專利名稱：等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的試劑及等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測猴痘病毒的試劑及方法，尤其涉及利用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測猴痘病毒的試劑和方法。
背景技術(shù)：
猴痘病毒是一種人畜共患病，多發(fā)于中非和西非，1958年首次發(fā)現(xiàn)于猴子體內(nèi)，上世紀(jì)70年代首次發(fā)現(xiàn)于人類感染猴痘病毒，2003年曾在美國威斯康辛州爆發(fā)，造成82人感染。猴痘病毒為雙鏈DNA病毒，與天花病毒同屬痘病毒科，感染的癥狀與天花相似，如發(fā)熱、頭痛、淋巴結(jié)腫大、咳嗽和全身極度疼痛，俗稱“猴天花”，為未輸入我國的危險(xiǎn)病毒之一，可通過直接接觸患者或者被感染的動(dòng)物，或通過患者的體液傳播，毒力強(qiáng)的病毒株有可能致死。天花疫苗對(duì)猴痘病毒有一定的抵抗能力，目前30歲以下人群均未接種天花疫苗，一旦 猴痘病毒傳入將造成極大的危害。因此建立快速的猴痘病毒檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種高效、特異且不需要特殊儀器的核酸檢測手段，針對(duì)靶基因的6個(gè)特征區(qū)域設(shè)計(jì)4種引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴(kuò)增。它的產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖-環(huán)狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上會(huì)呈現(xiàn)出LAMP所特有的階梯狀條帶。LAMP反應(yīng)過程將產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)快速離心或者濁度變化，直觀觀察檢測結(jié)果，在基層或者落后地區(qū)技術(shù)人員只需簡單培訓(xùn)就可完成實(shí)驗(yàn)操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是提供一種等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的試劑，可以用于快速準(zhǔn)確地檢測猴痘病毒。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括(I)檢測猴痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒載體；所述基因片段的堿基序列為CCTCTCTCATTGATTTTTCGCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGCATCAGAATCTGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATTGTCGTAGACCAACGAGGAGGAGTATCGTCGGAACTGTACACCATAGTACTACGTTGAAGATCATACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTTCTCCATATTAAGTTGTTTAGTTAGTTGTGCAGTAGCTCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGCACACAATCTCTGTGTCAGAACGCTCGTCAATATAGATCGTAGAAATTTTTTAGAGAGAACTAACACAACTAGCAATAAAACTGATCTTATTTTATCATTTTTTTATTCATCATCCTCTGGTGGTTCGTCGTTCCTATCGAATGTAGCTCTGATTAACCCGTCATCTATAGGTGATGCTGGTTCTGGAGATTCTGGAGGAGATGGATTATTAT，如序列表 SEQ NO: I 所示；(2)引物,其基因喊基序列外引物F3:5' -CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'；
外引物B3:5' -TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3'；內(nèi)引物FIP :5' -GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3/ ；內(nèi)引物BIP :5' -TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3/ 。本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問題是提供一種等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的方法，可以快速準(zhǔn)確地檢測猴痘病毒。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 它的反應(yīng)體系25 μ 1，包括10Xbuffer2. 5μ 1，引物混合物I μ 1，模板DNAl μ 1，8U BstDNA 聚合酶 O. 8μ 1，甜菜堿(8Μ) 2μ 1，dNTP(10mM)2y 1，MgSO4(IOOmM) I. 2μ I,
I.25 μ I熒光染料20 X Eva Green，加入ddH20補(bǔ)足25 μ I ;反應(yīng)體系中引物終濃度分別如下外引物F3和外引物Β3各40ρΜ,內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP各800ρΜ ；將上述反應(yīng)體系在水浴箱上63 °C 90分鐘，或者在熒光定量PCR儀上63 °C I分鐘，90個(gè)循環(huán)，同時(shí)進(jìn)行待測樣本、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的擴(kuò)增，其中陰性對(duì)照采用雙蒸水，陽性對(duì)照采用權(quán)利要求I所述的檢測猴痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)品；反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果，陽性對(duì)照孔產(chǎn)生階梯狀的條帶，陰性對(duì)照孔則沒有條帶產(chǎn)生，待測樣本孔中如產(chǎn)生階梯狀條帶則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒；或者，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)管離心6000rpm，3分鐘，觀察結(jié)果，陽性對(duì)照管可見白色沉淀，陰性對(duì)照管沒有產(chǎn)生沉淀，樣本管中如產(chǎn)生白色沉淀則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒；或者紫外燈下觀察熒光強(qiáng)度的變化，陽性對(duì)照產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光，陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度沒有變化，樣本管中如產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒。