專利名稱：一株鮭魚腎桿菌及其生產(chǎn)的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物篩選及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及ー株鮭魚腎桿菌及其生產(chǎn)的酶，即一株高產(chǎn)胞外殼聚糖酶的海洋細(xì)菌Renibacterium Salmoninarum QDl及其所產(chǎn)的殼聚糖降解酶CSN-A。
背景技術(shù)：
甲殼素(chitin)又稱幾丁質(zhì)，是自然界中含量僅·次于纖維素的第二大類天然高分子化合物，年生物合成約十億噸。它廣泛存在于蝦、蟹和昆蟲類等節(jié)肢動物的外殼及部分高等植物和真菌的細(xì)胞壁中。殼聚糖(chitosan)是甲殼素脫去部分或全部こ酰基的產(chǎn)物，是ー類由2-氨基-2-脫氧-葡萄糖和2-こ酰氨基-2-脫氧-葡萄糖(< 40%)単體通過β -I，4糖苷鍵連接而成的直鏈多糖。與甲殼素相比，殼聚糖含有性質(zhì)較活潑的伯氨基，它是天然多糖中唯一含有陽離子的高分子聚合物，具有多種生理功能，如抗菌性、成膠性和成膜性等，因而在多個領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。殼聚糖酶是ー類催化氨基葡萄糖的β_1，4-糖苷鍵斷裂，從而專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶。殼聚糖酶用途廣泛，一方面，殼聚糖酶可以用于制備具有獨(dú)特生理活性的殼寡糖；另一方面，殼聚糖酶本身還可以作為生物防腐剤，能提高植物的抗病能力；最后，殼聚糖酶在生物體的自溶、細(xì)胞壁的形態(tài)發(fā)生、土壤微生物的營養(yǎng)代謝等基礎(chǔ)研究方面也具有重要的用途。自1973年首次在真菌和細(xì)菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)殼聚糖酶以來，人們已經(jīng)在許多細(xì)菌、放線菌和真菌等類群的微生物中發(fā)現(xiàn)了殼聚糖酶的存在，但這些殼聚糖酶的活性大多低于10U/mlo根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2007年孫玉英等報(bào)道了一株來自海洋Microbacterium sp. OUOl的殼聚糖酶，其活力達(dá)到118U/ml，2004年陳小娥等報(bào)道的曲霉經(jīng)優(yōu)化后的活力達(dá)197U/ml。目前已有多個殼聚糖酶實(shí)行了商品化，其價格均比較昂貴，如鄭州駿濤化工有限公司生產(chǎn)的食品級殼聚糖酶售價為460元/升。綜上所述，目前殼聚糖酶的研究存在如下缺點(diǎn)，菌株產(chǎn)酶能力低下、酶活力不高、適合于エ業(yè)化生產(chǎn)的菌株少、發(fā)酵成本高。因此，高活力、低成本的殼聚糖酶及其微生物產(chǎn)生菌株具有重要的市場應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株鮭魚腎桿菌及其生產(chǎn)的殼聚糖酶，即ー株高產(chǎn)胞外殼聚糖酶的菌株，及其生產(chǎn)的殼聚糖酶，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有的技術(shù)不足。本發(fā)明提供的殼聚糖酶產(chǎn)生菌株為鮭魚腎桿菌屬海洋細(xì)菌RenibacteriumSp. QDl,已于2011年6月30日保藏在位于湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO M 2011226。本發(fā)明的菌株用來生產(chǎn)殼2糖(殼寡2糖)和/或殼3糖(殼寡3糖)。本發(fā)明的菌株能大量分泌高活性的殼聚糖降解酶CSN-A，適合エ業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)殼聚糖酶最適發(fā)酵時間為40-42hr。本發(fā)明的菌株產(chǎn)殼聚糖酶最適溫度為25_28°C。
上述的殼聚糖酶CSN-A是從QDl菌株發(fā)酵上清液中分離純化到的，具有如下性質(zhì)殼聚糖降解酶CSN-A，其SDS-PAGE電泳分子量大小為28kD。上述的殼聚糖酶，其作用底物為殼聚糖。上述的殼聚糖酶，降解殼聚糖的最適溫度是50°C。
