專利名稱：：包含白喉毒素?zé)o毒突變體crm197或其片段的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197或其片段在融合蛋白中作為分子內(nèi)佐劑增強(qiáng)與其融合的目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本發(fā)明還涉及增強(qiáng)目的蛋白(例如衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達(dá)，形成融合蛋白。本發(fā)明還涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如JEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增強(qiáng)了目的蛋白的免疫原性。本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的分離的核酸，包含所述核酸的構(gòu)建體和載體，以及包含所述核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述融合蛋白的用途，其用于制備藥物組合物或疫苗。
背景技術(shù)：
：已對白喉毒素(diphtheriatoxin,DT)進(jìn)行了深入的研究。結(jié)構(gòu)研究顯示，白喉毒素由三個結(jié)構(gòu)域組成N端的催化結(jié)構(gòu)域C(aa1-190，Cdomain)(其也稱為A片段)，中間轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域T(aa201-384，Tdomain)，以及C端的受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域R(aa386-535，Rdomain)(ChoeS，BennettM,FujiiG,etal.,Nature.1992.357:216222)。利用白喉毒素的前兩個結(jié)構(gòu)域與白介素2(IL-2)融合而制備的ONTAK(DAB389-IL-2)在1999年被美國FDA批準(zhǔn)上市,用于成人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的治療。這證實(shí)白喉毒素的三個結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)行拆分并發(fā)揮其各自的功能。CRM197(Cross-ReactingMaterials197)是白喉毒素的一種無毒突變體(Uchida,T.,A.M,Pappenheimer,Jr.,R.Gregory,etal.,J.Biol.Chem.1973.248:3838-3844)，其與編碼DT的野生型基因相比存在單個核苷酸突變，導(dǎo)致第52位的氨基酸殘基由Gly變?yōu)镚lu(G.Giannini,R.Rappuoli,G.Rattietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12:4063-4070)。研究表明，CRM197雖然具有與野生型DT類似的結(jié)構(gòu)(即，具有上述3個結(jié)構(gòu)域)，但其A片段喪失了與NAD結(jié)合的能力，不能結(jié)合EF2并因而喪失了天然DT所具有的細(xì)胞毒性，這表明第52位氨基酸殘基Gly在DT與NAD的結(jié)合中起著重要作用(K.Moyner,G.Christiansen,ActapathmicrobialimmunolscandsectC.1984，92:17-23)。CRM197雖然喪失了細(xì)胞毒性，但其卻保留了與野生型DT相當(dāng)?shù)?、極強(qiáng)的免疫原性，因此其常被用作蛋白載體，用于與其他半抗原交聯(lián)從而制備結(jié)合疫苗。早在1985年，Porter等人就將Hib表面的多糖分別交聯(lián)至CRM197和DT蛋白載體并制成疫苗，并且研究兩者的免疫原性的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種交聯(lián)疫苗的免疫效果沒有顯著差異，二者都能刺激幼兒機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)和免疫記憶(PorterAnderson,MichealE.PichicheroandRichardA.J.Clin.Invest.1985:52—59)。在比較與各種蛋白載體交聯(lián)的肺炎球菌結(jié)合疫苗后發(fā)現(xiàn)，以CRM197為蛋白載體的疫苗在動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中均能產(chǎn)生較好的免疫效果，且CRM197安全，無毒負(fù)作用(Black，S.，H.Shinefield,etal.PediatrInfectDisJ,2000，19(3);187-195)。目前以CRM197為蛋白載體的肺炎球菌結(jié)合疫苗主要有PCV7、PCV9，PCV13等。臨床試驗(yàn)結(jié)果證明，這些疫苗在2歲以下的兒童中均具有較好的免疫原性和安全性(Barricarte,A.,J.Castilla,etal.ClinInfectDis,2007，44(11):1436-1441；Madhi,S.,P.Adrian,etal.Vaccine,2007,25(13):2451-2457；Duggan,S.T.Drugs,2010,70(15):1973-1986)。將CRM197與腦膜炎奈瑟氏菌(N.menigitidis)表面多糖交聯(lián)可制備流行性腦膜炎的結(jié)合疫苗。例如，以CRM197為蛋白載體的Meningitec(WyethPharmaceuticals)、Menjugate(Novartisvaccines)>Menveo(Novartisvaccines)等疫苗已經(jīng)上市。CRM197雖然失去酶活性和細(xì)胞毒性，但仍可與DT的特異受體HB-EGF(heparin-bindingEGF-Iikegrowthfactor,肝素結(jié)合性表皮生長因子)結(jié)合。因?yàn)檫@種受體一般在癌變組織中表達(dá)上調(diào)，所以CRM197與DT—樣具有抗腫瘤效應(yīng)(Buzzi,S.,D.Rubboli,etal.Immunotherapy,2004,53(11))。石開究還發(fā)現(xiàn),CRM197能透過血腦屏障(Blood-Brain-BarrierBBB),從而可以用作腦部藥物投遞的載體(Gaillard，P.J.,andA.G.deBoer.JControlRelease,2006,116(2):60-62)。雖然已報道CRM197具有多種功能，尤其是具有較強(qiáng)的免疫原性而可用作免疫佐齊U，但是迄今為止從未報道過，CRM197可以用作分子內(nèi)佐劑在融合蛋白中增強(qiáng)與其融合的目標(biāo)蛋白的免疫原性。本發(fā)明以戊型肝炎衣殼蛋白為例，首次證實(shí)了CRM197或其片段在融合蛋白中能夠增強(qiáng)與其融合的蛋白的免疫原性，從而可用作分子內(nèi)佐劑。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“CRM197”是指白喉毒素的一種無毒突變體，其與野生型白喉毒素相比，差異在于第52位的氨基酸殘基由GIy變?yōu)镚lu(G.Giannini,R.Rappuoli,G.Rattietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12:4063-4070)。白喉毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見例如，ChoeS,BennettM,FujiiG,etal.，Nature.1992.357:216-222),其氨基酸序列可見于例如GenBank登錄號AAV70486.I。