進(jìn)一步地，本發(fā)明檢測方法還可進(jìn)行定量檢測。待測樣本被檢測出陽性后，所述方法通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)待測樣本進(jìn)行猴痘病毒的濃度檢測；所述濃度檢測包括以下步驟將待測樣本和稀釋至不同濃度的權(quán)利要求I所述的檢測猴痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)按權(quán)利要求2所述的反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序63°C I分鐘，90個(gè)循環(huán)，讀取熒光值，陰性對(duì)照采用滅菌雙蒸水，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)得到所述標(biāo)準(zhǔn)品的各個(gè)濃度的循環(huán)閾值C (t)，采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)待測樣本進(jìn)行猴痘病毒的濃度檢測，將待測樣本循環(huán)閾值C (t)與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，得到待測樣本DNA中的靶基因片段拷貝濃度，按照所述拷貝濃度判斷待測樣本中猴痘病毒的濃度。本發(fā)明具有操作簡便，高效、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。制備的標(biāo)準(zhǔn)品特異性強(qiáng)，堿基差異穩(wěn)定，使設(shè)計(jì)的引物只針對(duì)猴痘病毒及其亞種，而不會(huì)把其他痘病毒或其他物種擴(kuò)增出來，純度高，易保存。引物與整個(gè)genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索，和其它物種的核酸序列無同源，保證了檢測方法的特異性。該方法的建立，填補(bǔ)了猴痘病毒恒溫核酸擴(kuò)增檢測方法的空白，對(duì)樣本的檢測只需I. 5小時(shí)左右即可完成，可快速篩查猴痘病毒，對(duì)口岸輸入性疾病篩查具有重要意義，為防御疾病的傳入做好技術(shù)支撐和戰(zhàn)略儲(chǔ)備，滿足當(dāng)前衛(wèi)生檢疫的需求。


圖I為實(shí)施例I將特異片段克隆入pGSI質(zhì)粒后的圖譜。圖2為實(shí)施例I中將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的片段與特異序列測序的對(duì)比結(jié)果。圖3為實(shí)施例2中在25μ I體系中加入不同Mg2+濃度擴(kuò)增后的電泳結(jié)果，I 為 marker :DL2000, 2 為力口入 MgSO4O. 9 μ 1，3 為 MgSO4L 05 μ 1,4 % MgSO4L 20 μ 1，5 為MgSO4L 35μ 1,6 =MgSO4L 5 μ 1,7 :陰性對(duì)照。圖4為實(shí)施例2中在不同的溫度下擴(kuò)增的電泳結(jié)果，I為marker:DL2000，2為61°C，3 為 62°C，4 為 63°C，5 為 64°C，6 為 65°C。圖5為實(shí)施例2中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在熒光定量PCR儀上讀取的實(shí)施曲線，I為2. 76X IO7, 2 為 2. 76X IO6, 3 ^ 2. 76X 105，4 為 2. 76X IO4, 5 為 2. 76X 103，6 為 2. 76X IO2,7為2. 76X10S8為2. 76X 10°，9為陰性對(duì)照。圖6為實(shí)施例2中根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品在熒光定量PCR儀上的Ct值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為實(shí)施例2中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，I為marker :DL2000，2為 2. 76父107，3為2· 76 X 106，4 為 2. 76 X 105，5 為 2. 76 X 104，6 為 2. 76 X 103，7 為 2. 76 X IO2,8 為 2. 76X10S9 為 2. 76X10°, 10 為陰性對(duì)照。圖8為實(shí)施例2中特異性試驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，I為marker :DL2000，2為陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，3為雞痘疫苗，4為牛痘疫苗，5為羊痘疫苗，6為水痘疫苗，7為陰性對(duì)照。圖9為實(shí)施例2中特異性試驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物離心后的沉淀結(jié)果，I為陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，2為雞痘疫苗，3為牛痘疫苗，4為羊痘疫苗，5為水痘疫苗，6為陰性對(duì)照。