一種用于擴(kuò)增短鏈rna的引物及其相關(guān)方法
【專利摘要】一種用于短鏈RNA擴(kuò)增的引物及其相關(guān)方法，該引物為一條寡核苷酸，其5`端一段核苷酸序列是固定的，形成一個(gè)核苷酸環(huán)和核苷酸莖的結(jié)構(gòu)，其3`端連接6-8個(gè)核苷酸與成熟miR?3`端相互配對(duì)形成特異性互補(bǔ)結(jié)合，在核苷酸環(huán)的3`端含一段GC含量達(dá)70%以上長(zhǎng)的核苷酸序列，稱為通用探針區(qū)；由引物5`端第8-30位核苷酸組成通用反向引物區(qū)。本引物存在一個(gè)內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)由于空間位阻的關(guān)系，不會(huì)與位于核苷酸鏈內(nèi)部的特異性序列結(jié)合，該類序列不會(huì)發(fā)生反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；只與3`末端特異性配對(duì)結(jié)合，特異性反轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的引物特異性高，不形成引物二聚體，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，合成方便，適合短鏈RNA尤其是成熟miR的反轉(zhuǎn)錄。
【專利說(shuō)明】—種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物及其相關(guān)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中檢測(cè)全長(zhǎng)為18-25nt的成熟miR所用的反轉(zhuǎn)錄引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]成熟miR是最近發(fā)現(xiàn)的一類全長(zhǎng)為18_25nt的單鏈小分子非編碼RNA，是由莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄前體(包括pr1-miRNA約lOOObp、pre-miRNA約60_70bp)加工而成。2011年11月Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(18.0版)公布,發(fā)現(xiàn)了 2萬(wàn)多種轉(zhuǎn)錄本,包括人類的近2000種。miRNAs是Victor Ambros及其同事首先在線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是一類非編碼的內(nèi)源性單鏈小分子RNA。其5'端的2_8nt種子區(qū)域(seed region)可與其革E mRNA的3'UTR以Waston-Crick堿基全部或部分互補(bǔ)配對(duì)(Watson-Crick basepairing),從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。人們預(yù)測(cè)大約30%的人類基因受miRNAs的調(diào)控，每種miRNA調(diào)控大約200種靶基因，而每種基因又受多種miRNA調(diào)控。各項(xiàng)研究亦表明它參與了人體重要的生物學(xué)進(jìn)程，如發(fā)育、造血、器官形成、細(xì)胞分化、凋亡和增殖、癌癥發(fā)生等。隨著對(duì)miRNAs研究的日趨深入，眾多的研究數(shù)據(jù)顯示超過(guò)50%的miRNAs基因位于癌基因或脆性基因區(qū)域，發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)或降低。
[0003]第一篇有關(guān)miRNA的論文發(fā)表于1993年，隨后的十年間相關(guān)的研究論文相當(dāng)有限，然而近5-6年來(lái)有關(guān)miRNA的研究論文數(shù)成倍增加，2010年大約就有近12000篇論文公開(kāi)發(fā)表并且有文獻(xiàn)表明，成熟miRNA具有組織特異性、疾病特異性、存在于外周血且非常穩(wěn)定。因此，miRNA不僅有治療價(jià)值而且有診斷價(jià)值。miRNA已經(jīng)成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)，并逐漸向應(yīng)用領(lǐng)域轉(zhuǎn)化。如何進(jìn)行準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)miRNA成為首先要解決的問(wèn)題。雖然miRNAs是一類表達(dá)相對(duì)豐富的轉(zhuǎn)錄本，但他們?cè)诓煌锓N和組織中的表達(dá)水平變化非常大。低豐度的miRNAs,通常用 克隆、northern blot和芯片的技術(shù)將難以檢測(cè)。如果要精確和定量檢測(cè)miRNA尤其是低豐度miRNA，qRT-PCR技術(shù)無(wú)疑是最佳選擇，因?yàn)閷?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是檢測(cè)基因表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)。1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過(guò)兩年的努力，發(fā)明了 PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過(guò)不斷重復(fù)這一過(guò)程，可以使目的DNA片段得到擴(kuò)增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作為模板，因而PCR技術(shù)可使DNA的合成量呈指數(shù)型增長(zhǎng)。