在本發(fā)明中，CRM197的示例性氨基酸序列提供于SEQIDN0:2中。因此，在本發(fā)明中，當(dāng)涉及CRM197的序列時，其使用SEQIDNO:2所示的序列來進(jìn)行描述。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸殘基”中的第1-190位氨基酸殘基是指，SEQIDNO:2的第1-190位氨基酸殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可在SEQIDN0:2中天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響CRM197生物學(xué)特性。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“CRM197”意欲包括所有此類多肽和變體，包括SEQIDN0:2所示的多肽以及其天然或人工的變體，所述變體保留了CRM197的生物學(xué)特性，即，具有強(qiáng)免疫原性且無細(xì)胞毒性。并且，當(dāng)描述CRM197的序列片段時，其不僅包括SEQIDN0:2所示的多肽的序列片段，還包括該多肽的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸殘基”意欲包括，SEQIDNO:2的第1-190位氨基酸殘基，以及SEQIDNO:2所示的多肽的變體(天然或人工)中的相應(yīng)片段。根據(jù)本發(fā)明，戊型肝炎病毒OfepatitiSEvirus,HEV)衣殼蛋白是指由HEV0RF2編碼的蛋白。0RF2的序列是本領(lǐng)域公知的(參見，例如DDBJ數(shù)據(jù)登錄號D11092)。在本發(fā)明中，當(dāng)涉及0RF2的序列時，其使用DDBJ數(shù)據(jù)登錄號D11092所示的序列來進(jìn)行描述。例如，表述“HEV0RF2編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基”中的第368-606位氨基酸殘基是指，D11092編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在HEV0RF2或其編碼的多肽中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學(xué)功能(例如抗原性，免疫原性等等)。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“ffiV0RF2”應(yīng)包括所有此類序列和其變體，包括例如D11092所示的序列以及其天然或人工的變體。并且，當(dāng)描述HEV0RF2(或其編碼的多肽)的序列片段時，其不僅包括D11092(或其編碼的多肽)的序列片段，還包括D11092(或其編碼的多肽)的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。例如，表述“HEV0RF2編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基”包括，Dl1092編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基，以及Dl1092編碼的多肽的變體(天然或人工)中的相應(yīng)片段。HEV衣殼蛋白的示例性氨基酸序列(Dl1092中的0RF2所編碼的多肽)描述于SEQIDN0:31中。根據(jù)本發(fā)明，流感病毒(Influenzaviruses)M2蛋白是指由A型或B型流感病毒基因組第七節(jié)段編碼或C型流感病毒基因組第六節(jié)段編碼的蛋白。流感病毒M2蛋白的示例性氨基酸序列描述于SEQIDNO:32中。根據(jù)本發(fā)明，表述“相應(yīng)序列片段”或“相應(yīng)片段”是指，當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時，即當(dāng)序列進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在蛋白/多肽的背景中使用時，術(shù)語“變體”是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與參照蛋白/多肽(例如，本發(fā)明的CRM197)的氨基酸序列相比，具有一個或多個(例如1-10個或1-5個或1-3個)氨基酸差異(例如，保守氨基酸置換)，或者具有至少60%，80%，85%，90%,95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了參照蛋白/多肽的必要特性。在本發(fā)明中，CRM197的必要特性可以指，具有強(qiáng)免疫原性且無細(xì)胞毒性；HEV衣殼蛋白和流感病毒M2蛋白的必要特性可以指其抗原性和/或免疫原性。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目XlOO的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進(jìn)行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計(jì)算機(jī)程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等人(1970)j.Mol.Biol.48443-453的方法來實(shí)現(xiàn)。還可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120權(quán)重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。此外，可使用已整合入GCG軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來測定兩個氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。如本文中使用的，術(shù)語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置換。例如，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學(xué)上或功能上與相應(yīng)的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、^分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應(yīng)的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見,例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通過引用并入本文)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“免疫原性(immunogenicity)”是指,能夠刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)如抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性，也指抗原刺激機(jī)體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)能形成抗體或致敏T淋巴細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。免疫原性是抗原最重要的性質(zhì)，一種抗原能否成功地誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答取決于三方面的因素抗原的性質(zhì)、宿主的反應(yīng)性和免疫方式。