上述的殼聚糖酶，溫度穩(wěn)定范圍為0_25°C。上述的殼聚糖酶,降解殼聚糖的最適pH是5. 6。上述的殼聚糖酶，pH穩(wěn)定范圍為pH5-10。上述的殼聚糖酶，其抑制劑為Fe3+，Al3+，Cu2+和SDS，促進(jìn)劑為Mn2+。上述的聚糖酶降解殼聚糖的終產(chǎn)物為殼2糖和殼3糖。本發(fā)明所涉及的產(chǎn)酶菌株經(jīng)過對其發(fā)酵條件優(yōu)化其活力可以達(dá)到300_400U/ml，是迄今報(bào)道產(chǎn)酶量較高的菌株，此外該菌株還具有發(fā)酵周期短、發(fā)酵成本低的優(yōu)點(diǎn)，而且本發(fā)明所涉及的殼聚糖酶具有較高的PH穩(wěn)定性，預(yù)示了其在エ業(yè)應(yīng)用中的潛在價值。


圖I :本發(fā)明中所用菌株產(chǎn)胞外殼聚糖酶的溫度曲線圖譜；圖2 :本發(fā)明中所用菌株產(chǎn)胞外殼聚糖酶的時間梯度曲線；圖3 :本發(fā)明中所用菌株產(chǎn)胞外殼聚糖酶CSN-A的SDS-PAGE電泳圖；圖4 :本發(fā)明所用菌株產(chǎn)胞外殼聚糖酶CSN-A最適溫度和溫度穩(wěn)定性圖譜；圖5 :本發(fā)明中所用菌株產(chǎn)胞外殼聚糖酶CSN-A最適pH和pH穩(wěn)定性圖譜；圖6 :各種離子對本發(fā)明中所用菌株產(chǎn)殼聚糖酶CSN-A的活力影響圖譜；圖7 :本分明中所用菌株產(chǎn)殼聚糖酶CSN-A降解殼聚糖的終產(chǎn)物薄層分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對發(fā)明菌株的篩選、酶的性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例I菌株的分離和鑒定從膠州灣采集海水，4°C保存，如下方法處理將海水經(jīng)5000rpm/min離心IOmin后，用少量的海水重懸，將溶液進(jìn)行梯度稀釋后直接涂布在含有O. 5%的殼聚糖固體培養(yǎng)基平板上，于28°C培養(yǎng)2-3天，選擇帶有明顯透明水解圈的菌落，挑取單克隆接種到含3ml液體培養(yǎng)基的試管中，28°C 200rpm/min培養(yǎng)12hr，將培養(yǎng)液按1%的比例接入含50ml液體培養(yǎng)基的250毫升三角瓶中，于28V 200rpm/min培養(yǎng)1_2天。培養(yǎng)液經(jīng)離心后進(jìn)行酶活力測定，篩選高穩(wěn)定性、高活力的菌株。對其中活力最高的ー株菌經(jīng)形態(tài)分析和16SrDNA序列測定，表明該菌株屬于鮭魚腎桿菌屬，革蘭氏染色呈陽性，命名為RenibacteriumSaimoninarum QDl0實(shí)施例2菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化I)菌株QDl最適發(fā)酵溫度的優(yōu)化過夜培養(yǎng)的菌株接種于IOOml發(fā)酵液，分別于18、25、30、37°C進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，定時取樣測定殼聚糖酶活，如圖I所示，QDl菌株最適發(fā)酵溫度確定為25 28°C。2)菌株QDl最適發(fā)酵時間的優(yōu)化
過夜培養(yǎng)的菌株接種于IOOml發(fā)酵液，于28°C進(jìn)行培養(yǎng)，定時取樣測定殼聚糖酶活力，如圖2所示，菌株QDl產(chǎn)殼聚糖酶在40-42hr達(dá)到高峰。按照上述優(yōu)化條件，菌株QDl產(chǎn)殼聚糖酶活力可提高到300-400U/ml發(fā)酵液。使用的液體培養(yǎng)基配方為(g/L):殼聚糖膠體5g，氯化鈉lg，酵母粉lg。酶活力測定方法為光吸收法，O. 9ml 1%殼聚糖膠體溶液加入Iml O. 2M醋酸緩沖液(PH5. 8)，于50°C溫浴，加入IOOul發(fā)酵上清粗酶液，于50°C反應(yīng)lOmin，反應(yīng)完畢后加入DNS試劑1.5ml，于沸水浴煮沸IOmin,加水稀釋至25ml體積,取5ml于10000rpm/min離心5min,上清液于520nm測定吸光值，根據(jù)氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得還原糖量。ー個酶活力単位(U)定義為50°C下每分鐘催化生成相當(dāng)于I μ mo I氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。