[0004]PCR是一種級(jí)聯(lián)反復(fù)循環(huán)的DNA合成反應(yīng)過(guò)程。PCR技術(shù)的基本反應(yīng)由三個(gè)步驟組成:
[0005]1.變性:通過(guò)加熱使模板DNA完全變性成為單鏈，同時(shí)引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除；[0006]2.退火:將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結(jié)合；
[0007]3.延伸:將溫度升高，熱穩(wěn)定DNA聚合酶以dNTP為底物催化合成DNA鏈延伸。[0008]以上三步為一個(gè)循環(huán)，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)后即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)用于RNA的擴(kuò)增，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。
[0009]應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)有一定長(zhǎng)度(如IOObp到幾個(gè)kb)的DNA或RNA，初學(xué)PCR的技術(shù)人員也不會(huì)有多大的困難，但是如何設(shè)計(jì)長(zhǎng)度只有18-25nt的成熟miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物、特異性的正向引物、標(biāo)記染料的TaqMan探針和反向引物是解決miRNA定量RT-PCR檢測(cè)的關(guān)鍵所在。因?yàn)槠胀ㄒ锏睦硐腴L(zhǎng)度在15-30bp之間，按照常規(guī)的做法一條成熟miRNA的長(zhǎng)度就幾乎為引物鏈覆蓋了，這樣擴(kuò)增將難以實(shí)現(xiàn)。目前解決這一問(wèn)題的是美國(guó)的AB公司，她采用了一種莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄成熟miR，來(lái)加長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄后的cDNA，實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增檢測(cè)的目的。
[0010]在中國(guó)專利文獻(xiàn)庫(kù)檢索也沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明所解決首要技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于短鏈RNA (包括成熟miR) RT-PCR擴(kuò)增的新式引物。該引物在設(shè)計(jì)思路上與前述的當(dāng)前引物根本不同，通過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)將引物的特異性大大提高，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，成本低，適用廣。
[0012]本發(fā)明所解決另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種相關(guān)的擴(kuò)增短鏈RNA的方法。
[0013]本發(fā)明解決上述首要技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其引物共4條，分別為莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物、特異性正向引物、通用反向引物和通用探針，其特征是:莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物由5段不同長(zhǎng)度的寡核苷酸組成，3'端的6-8bp組成第一區(qū)域與miRNA的3'端形成特異性互補(bǔ)，決定反轉(zhuǎn)錄的特異性，第二區(qū)域和第五區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，形成引物內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)，其Tm值應(yīng)高于反轉(zhuǎn)錄最適溫度2-5°C，在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中始終保持雙鏈形式，靠近5'端的核苷酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)第四區(qū)域設(shè)為通用反向引物區(qū)，其Tm值接近特異性正向引物或略高于2-5°C，靠近3'端的核苷酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)第三區(qū)域設(shè)為通用探針區(qū)，探針區(qū)的GC含量一般大于70%，保證探針的長(zhǎng)度不超過(guò)20bp且Tm值高于特異性正向引物的Tm值3-10°C，第三區(qū)域與第四區(qū)域之間應(yīng)至少間隔3bp以上；
[0014]優(yōu)選，所述的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，其3'端和5'端分別有一段互補(bǔ)配對(duì)的序列長(zhǎng)度15-20個(gè)核苷酸，并且3'端還有一段6-8個(gè)核苷酸的單鏈結(jié)構(gòu)，該單鏈與成熟的靶miR特異性互補(bǔ)配對(duì)。
[0015]優(yōu)選，所述通用探針區(qū)和通用反向引物區(qū)序列的Tm值接近或一致，并大于莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈Tm值2-5 °C。
[0016]作為優(yōu)選，所述的特異性正向引物，其Tm值小于通用探針和通用反向引物Tm值2-5。。。