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“免疫原性片段”是指這樣的多肽片段，其至少部分地保留了所源自的蛋白的免疫原性。例如，衣殼蛋白的免疫原性片段是指，HEV衣殼蛋白的至少部分地保留了免疫原性的片段，例如本發(fā)明中描述的HEV-239，E2或E2s等(參見，Li等人，JBiolChem.280(5):3400-3406(2005);Li等人，PLoSPathogens.5(8):el000537(2009))；流感病毒M2蛋白的免疫原性片段是指，M2蛋白的至少部分地保留了免疫原性的片段，例如本發(fā)明中描述的M2e(參見，F(xiàn)iersW等人，Vaccine.27(45):6280-6283(2009))。根據(jù)本發(fā)明，HEV-239(或簡稱239)是指由HEV0RF2編碼的多肽(即，HEV衣殼蛋白)的第368-606位氨基酸殘基組成的多肽；E2是指由HEV0RF2編碼的多肽的第394-606位氨基酸殘基組成的多肽；E2s指由HEV0RF2編碼的多肽的第455-606位氨基酸殘基組成的多肽。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“M2e”是指，由流感病毒M2蛋白的第1_24位氨基酸殘基組成的多肽。在本發(fā)明中，術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”具有相同的含義，可互換使用。并且在本發(fā)明中，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表不。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時，載體稱為表達(dá)載體。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“色譜層析”包括但不限于離子交換色譜(例如陽離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析、親和層析法。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見例如Remington’sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995),并且包括但不限于pH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，PH調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80;離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“佐劑”是指非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)其與抗原一起或預(yù)先遞送入機(jī)體時，其可增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。佐劑有很多種，包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子等。弗氏佐劑是目前動物試驗(yàn)中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在臨床實(shí)驗(yàn)中使用較多。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“分子內(nèi)佐齊『是指這樣的佐劑，其與目的蛋白(即，抗原)形成融合蛋白，從而其與抗原存在于一個相同的分子(即，包含其與抗原的融合蛋白)中，并充當(dāng)該抗原的佐劑以增強(qiáng)該抗原的免疫原性。即，分子內(nèi)佐劑是能夠增強(qiáng)與之融合表達(dá)的目的蛋白(抗原)的免疫原性的佐劑，其通常為多肽片段。在本發(fā)明中，分子內(nèi)佐劑特別地是指白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197或其片段。將兩種或更多種蛋白融合表達(dá)以形成融合蛋白的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見例如，J.Samtoook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人,精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南,第3版,Johnffiley&Sons,Inc.,1995)。通常，通過使用重組DNA技術(shù)將編碼兩種或更多種蛋白的DNA片段符合讀框地連接在一起，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)來獲得融合蛋白。任選地，可使用或不使用接頭來將兩種或更多種蛋白融合表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“接頭”是指用于連接兩個分子(例如蛋白)的短肽。通常，通過將編碼該短肽的多核苷酸序列引入(例如，通過PCR擴(kuò)增或連接酶)分別編碼所要連接的兩種目的蛋白的兩個DNA片段之間，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)來獲得融合蛋白，例如目的蛋白I-接頭-目的蛋白2。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，接頭包括但不限于柔性連接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly,Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3坐坐寸寸o根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預(yù)防疾病(例如或流感病毒感染)有效量是指，足以預(yù)防，阻止，或延遲疾病(例如HEV或流感病毒感染)的發(fā)生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。測定這樣的有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度、患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。本發(fā)明至少部分基于發(fā)明人的出人意料的發(fā)現(xiàn)在將CRM197或其片段與目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)融合表達(dá)后，CRM197或其片段顯著增強(qiáng)了目的蛋白的免疫原性。即，CRM197或其片段可以通過與目的蛋白融合表達(dá)而作為分子內(nèi)佐劑增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其包含CRM197或其片段以及目的蛋白，并且其中CRM197或其片段增強(qiáng)了目的蛋白的免疫原性。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，CRM197片段例如包含，CRM197的催化結(jié)構(gòu)域C(aa1-190，其在本申請中也稱為A片段)，轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域T(aa201-384)，和/或受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域R(aa386-535)。例如，CRM197片段可以包含A片段，或者A片段和轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域T。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，CRM197片段包含CRM197的aa1-190，例如包含CRM197的aa1-389。