎo)、純化、濃縮、混合、注射。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將重組表達(dá)的融合催乳素蛋白應(yīng)用于鵝主動(dòng)免疫，通過調(diào)控體內(nèi)激素水平提高鵝的繁殖性能，不僅可解決常規(guī)選育難以剔除就巢性狀的難題，同時(shí)，也可避免人為注射性激素類物質(zhì)所導(dǎo)致的藥物殘留等問題。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102716473SQ201210234670
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者何艷, 姜潤(rùn)深, 時(shí)丹, 耿照玉, 陳興勇 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)