[0017]作為優(yōu)選，所述的通用反向引物，其序列與莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的通用反向引物區(qū)序
列一致。
[0018]作為優(yōu)選，所述的通用探針，其序列與莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的通用探針區(qū)序列一致。
[0019]本發(fā)明解決上述另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:[0020]一種上述引物擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于:
[0021]莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物在合適的溫度和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下與靶miRNA的3'端特異性結(jié)合，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈；
[0022]特異性正向引物3'端由祀miR 5'端的10_18個(gè)堿基決定,其5'端的尾部序列可根據(jù)反應(yīng)Tm值隨機(jī)構(gòu)成，通用反向引物由莖環(huán)引物的通用反向引物區(qū)序列構(gòu)成，通用探針由莖環(huán)引物的通用探針區(qū)序列構(gòu)成；
[0023]經(jīng)過(guò)充分預(yù)變性后，當(dāng)退火溫度達(dá)到特異性正向引物特異性序列的Tm值時(shí)，特異性正向引物與cDNA第一鏈的3'端特異性結(jié)合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二鏈；
[0024]再變性后，cDNA第二鏈與cDNA第一鏈6解鏈成單鏈，當(dāng)退火溫度達(dá)到通用反向引物和通用探針Tm值時(shí)，通用反向引物和通用探針與cDNA第二鏈配對(duì)結(jié)合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二鏈為模板延伸形成cDNA第二鏈的互補(bǔ)鏈，同時(shí)當(dāng)延伸到通用探針時(shí)，通用探針被水解，通用探針兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
[0025]優(yōu)選，所述莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物其3'端和5'端分別有一段互補(bǔ)配對(duì)的序列長(zhǎng)度15-20個(gè)核苷酸，該互補(bǔ)雙鏈的Tm值應(yīng)大于反轉(zhuǎn)錄最適溫度2-5°C。
[0026]優(yōu)選，所述通用探針區(qū)和通用反向引物區(qū)序列的Tm值接近或一致，并大于莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈Tm值2-5 °C。
[0027]最后，所述cDNA第二鏈的合成的退火溫度為60_65°C，PCR擴(kuò)增循環(huán)的退火溫度為65-70。。。
[0028]本發(fā)明的引物所使用的`核苷酸可以是DNA，RNA, LNA (鎖核酸)，或PNA (肽核酸)，或任何非自然核苷酸組成。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0030]設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單:莖環(huán)引物設(shè)計(jì)時(shí)沒(méi)有太多的要求，只要莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈區(qū)Tm值高于反轉(zhuǎn)錄Tm值2-5°C，低于PCR擴(kuò)增Tm值2_5°C。任何設(shè)計(jì)過(guò)PCR引物的人員均可以設(shè)計(jì)。
[0031]無(wú)引物二聚體產(chǎn)生:在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，由于反轉(zhuǎn)錄酶的最適溫度低于莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈的Tm值2-5°C，引物內(nèi)雙鏈不會(huì)打開(kāi)，呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不會(huì)與另一條引物形成雙鏈，因此就不會(huì)擴(kuò)增出引物二聚體。
[0032]特異性高:由于成熟miR是一類全長(zhǎng)為18_25nt的單鏈小分子非編碼RNA，是由莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄前體(包括pr1-miRNA約1000bp、pre_miRNA約60_70bp)加工而成，因此,生物體內(nèi)同時(shí)存在成熟miR、pr1-miRNA和pre-miRNA。在反轉(zhuǎn)錄時(shí)，莖環(huán)引物的內(nèi)部雙鏈的作用使得引物呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，由于空間位組的關(guān)系莖環(huán)引物的3'端6-8個(gè)特異性堿基不能與pr1-miRNA和pre-miRNA順利結(jié)合,只會(huì)特異地與成熟miR的3'端形成互補(bǔ)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，從而特異性地轉(zhuǎn)錄了成熟miR而不受pr1-miRNA和pre-miRNA的影響。
[0033]適用范圍廣:對(duì)于短小的RNA (甚至DNA)尤其是長(zhǎng)度只有18_25nt的成熟miR，無(wú)論來(lái)自哪一種物種，或是非自然的短小核酸都有很好的適用性。