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，CRM197片段由CRM197的aa1-190或aa1-389組成。在本申請中，CRM197的示例性氨基酸序列示于SEQIDNO:2中，其相應(yīng)的核苷酸序列示于SEQIDNO:I中。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，目的蛋白例如可以是HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HEV衣殼蛋白的免疫原性片段可以包含或者是例如HEV-239(HEV衣殼蛋白aa368-606),E2(HEV衣殼蛋白aa394-606)或E2s(HEV衣殼蛋白aa455-606)等。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，M2蛋白的免疫原性片段可以包含或者是例如M2e(M2蛋白aa1-24)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白中的CRM197或其片段可連接至目的蛋白的N端和/或C端，任選地使用接頭進(jìn)行連接。用于連接2個肽段的接頭是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于柔性連接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly,Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3等等。此類接頭是本領(lǐng)域公知的,并且其選擇完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白可以包含CRM197或其片段，以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接。例如，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白可以是具有SEQIDN0:4，6，8，10，12，14，16或18所示氨基酸序列的蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白可以包含CRM197或其片段，以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接。例如，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白可以是具有SEQIDNO:34，36，38，40，42或44所示氨基酸序列的蛋白。在本發(fā)明的融合蛋白中，CRM197或其片段出人意料地顯著增強(qiáng)了與之融合(任選地，使用接頭)的目的蛋白例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性，從而可用作分子內(nèi)佐劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼如上所定義的融合蛋白的多核苷酸。還提供的是包含此類多核苷酸的構(gòu)建體。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種載體，其包含編碼如上所定義的融合蛋白的多核苷酸或者含有此類多核苷酸的構(gòu)建體。本發(fā)明的載體可以是克隆載體，也可以是表達(dá)載體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的載體是例如質(zhì)粒，粘粒，曬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。在另一個方面，還提供了包含本發(fā)明的多核苷酸或構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞或者生物體。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動物細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等)。本發(fā)明的細(xì)胞還可以是細(xì)胞系，例如293T細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述生物體是植物或者動物。在另一個方面，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物或疫苗，其包含根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白，任選地還包含藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。取決于融合蛋白中所使用的目的蛋白，本發(fā)明的藥物組合物或疫苗可以用于預(yù)防和/或治療各種疾病(即，能夠被目的蛋白預(yù)防和/或治療的疾病)。例如，當(dāng)使用的目的蛋白是衣殼蛋白或其免疫原性片段時，本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療HEV感染和與HEV感染相關(guān)的疾病例如戊型肝炎；當(dāng)使用的目的蛋白是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段時，本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關(guān)的疾病例如流感。在另一個方面，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療能夠被目的蛋白預(yù)防和/或治療的疾病。取決于融合蛋白中所使用的目的蛋白，本發(fā)明的藥物組合物可以用于預(yù)防和/或治療各種疾病。例如，當(dāng)使用的目的蛋白是衣殼蛋白或其免疫原性片段時，本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療感染和與HEV感染相關(guān)的疾病例如戊型肝炎；當(dāng)使用的目的蛋白是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段時，本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關(guān)的疾病例如流感。在另一個方面，本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療HEV感染或與HEV感染相關(guān)的疾病例如戊型肝炎的方法，其包括施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接。在另一個方面，本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療流感病毒感染或與流感病毒感染相關(guān)的疾病例如流感的方法，其包括施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接。在另一個方面，本發(fā)明提供了增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性的方法，其包括獲得包含上文所定義的CRM197或其片段與目的蛋白的融合蛋白，從而增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，任選地使用上文所定義的接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，目的蛋白是如上所述的衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的方法，其包括獲得包含CRM197或其片段與HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白，從而增強(qiáng)HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的免疫原性。