殼聚糖膠體溶液的配制，稱取Ig殼聚糖，加入IOmllM鹽酸，玻璃棒攪拌至成膠，加入70ml去離子水，75°C水浴保溫?cái)嚢柚寥咳芙?，用IM氫氧化鈉調(diào)PH至6. 0，75°C保溫至白色沉淀全部溶解，加水定 容到100ml，12rC滅菌后備用。實(shí)施例3菌株產(chǎn)殼聚糖酶CSN-A的分離純化I =CSN-A酶的分離純化過夜培養(yǎng)的菌株QDl接種于IOOml發(fā)酵液，于28°C發(fā)酵培養(yǎng)36hr，收集發(fā)酵液以12000g、4°C離心20min,上清液用60%硫酸銨沉淀過夜,4°C 12000rpm/min離心30min,沉淀用20mM磷酸緩沖液pH6. 8溶解，經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾后備用，過濾后的酶液上樣疏水層析柱，用去離子水進(jìn)行梯度洗脫，收集各個洗脫峰，以殼聚糖酶活作為跟蹤，分別測定每個洗脫峰，所得的活性峰經(jīng)PAGE電泳顯示為單一條帯，命名為CSN-A。比活性從199U/mg蛋白提高到1574U/mg，提高了 7. 89倍，回收率為67%，見表I。表I殼聚糖酶CSN-A的分離純化步驟及結(jié)果
方法總酶活(U) 總蛋白(mg) 比活力(U/mg) 純化倍數(shù)
得率(=/0)
粗酶液6782.8534.00199.49I
100
硫酸銨6425.14 4 681372.896.88
94.73
疏水層析4581.77 2.911574.497.89
67 實(shí)施例4殼聚糖酶CSN-A的酶學(xué)性質(zhì)I)殼聚糖酶CSN-A的分子量確定因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的相對遷移率與分子量的對數(shù)成正比，因此可以通過SDS-PAGE測定目標(biāo)蛋白的分子量。根據(jù)SDS-PAGE中標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白和目標(biāo)蛋白的相對遷移率，計(jì)算出CSN-A酶的分子量大小為28kD，如圖3所示,該大小與其在凝膠色譜中的大小一致。2)殼聚糖酶CSN-A的最適溫度和熱穩(wěn)定性測定純化后的CSN-A在不同的溫度(20、30、40、50、60、70°C )下進(jìn)行酶活性測定，結(jié)果如圖4A所示。CSN-A的最適溫度為50°C，當(dāng)?shù)陀?0°C或高于70°C時，酶活性大幅降低，僅為最適溫度下的15%左右。酶的溫度穩(wěn)定性分析是指將酶在一定的溫度(0、10、20、30、40、50)下保溫Ih后，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活，結(jié)果如圖4B所示。CSN-A在30°C以下有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)溫度達(dá)到50°C時，純酶在Ih內(nèi)幾乎全部失活。3)殼聚糖酶CSN-A的最適pH和pH穩(wěn)定性測定純化后的CSN-A在不同的pH下的方法進(jìn)行酶活性測定，結(jié)果如圖5A所示。CSN-A的酶活性對PH比較敏感，最適pH為5. 6。當(dāng)pH低于5或高于7吋，酶活性顯著下降，要低于最適pH的50%。pH穩(wěn)定性的測定是將等量的酶液與不同pH的緩沖液4°C放置24h，測定時按標(biāo)準(zhǔn)
方法測定殘余酶活，結(jié)果如圖5B所示。結(jié)果表明，CSN-A在pH5-10之間均能保持較好的穩(wěn)定性。4)金屬離子對CSN-A酶活性的影響分別考察lmmol/L 的各種離子(Li+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Al3+、Fe3+)對酶活的影響，對照組的酶活定為100%。如圖6所示，Cu2+、Fe3+和Al3+對CSN-A的酶活具有強(qiáng)烈的抑制作用，此外表面活性劑SDS對酶活也有顯著的抑制作用，而Mn2+對酶活有顯著的激活作用。5)殼聚糖酶CSN-A降解殼聚糖的終產(chǎn)物薄層層析分析底物的配制(1%):按照I克殼聚糖粉IOml IM HCl的比例加入鹽酸，75°C加熱攪拌過夜，用IM NaOH回調(diào)PH至6.0，回調(diào)過程中要邊加熱邊攪拌，用去離子水補(bǔ)充體積至底物濃度為1%。