[0034]合成簡(jiǎn)單、成本低:無(wú)需任何特殊的儀器，只需要普通的DNA合成儀就可以完成。并且可以使用通用的反向引物和探針，可以大大減低合成成本。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1莖環(huán)引物及其反應(yīng)原理示意圖；
[0036]圖2 cDNA第二鏈的合成與cDNA的PCR擴(kuò)增示意圖；
[0037]圖3a、3b莖環(huán)RT引物用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的特異性和有效性的示意圖。
【具體實(shí)施方式】[0038]莖環(huán)特異性反轉(zhuǎn)錄引物的構(gòu)成及與靶miR反應(yīng)
[0039]本發(fā)明的莖環(huán)引物為一段寡核苷酸，其5'端核苷酸序列是固定的,形成一個(gè)核苷酸莖和核苷酸環(huán)的結(jié)構(gòu)，其3'端連接一段核苷酸與成熟的靶miR3'端特異性互補(bǔ)。在核苷酸環(huán)的3'端含一段GC含量達(dá)70%以上的序列，稱為通用探針區(qū)；5'端的序列為通用反向引物區(qū)。在一定的條件下，比如酸性、堿性或高溫條件下，引物內(nèi)部雙鏈被打開(kāi)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)消失，成線性結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1。
[0040]根據(jù)圖1，莖環(huán)引物由5段不同長(zhǎng)度的寡核苷酸組成。3'端的6_8bp組成第一區(qū)域I與miR的3'端形成特異性互補(bǔ)，決定轉(zhuǎn)錄的特異性。第二區(qū)域2和第五區(qū)域5互補(bǔ)結(jié)合，形成引物內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)，其Tm值應(yīng)高于反轉(zhuǎn)錄最適溫度2-5°C，在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中始終保持雙鏈形式?？拷塑账岘h(huán)狀結(jié)構(gòu)5'端的第四區(qū)域4設(shè)為通用反向引物區(qū)，其Tm值接近特異性正向引物或略高于3-10°C?？拷塑账岘h(huán)狀結(jié)構(gòu)3'端的第三區(qū)域3設(shè)為通用探針區(qū)，探針區(qū)的GC含量一般大于70%，保證探針的長(zhǎng)度不超過(guò)20bp且Tm值高于特異性正向引物的Tm值3-10°C。第三區(qū)域3與第四區(qū)域4之間應(yīng)至少間隔3bp以上。特異性反轉(zhuǎn)錄引物在合適的溫度和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下與靶miR的3'端特異性結(jié)合，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。
[0041 ] cDNA第一鏈的特異性擴(kuò)增(合成cDNA第二鏈)
[0042]特異性正向引物長(zhǎng)約24-28個(gè)核苷酸，在3'端的10_18個(gè)核苷酸與相應(yīng)的miR互補(bǔ)，而剩余的10-15個(gè)核苷酸的Tm值大于42°C。探針由核苷酸環(huán)的通用探針區(qū)20個(gè)核苷酸構(gòu)成。通用反向引物為23個(gè)核苷酸，由莖環(huán)引物5'端第8-30位核苷酸組成，見(jiàn)圖2。
[0043]根據(jù)圖2，特異性正向引物由3'端的特異性序列7和5'端的尾部序列8構(gòu)成，通用反向引物10由莖環(huán)引物的通用反向引物區(qū)的序列構(gòu)成，通用探針11由莖環(huán)引物的通用探針區(qū)3的序列構(gòu)成。經(jīng)過(guò)充分預(yù)變性后，當(dāng)退火溫度達(dá)到特異性正向引物特異性序列7的Tm值時(shí)，特異性正向引物與cDNA第一鏈6的3'端特異性結(jié)合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二鏈9 ;再變性后，cDNA第二鏈9與cDNA第一鏈6解鏈成單鏈，當(dāng)退火溫度達(dá)到通用反向引物10和通用探針I(yè)lTm值時(shí)，通用反向引物10和通用探針11與cDNA第二鏈9配對(duì)結(jié)合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物10以cDNA第二鏈9為模板延伸形成9的互補(bǔ)鏈，同時(shí)當(dāng)延伸到通用探針11時(shí)，通用探針11被水解，通用探針兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
[0044]實(shí)施例1:莖環(huán)RT引物結(jié)合探針用于實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)hsa-miR_30d
[0045]為考察莖環(huán)引物應(yīng)用在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)時(shí)的特異性和有效性，PCR模板分別為前體hsa-mir_30d