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的方法，其包括獲得包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白，從而增強(qiáng)流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白。在另一個方面，本發(fā)明涉及CRM197或其片段用于增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段與目的蛋白的融合蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，目的蛋白是如上所述的衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。·因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及CRM197或其片段用于增強(qiáng)HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段與HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與衣殼蛋白或其免疫原性片段融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及CRM197或其片段用于增強(qiáng)流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，任選地使用接頭，將CRM197或其片段與流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白。發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次證實(shí)，CRM197及其片段可以用作分子內(nèi)佐劑，用于增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性。因此，本發(fā)明提供了CRM197及其片段的新用途，并且提供了新的增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性的方法。此外，由于本發(fā)明的融合蛋白展示了比單獨(dú)的目的蛋白更強(qiáng)的免疫原性，因此，本發(fā)明為制備藥物或者疫苗提供了新的選擇，并且可以實(shí)現(xiàn)更有效地預(yù)防和治療相應(yīng)疾病。例如，本發(fā)明的包含CRM197(或其片段)以及HEV衣殼蛋白(或其免疫原性片段)的融合蛋白展示比單獨(dú)的衣殼蛋白(或其免疫原性片段)更強(qiáng)的免疫原性，從而該融合蛋白可以用于制備藥物組合物，且更有效地預(yù)防和治療感染和與HEV感染相關(guān)的疾病例如戊型肝炎。例如，本發(fā)明的包含CRM197(或其片段)以及流感病毒M2蛋白(或其免疫原性片段)的融合蛋白展示比單獨(dú)的流感病毒M2蛋白(或其免疫原性片段)更強(qiáng)的免疫原性，從而該融合蛋白可以用于制備藥物組合物，且更有效地預(yù)防和治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關(guān)的疾病例如流感。例如，當(dāng)將M2e蛋白融合至CRM197(或其片段)的N端時，所形成的融合蛋白可形成四聚體或其他多聚體構(gòu)象，并且在體外與保護(hù)性單抗019(參見，F(xiàn)u等，Virology,2009,385:218-226)具有良好的反應(yīng)性(參見圖12B)，且在體內(nèi)具有良好的免疫原性(參見圖14)，因此，所形成的融合蛋白可用于研制通用的流感疫苗。關(guān)于序列信息的說明本發(fā)明涉及的序列的信息提供于下表中。^序列號^序列號I描述描述(SEQIDNO:)(SBQIDMO:)|ICRMl97的核苷酸序列2CMl97的氨基酸序列[3CRM197-L-12的核苷酸序列4C1M197-L-E2的氨基酸序^|5CRM197-L-E2S的核苷酸序列6—eiM197:B2s的氨基酸序列—|7389-L-E2的核香酸序列838^L~E2的氨基酸序列9389-L-E2S的核苷酸序列103g9-L-E2s的氨基酸序列|IIA-L-E2的核苷酸序列12A-L~B2的氨基酸序列^|13A-L-E2S的核苷酸序列14|15389-E2S的核苷酸序列16389-E2s的氨基酸序列|17A-E2s的核苷酸序列18...............................A-E2s................................|IfIl物CRM197F20fl#CRM197R21引物CRM197-linkerR225)#389-1inkerRI2SIl物A-IinkerR24引物E2FI25丨物B2sF26g|Drp59R|27!]#389E2sI28引物A-E2sR29引物389-B2sF30|#A-12sP|31腿V衣殼蛋白的氨基酸序列32M2蚤白_氨基酸序列j33OIMW7-L-M2e—瞽酸序列IMaMirHL:M2e的'氨基酸序到35389-L-M2e的核苷酸序列36389-L-M2e的氨基酸序列|37A-L-M2e的核苷酸序列38A-L-M2e的氨基酸序列|3fM2e-L-M197的核苷酸序列40M2e:L-aM197的氨基酸序列|41M2e-L-389的核苷酸序列_議e:L:邛9的氨基酸序列43M2e-L-A的核苷酸序列442e-L-A的氨基酸序列|45I丨物CWI197P146......................OMWl-Ilhket.......Rl........................|47引物389-linkerM48...........................................-.....................................j49引物M2eFl50引物M2eR|SI引物M2eF252I丨物M2e-LinkerI53Il縣CMIW7F254引物CTMl97R2|55引物389R56引物A量|下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。圖I顯示了在實(shí)施例2中構(gòu)建的各種融合蛋白的克隆設(shè)計(jì)。其中，使用的接頭(Linker，在本申請中也簡寫為L)為15個氨基酸殘基的柔性片段，其序列為GGGGSGGGGSGGGG;使用的CRM197包含535個氨基酸，其序列示于SEQIDNO:2；389是指包含CRM197的第1-389位氨基酸殘基(aa1-389)的多肽；A是指包含CRM197的第1-190位氨基酸殘基(aa1-190)的多肽；E2是指包含HEV衣殼蛋白第394-606位氨基酸殘基(aa394-606)的多肽；E2s是指包含HEV衣殼蛋白第455-606位氨基酸殘基(aa455-606)的多肽。圖2顯示了實(shí)施例2中構(gòu)建的融合蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性的SDS-PAGE分析結(jié)果。其中，圖2A使用的樣品為菌體超聲破碎后離心獲得的沉淀(即包涵體)，圖2B使用的樣品為4M尿素溶解上清，圖2C使用的樣品為SM尿素溶解上清，圖2D使用的樣品為復(fù)性至PBS中的蛋白。泳道M:蛋白分子量標(biāo)記；泳道I:CRM197-L-E2;泳道2CRM197-L-E2s;泳道3389-L-E2;泳道4:389-L_E2s;泳道5:389_E2s;泳道6:A-L_E2;泳道7:A-L_E2s;泳道8:A-E2s。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的融合蛋白均可在包涵體中表達(dá)，并且A-L-E2和A-L-E2s在4M和8M尿素中均可溶解，而其余融合蛋白則需8M尿素才能溶解。此外，結(jié)果還顯示，經(jīng)透析復(fù)性后可獲得純度在80%左右的融合蛋白。