水解調(diào)整酶液濃度為100U/ml，按照酶液底物=1 9的體積比，于55°C條件下水解lh，產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥后密封保存。產(chǎn)物鑒定取適量產(chǎn)物干粉，用去離子水配制成溶液，利用薄層層析(TLC)鑒定產(chǎn)物的組成，展開劑為正丁醇冰こ酸水氨水=2:1:1:0. 3，展層后用吹風(fēng)機(jī)吹干，將薄層板浸入顯色劑(2g ニ苯胺、2mL苯胺、Iml濃HCl與10mL85%磷酸共溶于200mL丙酮中)，迅速取出后用吹風(fēng)機(jī)烘干，然后用電爐烘烤硅膠板，至顯色為止。結(jié)果如圖7所不，其中M為殼2糖和殼3糖標(biāo)準(zhǔn)品，A為未降解的殼聚糖，結(jié)果B說明CSN-A降解殼聚糖的終產(chǎn)物為殼2糖和殼3糖。本發(fā)明獲得的菌株和從該菌株獲得的殼聚糖酶CSN-A具有很好的エ業(yè)應(yīng)用前景，能夠用來エ業(yè)化生產(chǎn)殼2糖和殼3糖。
權(quán)利要求
1.一種鮭魚腎桿菌屬海洋細(xì)菌Renibacterium Sp.，其保藏編號為CCTCC NO M2011226。
2.權(quán)利要求I所述的鮭魚腎桿菌屬海洋細(xì)菌RenibacteriumSp.的應(yīng)用,其特征在于，是用來生產(chǎn)殼2糖和/或殼3糖。
3.一種殼聚糖降解酶，其特征在于，是用權(quán)利要求I所述的鮭魚腎桿菌屬海洋細(xì)菌Renibacterium Sp.所分泌的，其分子量大小為28kD。
4.如權(quán)利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的作用底物為殼聚糖。
5.如權(quán)利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶降解殼聚糖的最適溫度是50°C。
6.如權(quán)利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的溫度穩(wěn)定范圍為 0-25 0C ο
7.如權(quán)利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的最適pH為5.6。
8.如權(quán)利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的pH穩(wěn)定范圍為PH5-10。
9.如權(quán)利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的抑制劑為Fe3+、Al3+、Cu2+ 和 SDS,促進(jìn)劑為 Mn2+。
10.權(quán)利要求3所述的殼聚糖降解酶的用途，是用于生產(chǎn)殼2糖和殼3糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)胞外殼聚糖降解酶的海洋細(xì)菌Renibacterium Sp.QD1及其產(chǎn)胞外殼聚糖降解酶CSN-A的分離純化條件、酶學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明通過對菌株QD1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵上清液活性達(dá)300-400U/ml，粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、疏水層析，得到約28kDa的殼聚糖降解酶CSN-A，該酶降解殼聚糖的最適溫度為50℃，最適pH為5.6-5.8，F(xiàn)e3+,Al3+,Cu2+和SDS對CSN-A酶活有強(qiáng)烈的抑制作用，而Mn2+能明顯激活CSN-A，CSN-A降解殼聚糖終產(chǎn)物以殼2糖、3糖為主。菌株QD1在適合于工業(yè)化生產(chǎn)條件下的酶活力可達(dá)300-400U/ml發(fā)酵液。本發(fā)明在解決目前市場上殼聚糖酶產(chǎn)生菌株產(chǎn)量低、價格昂貴方面將具有極大的應(yīng)用前景，并將極大促進(jìn)殼寡糖等相關(guān)產(chǎn)品的利用。
文檔編號C12R1/01GK102732462SQ20121021279
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月24日
發(fā)明者于文功, 刑培川, 路新枝 申請人:中國海洋大學(xué)