圖10為實(shí)施例2中特異性試驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物加入熒光染料20XEva Green后在紫外燈下觀察的結(jié)果，I為陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，2為雞痘疫苗，3為牛痘疫苗，4為羊痘疫苗，5為水痘疫苗，6為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I陽性樣本標(biāo)準(zhǔn)品的制備根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫，分析猴痘各亞型基因組序列，經(jīng)過序列比對(duì)，選取片段在猴痘病毒基因組genbank編碼HQ857563. I中的位置為48332_48780bp之間，共448個(gè)堿基，此段序列堿基差異穩(wěn)定，能使設(shè)計(jì)的引物只針對(duì)猴痘病毒及其亞種，不會(huì)把其他痘病毒或其他物種擴(kuò)增出來，序列見SEQ ID N0:1及圖I。將目的片段克隆入pGSI質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，當(dāng)外源片段插入到PGSI質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變，表達(dá)蛋白失活，產(chǎn)生的氨基酸片段失去α -互補(bǔ)能力，含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。而沒有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生α-互補(bǔ)，在生色底物X_gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG (異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。挑選白色的陽性菌落進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，將測序正確的克隆，于空氣浴搖床37°C振蕩培養(yǎng)增菌，培養(yǎng)物用Promega質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，做為陽性樣本標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒圖譜見圖2，測定質(zhì)粒的濃度為lOOng/μ I。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行測序，并進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見圖3，重合率達(dá)到100%，從而證明質(zhì)粒中含有合成的目的片段。根據(jù)質(zhì)粒濃度和質(zhì)粒長度，根據(jù)公式copy數(shù)=摩爾數(shù)χ6· 02χ10(23) = 3xlO(10)copies/ μ I 得到質(zhì)粒的濃度為 2. 76X 1010copies/ μ I。實(shí)施例2，猴痘病毒的檢測I.引物設(shè)計(jì)根據(jù)猴痘特異性序列，用Primer Ex plorerIV軟件分析設(shè)計(jì)一套引物(F3, B3,FIP，BIP)，分別是前外引物B3、后外引物F3、前內(nèi)引物FIP、后內(nèi)引物BIP :其中FIP是由FlC的互補(bǔ)序列和F2序列組成，BIP是由BlC序列和B2的互補(bǔ)序列組成，。引物基因序列如下外引物F3:5' -CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'；外引物B3:5' -TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3'；內(nèi)引物FIP:
5' -GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3'；內(nèi)引物BIP :5' -TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3'。2.恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系及反應(yīng)溫度反應(yīng)體系為25 μ 1，組分包括10Xbuffer2. 5μ 1，引物混合物I μ 1(體系中引物終濃度分別如下:F3、B3 各 40pM，F(xiàn)IP、BIP 各 800ρΜ)，模板 DNAl μ 1，8U BstDNA 聚合酶 O. 8 μ 1，甜菜堿(8Μ)2μ 1，dNTP(10mM)2y 1，I. 25 μ I 熒光染料 20 X Eva Green，調(diào)節(jié) MgSO4 (IOOmM)用量，加入ddH20補(bǔ)足25 μ I。反應(yīng)溫度選擇61-65°C之間，90分鐘，根據(jù)擴(kuò)增效率的選擇最優(yōu)的反應(yīng)條件。2. I.反應(yīng)體系Mg2+濃度的優(yōu)化調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的Mg2+濃度，在反應(yīng)體系中加入MgSO4 (IOOmM) O. 9/1. 05/1. 2/1. 35/
1.5μ 1，分別用水補(bǔ)足25μ I。如圖4，在25μ I體系中，加入濃度為IOOmM的鎂離子I. 20 μ I時(shí)擴(kuò)增效率為最高。2. 2.反應(yīng)溫度的優(yōu)化比較不同溫度對(duì)反應(yīng)的影響，見圖5，在61_65°C之間，63°C為最佳的反應(yīng)擴(kuò)增溫度。3.靈敏度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將克隆有目的基因片段的pGSI質(zhì)粒作為陽性樣本標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度及線性分析取已知濃度的陽性模板，10倍倍比稀釋至2. 76,2. 76X 10\2. 76X IO2,
2.76Χ103、2· 76Χ104、2· 76Χ105、2· 76Χ106、2· 76Χ107，分別取 I μ I 加入反應(yīng)體系進(jìn)行63°C I分鐘，熒光檢測，共90個(gè)循環(huán)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增檢測，從圖6，圖7，圖8，表I可見，本方法可檢出27. 6個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA分子。如圖6，圖7，圖8所示，將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為Y=-O. 1241Χ+12. 29，相關(guān)系數(shù)為 O. 995。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在 2. 76 X 10^2. 76 X IO7 拷貝范圍之間，樣本拷貝數(shù)與其相應(yīng)的CT值具有良好的相關(guān)性，因此，本方法可對(duì)2. 76 X 10^2. 76 X IO7拷貝范圍內(nèi)的模板進(jìn)行定量。表I檢測質(zhì)粒DNA的靈敏度分析