圖3顯示了經(jīng)層析純化后的融合蛋白A-L-E2的SDS-PAGE結(jié)果。其中，泳道I為經(jīng)層析純化后復(fù)性至PBS中的A-L-E2，泳道2為經(jīng)沸水煮10分鐘的泳道I的A-L-E2樣品。結(jié)果顯示，經(jīng)過兩步層析純化后，A-L-E2的純度可達(dá)到90%以上。圖4顯示了使用實(shí)施例2中構(gòu)建的融合蛋白與HEV中和單抗8C11進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)的結(jié)果。泳道M:蛋白分子量標(biāo)記；泳道I:對照蛋白HEV-239;泳道2:對照蛋白E2,泳道3CRM197-L-E2;泳道4CRM197-L-E2s;泳道5:389-L_E2;泳道6389-L-E2s;泳道7:389_E2s;泳道8:A-L_E2;泳道9:A-L_E2s;泳道10:A_E2s。結(jié)果顯示，測試的所有融合蛋白與特異性中和單抗8C11均具有顯著的反應(yīng)性。圖5顯示了使用實(shí)施例2中構(gòu)建的融合蛋白與HEV特異性單抗進(jìn)行的間接法ELISA的結(jié)果。橫坐標(biāo)為用于ELISA的HEV特異性單抗或CRM197多抗血清，縱坐標(biāo)為同樣的抗體稀釋濃度下ELISA測定的OD讀值。圖5A顯示了包含E2的融合蛋白的ELISA結(jié)果，圖5B顯示了包含E2s的融合蛋白的ELISA結(jié)果。結(jié)果顯示，E2s蛋白與CRM197或其片段融合后，與HEV特異性單抗的反應(yīng)性顯著提高，其中A-L-E2S和A-E2S的反應(yīng)性提高最為顯著；E2蛋白與CRM197或其片段融合后，保留或提高了與HEV特異性單抗的反應(yīng)性。圖6顯示了使用蛋白A-L-E2、HEV-239或E2與HEV特異性單抗進(jìn)行的間接法ELISA的結(jié)果，其中截?cái)嘀?cutoff)定義為3倍陰性均值。結(jié)果顯示，A-L-E2與HEV特異性單抗的反應(yīng)性與HEV-239和E2蛋白相當(dāng)。圖7顯示了融合蛋白A-L-E2的沉降速率(SedimentationVelocity,SV)的分析結(jié)果。結(jié)果顯示，融合蛋白A-L-E2主要以二聚體形式存在，并且存在少量的四聚體。圖8顯示了實(shí)施例2中構(gòu)建的融合蛋白與HEV-239的免疫原性的比較。在0周時進(jìn)行初次免疫，在2周和4周時進(jìn)行加強(qiáng)免疫,初次免疫和加強(qiáng)免疫的劑量均為g或均為0.5iig。圖8A為5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結(jié)果，圖8B為0.5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結(jié)果。結(jié)果顯示，在5yg和0.5yg劑量組中，小鼠血清在第四周均發(fā)生抗HEV陽轉(zhuǎn)，并且抗體滴度在第五或六周時達(dá)到最高。特別地，在5yg劑量組中，使用A-L-E2獲得的抗體滴度最高，其在第6周時高達(dá)IO6;并且，各融合蛋白誘導(dǎo)的抗體滴度均高于HEV-239蛋白或與之相當(dāng)。在0.g劑量組中，各融合蛋白誘導(dǎo)的抗體滴度均顯著高于HEV-239，并且A-L-E2蛋白在第5周時誘導(dǎo)的抗體滴度高達(dá)106。此外，在5yg和0.5yg劑量組中，使用E2和E2s獲得的免疫血清均沒有發(fā)生陽轉(zhuǎn)。從以上結(jié)果可知，實(shí)施例2所構(gòu)建的各種融合蛋白的免疫原性均顯著高于單獨(dú)的抗原蛋白(E2和E2s)，這表明本發(fā)明的CRM197或其片段顯著增強(qiáng)了與其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子內(nèi)佐劑。圖9顯示了在實(shí)施例6中構(gòu)建的各種融合蛋白的克隆設(shè)計(jì)。其中，使用的接頭(Linker，在本申請中也簡寫為L)為10個氨基酸殘基的柔性片段，其序列為GGGGSGGGGS;使用的CRM197包含535個氨基酸，其序列示于SEQIDNO:2;389是指包含CRM197的第1-389位氨基酸殘基(aa1-389)的多肽；A是指包含CRM197的第1-190位氨基酸殘基(aa1-190)的多肽；M2是指流感病毒M2蛋白，其序列示于SEQIDNO:32；M2e是指包含流感病毒M2蛋白的第1-24位氨基酸殘基(aal-24)的多肽。圖10展示了實(shí)施例6中構(gòu)建的融合蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性的SDS-PAGE分析結(jié)果。其中，泳道M:蛋白分子量標(biāo)記。圖IOA使用的樣品為菌體超聲破碎后離心獲得的沉淀(即包涵體)和上清泳道I:從用CRM197-L-M2e轉(zhuǎn)化的菌體獲得的包涵體；泳道2:從用CRM197-L-M2e轉(zhuǎn)化的菌體獲得的上清；泳道3:從用389-L_M2e轉(zhuǎn)化的菌體獲得的包涵體；泳道4:從用389-L_M2e轉(zhuǎn)化的菌體獲得的上清；泳道5:從用A-L_M2e轉(zhuǎn)化的菌體獲得的包涵體；泳道6:從用A-L_M2e轉(zhuǎn)化的菌體獲得的上清。圖IOB使用的樣品為菌體超聲破碎后離心獲得的沉淀(即包涵體)和上清泳道I:從用M2e-L_A轉(zhuǎn)化的菌體獲得的包涵體；泳道2:從用M2e-L_A轉(zhuǎn)化的菌體獲得的上清；泳道3:從用M2e-L_389轉(zhuǎn)化的菌體獲得的包涵體；泳道4:從用M2e-L_389轉(zhuǎn)化的菌體獲得的上清；泳道5:從用M2e-L_CRM197轉(zhuǎn)化的菌體獲得的包涵體；泳道6:從用M2e-L-CRM197轉(zhuǎn)化的菌體獲得的上清。圖IOC使用的樣品為經(jīng)分離且復(fù)性至PBS中的融合蛋白，并且在進(jìn)行SDS-PAGE分析時，未使用P-巰基乙醇，且蛋白樣品經(jīng)煮沸處理(10分鐘)或者未經(jīng)煮沸處理泳道I:A-L_M2e蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道2A-L-M2e蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道3389-L-M2e蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道4389-L-M2e蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道5CRM197-L-M2e蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道6CRM197-L-M2e蛋白，經(jīng)煮沸處理的。圖IOD使用的樣品為經(jīng)分離且復(fù)性至PBS中的融合蛋白，并且在進(jìn)行SDS-PAGE分析時，使用了P-巰基乙醇，且蛋白樣品經(jīng)煮沸處理(10分鐘)或者未經(jīng)煮沸處理泳道I:A-L_M2e蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道2A-L-M2e蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道3389-L-M2e蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道4389-L-M2e蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道5CRM197-L-M2e蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道6CRM197-L-M2e蛋白，經(jīng)煮沸處理的。