[0046](5'GUUGUUGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCUGUAAGACACAGCUAAGCUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGCUAC 3'帶下劃線的堿基為其成熟體的序列)和成熟hsa-miR-30d(5'UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG3')的標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品、及一系列稀釋的hsa_miR-30d標(biāo)準(zhǔn)cDNA樣品。RT反應(yīng)的體系總體積為 15μ 1，包括 1.5μ I 10Xbuffer，50U/y I 逆轉(zhuǎn)錄酶 1.Ομ 1，IOOmM dNTP 0.15μ I,20U/y I RNA 抑制劑0.19 μ 1，1μΜ RT 引物 3μ 1，0.01μΜ 模板 RNA 5 μ 1，DEPC 水 4.16 μ I。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)在BIO-RAD MyCycler定性PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為:16°C 30min,42°C30min，85°C 5min，4°C^。實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)體系總體積為 20 μ 1，包括 Universal PCRMasterMix 10μ 1，10μΜ的正、反向引物及探針各0.5μ 1，102、103、104、105、106倍稀釋的cDNA第一鏈模板1.5 μ 1，DEPC水7.0 μ I。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)在AB 7500實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為 95°C 10min,64°C 2min ；93°C 15s，69°C 40s (檢測(cè) FAM 熒光信號(hào))，共 40 個(gè)循環(huán)。
[0047]莖環(huán)RT引物為:
[0048]5' ^tcgtatccagaggtcaiI cgaggtgctcgtagtcggagcgtccctgcgaggc
TIiTGACCTCTGGATACGACt cttccagt 3'方框中的堿基為莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈部分，靠近5'端帶下劃線的堿基為通用反向引物序列區(qū)，3'端帶下劃線的堿基為通用探針序列區(qū)，小寫字體的堿基為與祀has-miR_30d 3'端特異性配對(duì)的堿基。
[0049]特異性正向引物為:TCAGCTTGTAAACATCCCCGACTGG,下劃線的堿基為與靶has-miR-30d的cDNA第一鏈3'端特異性互補(bǔ)配對(duì)的堿基。
[0050]通用反向引物為:CCAGAGGTCATCGAGGTGCTCGT，通用探針為FAM-CGGAGCGTCCCTGCGAGGCT-TAMRA，均與 cDNA 第二鏈配對(duì)結(jié)合。
[0051]圖3a顯示莖環(huán)引物用于檢測(cè)前體miRNA與成熟miR的特異性，對(duì)成熟miR的檢測(cè)效果非常好(曲線12)，而前體miRNA則不能檢測(cè)出(曲線13);圖3b顯示莖環(huán)引物用于實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)的有效性。初始的靶濃度在稀釋物最濃時(shí)的曲線14，曲線15、16、17、18分別表示當(dāng)模板被連續(xù)10倍稀釋4個(gè)梯度后的熒光曲線。曲線19說(shuō)明無(wú)靶(水)的空白對(duì)照。
[0052]序列表
[0053]〈110〉劉曉光
[0054]〈120〉一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物及其相關(guān)方法
[0055]<160>6
[0056]<210>1
[0057]<211>70
[0058]<212>RNA
[0059]〈213〉人工序列
[0060]〈400〉I
[0061]gyygyygyaa acayccccga cyggaagcyg yaagacacag cyaagcyyyc agycagaygy
[0062]yygcygcyac70
[0063]<210>2
[0064]<211>22
[0065]<212>RNA
[0066]〈213〉人工序列
[0067]<400>2
[0068]ygyaaacayc cccgacygga ag22[0069]<210>3
[0070]<211>79
[0071]<212>DNA
[0072]〈213〉人工序列
[0073]<400>3
[0074]gtcgtatcca gaggtcatcg aggtgctcgt agtcggagcg tccctgcgag gctatgacct
[0075]ctggatacga ccttccagt79
[0076]<210>4
[0077]<211>25
[0078]<212>DNA
[0079]〈213〉人工序列
[0080]<400>4
[0081]tcagcttgta aacatccccg actgg25
[0082]<210>5`[0083]<211>23
[0084]<212>DNA
[0085]〈213〉人工序列
[0086]<400>5
[0087]ccagaggtca tcgaggtgct Cgt23
[0088]<210>6
[0089]<211>20
[0090]<212>DNA
[0091]〈213〉人工序列
[0092]<400>6`
[0093]cggagcgtcc ctgcgaggct20
【權(quán)利要求】