權(quán)利要求
1.ー種等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的試劑，其特征在于，它包括 (1)檢測猴痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為采用人工合成的基因片段，克隆入PGSI質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒載體；所述基因片段的堿基序列如SEQ ID NO 1所示； (2)引物，其基因喊基序列 外引物 F3 :5' -CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'；外引物 B3 :5' -TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3'； 內(nèi)引物FIP 5' -GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3'； 內(nèi)引物BIP 5' -TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3'。
2.ー種等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的方法，其特征在干 它的反應(yīng)體系25μ 1，包括10Xbuffer2. 5μ 1，引物混合物I μ 1，模板DNAl μ 1，8UBstDNA 聚合酶 O. 8 μ 1，甜菜堿(8102レ 1，dNTP(10mM)2y 1，MgSO4 (IOOmM) I. 2 μ 1，I. 25 μ I熒光染料20XEva Green，_AddH20*i25yl ;反應(yīng)體系中引物終濃度分別如下外引物F3和外引物B3各40pM,內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP各800pM ； 將上述反應(yīng)體系在水浴箱上63 °C 90分鐘，或者在熒光定量PCR儀上63 °C I分鐘，90個(gè)循環(huán)，同時(shí)進(jìn)行待測樣本、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的擴(kuò)增，其中陰性對(duì)照采用雙蒸水，陽性對(duì)照采用權(quán)利要求I所述的檢測猴痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)品； 反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果，陽性對(duì)照孔產(chǎn)生階梯狀的條帶，陰性對(duì)照孔則沒有條帶產(chǎn)生，待測樣本孔中如產(chǎn)生階梯狀條帶則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒；或者，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)管離心6000rpm，3分鐘，觀察結(jié)果，陽性對(duì)照管可見白色沉淀，陰性對(duì)照管沒有產(chǎn)生沉淀，樣本管中如產(chǎn)生白色沉淀則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒；或者紫外燈下觀察熒光強(qiáng)度的變化，陽性對(duì)照產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光，陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度沒有變化，樣本管中如產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的ー種等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒方法，其特征在于 待測樣本被檢測出陽性后，所述方法通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)待測樣本進(jìn)行猴痘病毒的濃度檢測；所述濃度檢測包括以下步驟 將待測樣本和稀釋至不同濃度的權(quán)利要求I所述的檢測猴痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)按權(quán)利要求2所述的反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序63°C I分鐘，90個(gè)循環(huán)，讀取熒光值，陰性對(duì)照采用滅菌雙蒸水，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)得到所述標(biāo)準(zhǔn)品的各個(gè)濃度的循環(huán)閾值C (t)，采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)待測樣本進(jìn)行猴痘病毒的濃度檢測，將待測樣本循環(huán)閾值C( t)與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，得到待測樣本DNA中的靶基因片段拷貝濃度，按照所述拷貝濃度判斷待測樣本中猴痘病毒的濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的試劑。它包括(1)檢測猴痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒載體；所述基因片段的堿基序列如SEQ ID NO1所示；(2)引物，包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP。本發(fā)明還提供了一種等溫?cái)U(kuò)增檢測猴痘病毒的方法，其利用上述試劑，可以快速準(zhǔn)確地檢測猴痘病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102839224SQ201210209069
公開日2012年12月26日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者呂沁風(fēng), 鄭偉, 吳忠華, 徐琦, 羅鵬, 何蕾 申請人:浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心