圖IOE使用的樣品為經(jīng)分離且復(fù)性至PBS中的融合蛋白，并且在進(jìn)行SDS-PAGE分析時，未使用P-巰基乙醇，且蛋白樣品經(jīng)煮沸處理(10分鐘)或者未經(jīng)煮沸處理泳道I:M2e-L_A蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道2M2e-L-A蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道3M2e-L-389蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道4M2e-L-389蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道5M2e-L-CRM197蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道6M2e-L-CRM197蛋白，經(jīng)煮沸處理的。圖IOF使用的樣品為經(jīng)分離且復(fù)性至PBS中的融合蛋白，并且在進(jìn)行SDS-PAGE分析時，使用了P-巰基乙醇，且蛋白樣品經(jīng)煮沸處理(10分鐘)或者未經(jīng)煮沸處理泳道I:M2e-L-A蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道2M2e-L-A蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道3M2e-L-389蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道4M2e-L-389蛋白，經(jīng)煮沸處理的；泳道5M2e-L-CRM197蛋白，未經(jīng)煮沸處理的；泳道6M2e-L-CRM197蛋白，經(jīng)煮沸處理的。圖10A-10F的結(jié)果顯示，所構(gòu)建的融合蛋白均可在包涵體中表達(dá)，并且經(jīng)純化和復(fù)性后，可獲得純度為80%左右的融合蛋白。圖11顯示了使用實(shí)施例6中構(gòu)建的融合蛋白與抗M2e單抗以及CRM197單抗1E6進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。其中，圖11A，11B,IlC和IlD的泳道1-6所代表的樣品分別對應(yīng)于圖10C，10D,IOE和IOF的泳道1-6所代表的樣品，且使用抗M2e特異性單抗OT1。圖he,HF,HG和iih的泳道1-6所代表的樣品分別對應(yīng)于圖ioc,iod,ioe和iof的泳道1-6所代表的樣品，且使用CRM197特異性單抗1E6。結(jié)果顯示，測試的所有融合蛋白與抗M2e特異性單抗以及CRM197特異性單抗1E6均具有顯著的反應(yīng)性。圖12顯示了使用實(shí)施例6中構(gòu)建的融合蛋白與各種抗M2e特異性單抗進(jìn)行的間接法ELISA的結(jié)果。橫坐標(biāo)為用于ELISA的抗M2e特異性單抗以及抗CRM197特異性單抗，縱坐標(biāo)為同樣的抗體稀釋濃度下ELISA測定的OD讀值。其中，圖12A顯示了M2e融合在CRM197或其片段的C端的融合蛋白的ELISA結(jié)果，圖12B顯示了M2e融合在CRM197或其片段的N端的融合蛋白的ELISA結(jié)果。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的M2e蛋白相比，包含M2e蛋白以及CRM197或其片段的融合蛋白，與各種抗M2e特異性單抗的反應(yīng)性保持不變或者顯著提高。圖13顯示了實(shí)施例6中構(gòu)建的各種融合蛋白的沉降速率的分析結(jié)果。其中，圖13ACRM197-L-M2e；圖13B:389-L_M2e；圖13C:A-L_M2e；圖13DM2e-L-CRM197;圖13E:M2e-L-389;圖13F:M2e-L_A。結(jié)果顯示，融合蛋白A_L_M2e和M2e_L_A主要以單體和四聚體的形式存在；389-L-M2e主要以二聚體和多聚體形式存在；M2e-L_389主要以單體和多聚體形式存；CRM197-L-M2e主要以二聚體和多聚體形式存在；和，M2e-L_CRM197主要以單體和多聚體形式存在。圖14顯示了實(shí)施例6中構(gòu)建的融合蛋白與GST_M2e的免疫原性的比較。在0周時進(jìn)行初次免疫，在2周和4周時進(jìn)行加強(qiáng)免疫,初次免疫和加強(qiáng)免疫的劑量均為g或均為0.5iig。圖14A為5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結(jié)果，圖14B為0.5iig劑量組的免疫血清的抗體滴度的比較結(jié)果。結(jié)果顯示，在5yg和0.5yg劑量組中，在第二次加強(qiáng)免疫后，各融合蛋白誘導(dǎo)的抗體滴度均顯著高于GST-M2e。從上述結(jié)果可知，實(shí)施例6所構(gòu)建的各種融合蛋白的免疫原性均顯著高于單獨(dú)的抗原蛋白(GST-M2e)，這表明本發(fā)明的CRM197或其片段(無論其是位于融合蛋白的N端，還是C端)顯著增強(qiáng)了與其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子內(nèi)佐劑。具體實(shí)施例方式現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來描述本發(fā)明。除非特別指明，本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測法，基本上參照J(rèn).Samtoook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及F.M.AusubeI等人,精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南,第3版，JohnWiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法進(jìn)行；限制性內(nèi)切酶的使用依照產(chǎn)品制造商推薦的條件。實(shí)施例中未注明來源的試劑均是本領(lǐng)域的常規(guī)試劑或市售可得的試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例I.CRM197基因的克隆以從購自ATCC(N053281)的白喉棒狀桿菌C7(@197)菌株中提取的基因組DNA作為模板，以CRM197F(SEQIDNO:19)為正向引物，CRM197R(SEQIDNO:20)為反向引物，在PCR儀(Biometra，T3)中按照如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而制備編碼CRM197的全長基因。9410變性10分鐘__I個循環(huán)_941C變性L5分鐘58C退火I.5分鐘20個循環(huán)72r延伸I.5分鐘721C延伸IQ分鐘__I個循琢_PCR擴(kuò)增后，得到大小特異的I.6kb左右的產(chǎn)物。經(jīng)測序獲得擴(kuò)增產(chǎn)物(S卩，CRM197全長基因)的核苷酸序列(SEQIDNO:I)，其編碼的氨基酸序列示于SEQIDN0:2。實(shí)施例2.包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白片段的融合蛋白的設(shè)計(jì)與克隆在本實(shí)施例中，示例性地構(gòu)建了表達(dá)融合蛋白的載體。所構(gòu)建的各種示例性融合蛋白的克隆設(shè)計(jì)參見圖I，其各自包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白片段，并且任選地使用接頭。