1.一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其引物共4條，分別為莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物、特異性正向引物、通用反向引物和通用探針，其特征是:莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物由5段不同長(zhǎng)度的寡核苷酸組成，3'端的6-8bp組成第一區(qū)域與靶miR的3'端形成特異性互補(bǔ)，決定轉(zhuǎn)錄的特異性，第二區(qū)域(2)和第五區(qū)域(5)互補(bǔ)結(jié)合，形成引物內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)，其Tm值應(yīng)高于反轉(zhuǎn)錄最適溫度2_5°C，在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中始終保持雙鏈形式，靠近核苷酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)5'端的第四區(qū)域(4)設(shè)為通用反向引物區(qū)，其Tm值接近特異性正向引物或略高于3-10°C，靠近核苷酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)3'端的第三區(qū)域(3)設(shè)為通用探針區(qū)，探針區(qū)的GC含量一般大于70%，保證探針的長(zhǎng)度不超過(guò)20bp且Tm值高于特異性正向引物的Tm值3-10°C，第三區(qū)域(3)與第四區(qū)域(4)之間應(yīng)至少間隔3bp以上。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于:所述的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，其3'端和5'端分別有一段互補(bǔ)配對(duì)的序列長(zhǎng)度15-20個(gè)核苷酸，并且3'端還有一段6-8個(gè)核苷酸的單鏈結(jié)構(gòu)，該單鏈與成熟的靶miR特異性互補(bǔ)配對(duì)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于:所述通用探針區(qū)和通用反向引物區(qū)序列的Tm值接近或一致，并大于莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈Tm值2-5 °C。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于:所述的特異性正向引物，其Tm值小于通用探針和通用反向引物Tm值3-10°C。
5.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于:所述的通用反向引物，其序列與莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的通用反向引物區(qū)序列一致。
6.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于:所述的通用探針，其序列與莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的通用探針區(qū)序列一致。
7.一種采用權(quán)利1-6的任意一種引物擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于:` 莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物在合適的溫度和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下與靶miR的3'端特異性結(jié)合，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈； 特異性正向引物由3'端的特異性序列(7)和5'端的尾部序列(8)構(gòu)成，通用反向引物由莖環(huán)引物的通用反向引物區(qū)序列構(gòu)成，通用探針由莖環(huán)引物的通用探針區(qū)序列構(gòu)成； 經(jīng)過(guò)充分預(yù)變性后，當(dāng)退火溫度達(dá)到特異性正向引物特異性序列(7)的Tm值時(shí)，特異性正向引物與cDNA第一鏈(6 )的3'端特異性結(jié)合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二鏈(9)； 再變性后，cDNA第二鏈9與cDNA第一鏈6解鏈成單鏈，當(dāng)退火溫度達(dá)到通用反向引物和通用探針Tm值時(shí)，通用反向引物和通用探針與cDNA第二鏈(9 )配對(duì)結(jié)合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二鏈(9 )為模板延伸形成cDNA第二鏈(9 )的互補(bǔ)鏈，同時(shí)當(dāng)延伸到通用探針時(shí)，通用探針被水解，通用探針兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求7所述擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于所述莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物其3'端和5'端分別有一段互補(bǔ)配對(duì)的序列長(zhǎng)度15-20個(gè)核苷酸，該互補(bǔ)雙鏈的Tm值應(yīng)大于反轉(zhuǎn)錄最適溫度2-5 °C。
9.如權(quán)利要求7所述擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于所述通用探針區(qū)和通用反向引物區(qū)序列的Tm值接近或一致，并大于莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈Tm值2-5 °C。
10.如權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于:所述cDNA第二鏈的合成的退火溫度為60-65°C，PCR擴(kuò)增循環(huán)的退火溫度為65-70°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103509789SQ201210217137
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月26日
【發(fā)明者】劉曉光 申請(qǐng)人:劉曉光