使用接頭的融合蛋白的克隆以實(shí)施例I獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物(即，CRM197全長基因)為模板，以CRM197F(SEQIDNO:19)為正向引物(在其5’端引入限制性內(nèi)切酶NdeI位點(diǎn)CATATG,ATG為大腸桿菌系統(tǒng)中的起始密碼子)，并且分別以CRM197-linkerR(SEQIDNO:21)、389_linkerR(SEQIDNO:22)、A-IinkerR(SEQIDNO:23)為反向引物(在其5’端引入限制性內(nèi)切酶BamHI位點(diǎn)GGATCC)，在PCR熱循環(huán)儀(BiometraT3)中按照如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。所使用的引物的序列列于表I。權(quán)利要求1.一種融合蛋白，其包含CRM197或其片段以及目的蛋白，并且其中CRM197或其片段增強(qiáng)了目的蛋白的免疫原性，其中，例如，CRM197的片段可以包含，CRM197的A片段，轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域T，和/或受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域R;例如，CRM197片段可以包含A片段，或者A片段和轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域T；例如，CRM197片段可以包含CRM197的aa1-190，例如包含CRM197的aa1-389；例如，目的蛋白可以是JEV衣殼蛋白或其免疫原性片段；例如，HEV衣殼蛋白的免疫原性片段可以包含或者是HEV-239(HEV衣殼蛋白aa368-606)，E2(HEV衣殼蛋白aa394-606)或E2s(HEV衣殼蛋白aa455-606)；例如，目的蛋白可以是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段；例如，M2蛋白的免疫原性片段可以包含或者是M2e(M2蛋白aal_24)；例如，在所述融合蛋白中，CRM197或其片段可連接至目的蛋白的N端和/或C端，任選地使用接頭進(jìn)行連接；例如，所述融合蛋白可以包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接；例如，所述融合蛋白可以是具有SEQIDNO:4，6，8，10，12，14，16或18所示氨基酸序列的蛋白；例如，所述融合蛋白可以包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接；例如，所述融合蛋白可以是具有SEQIDNO:34，36，38，40，42或44所示氨基酸序列的蛋白。2.編碼權(quán)利要求I的融合蛋白的多核苷酸。3.包含權(quán)利要求2的多核苷酸的構(gòu)建體。4.包含權(quán)利要求2的多核苷酸或權(quán)利要求3的構(gòu)建體的載體,例如所述載體是表達(dá)載體。5.包含權(quán)利要求2的多核苷酸或權(quán)利要求3的構(gòu)建體或權(quán)利要求4的載體的宿主細(xì)胞或者生物體。6.一種藥物組合物或疫苗，其包含權(quán)利要求I的融合蛋白，任選地還包含藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。7.權(quán)利要求I的融合蛋白用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療能夠被所述目的蛋白預(yù)防和/或治療的疾病，例如，當(dāng)所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段(二者任選地使用接頭進(jìn)行連接)時，所述藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療HEV感染和與HEV感染相關(guān)的疾病例如戊型肝炎；例如，當(dāng)所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段(二者任選地使用接頭進(jìn)行連接)時，所述藥物組合物可用于預(yù)防和/或治療流感病毒感染和與流感病毒感染相關(guān)的疾病例如流感。8.預(yù)防和/或治療HEV感染或與HEV感染相關(guān)的疾病例如戊型肝炎的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求I的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，其中，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及HEV衣殼蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接。9.預(yù)防和/或治療流感病毒感染或與流感病毒感染相關(guān)的疾病例如流感的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求I的融合蛋白或包含所述融合蛋白的藥物組合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任選地使用接頭進(jìn)行連接。10.用于增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性的方法，其包括獲得包含權(quán)利要求I所定義的CRM197或其片段與所述目的蛋白的融合蛋白，從而增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性，例如，可任選地使用接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白；例如，所述目的蛋白是衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。11.權(quán)利要求I所定義的CRM197或其片段用于增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性的用途，其特征在于獲得包含CRM197或其片段與目的蛋白的融合蛋白，例如，可任選地使用接頭，將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達(dá)，從而獲得融合蛋白；例如，所述目的蛋白是衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。全文摘要本發(fā)明涉及分子病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197或其片段在融合蛋白中作為分子內(nèi)佐劑增強(qiáng)與其融合的目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本發(fā)明還涉及增強(qiáng)目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括將CRM197或其片段與目的蛋白融合表達(dá)，形成融合蛋白。本發(fā)明還涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如HEV衣殼蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增強(qiáng)了目的蛋白的免疫原性。本發(fā)明還涉及編碼所述融合蛋白的分離的核酸，包含所述核酸的構(gòu)建體和載體，以及包含所述核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述融合蛋白的用途，其用于制備藥物組合物或疫苗。文檔編號C12N1/19GK102807621SQ20121018139公開日2012年12月5日申請日期2012年6月1日優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日發(fā)明者李少偉,宋翠靈,楊春燕,顧穎,羅文新,夏寧邵申請人:廈門大學(xué),廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司