專利名稱：一種泰國筍殼魚和本地筍殼魚魚苗的鑒別引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)領(lǐng)域DNA標(biāo)記技術(shù)在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用，具體涉及應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對泰國笑殼魚(云斑尖塘鱧Arァe/eotris fflarffiorates)和本地笑殼魚(河川沙塘鱧(is potamophila)魚苗進(jìn)行鑒別。
背景技術(shù)：
云斑尖塘體(Arァ(^Zeotri1Smarmora tus )俗名泰國笑殼魚(Marble goby),屬魚盧形目(Pereifomes)、鰕虎魚亞目(Gobioidei)、塘鱧科(Eleotridae)、尖塘鱧屬
かむ)，是塘鱧科魚類中體型最大、生長最快的名貴淡水魚種。云斑尖塘鱧是原產(chǎn) 于泰國、越南、馬來西亞等東南亞國家，同時也是這些國家出口創(chuàng)匯的優(yōu)良品種之一。由于該魚具有花紋漂亮、味道鮮美、ロ感嫩滑，營養(yǎng)豐富等特點，深受我國沿海城市及港、澳、臺消費(fèi)者的歡迎。我國自上世紀(jì)八十年代從東南亞引種以來，現(xiàn)已成為我國南方沿海地區(qū)的重要淡水養(yǎng)殖對象。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，越冬成本的降低以及養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，該魚的養(yǎng)殖正在長江中下游省份等地興起，并有逐年擴(kuò)大和向北延伸的趨勢。河川沙塘體(is,隸屬于S盧形目(Perciformes)、鍛虎魚亞目(Gobioidei)、塘鱧科(Odontobutidae)、沙塘鱧屬，俗名塘鱧魚，也被江蘇等地的人們稱為本地筍殼魚，是ー種較為名貴的小型經(jīng)濟(jì)魚類。其主要分布于長江中、下游及沿江各支流，閩江水系，錢塘江水系，偶見黃河水系。河川沙塘鱧因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、肌間刺少，深受江浙、滬、閩等地人們的喜愛。同時，該魚也是江蘇省特色水產(chǎn)業(yè)中具有良好發(fā)展前景的魚類品種之一。由于云斑尖塘鱧和河川沙塘鱧各具特色，并且市場需求量與日俱增，所以江蘇等地兩種魚的養(yǎng)殖規(guī)模也在逐年擴(kuò)大，苗種需求量也隨之大幅度的増加，但隨之而來的是苗種的來源問題。由于云斑尖塘鱧和河川沙塘鱧在魚苗階段相似度十分高，即使是養(yǎng)殖經(jīng)驗豐富的漁民用肉眼也很難將其分辨開來。所以，在經(jīng)濟(jì)利益的趨勢下，國內(nèi)筍殼魚苗種市場魚龍混雜。云斑尖塘鱧為我國從東南亞國家引進(jìn)品種，個體雖大，但耐寒能力遠(yuǎn)不及河川沙塘鱧，且在水溫低于10度的野外條件下難以存活，而河川沙塘鱧則多為野生，家養(yǎng)則需要對其進(jìn)行馴化，且最大個體僅為200g左右，目前，該魚在長江下游省份人工規(guī)模化繁育成功，且養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大。若養(yǎng)殖者不慎將品種搞錯，勢必造成后期處理不當(dāng)，如此ー來，對養(yǎng)殖戶造成的經(jīng)濟(jì)損失將不可估量。因此，在養(yǎng)殖前景廣闊但魚苗市場混雜的背景下，迫切需要一種將兩種筍殼魚魚苗鑒別開來的技術(shù)，避免養(yǎng)殖失誤發(fā)生在源頭?；蚪M中的微衛(wèi)星DNA以孟德爾方式遺傳，呈共顯性表達(dá)，且同時具有分布廣、遺傳信息含量高和便于PCR檢測等優(yōu)點，已被廣泛用于魚類親緣關(guān)系鑒定、遺傳多祥性分析、遺傳連鎖圖構(gòu)建及系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究。研究表明，微衛(wèi)星側(cè)翼序列在屬內(nèi)種間和有較近親緣關(guān)系的屬間相當(dāng)保守，而且在基因組中有部分微衛(wèi)星位點在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的分類群間也有一定保守性。微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性使得在某一物種中開發(fā)出的微衛(wèi)星引物應(yīng)用于相關(guān)的近緣物種成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供ー種泰國筍殼魚和本地筍殼魚魚苗的鑒別方法。借助分子手段(I對微衛(wèi)星引物)快速將兩種魚苗鑒別開，避免因為苗種選取不當(dāng)給養(yǎng)殖戶帶來經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明的基本原理是(1)用高效磁珠富集法大量開發(fā)云斑尖塘鱧微衛(wèi)星引物；(2)從所開發(fā)引物中選取在云斑尖塘鱧群體中能夠穩(wěn)定擴(kuò)增且不具有多態(tài)性的數(shù)對微衛(wèi)星引物用于河川沙塘鱧群體的擴(kuò)增；(3)篩選出在河川沙塘鱧群體中亦能明顯擴(kuò)增，但擴(kuò)增條帶位置明顯不同于云斑尖塘鱧的微衛(wèi)星引物，用于云斑尖塘鱧和河川沙塘鱧魚苗的鑒別。本發(fā)明篩選出ー對種用于泰國筍殼魚和本地筍殼魚魚苗鑒別的引物，命名為H228,引物序列如下
FTCCAATCAGGCAGTAAGCAG (SEQ ID No. 8)；
RGGGACATCAGGACCAACTCT (SEQ ID No. 9)。用上述H228引物鑒別泰國笑殼魚和本地笑殼魚魚苗的方法，包括下列步驟
(1)用H228引物對待鑒別樣本進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；
(2)用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，EB染色，250bp大小條帶的為泰國筍殼魚，300bp大小條帶的為本地筍殼魚；
本發(fā)明所述的H228引物是按照以下步驟獲得的I.基因組DNA的提取(云斑尖塘鱧群體、河川沙塘鱧群體)；2.磁珠富集法篩選云斑尖塘鱧微衛(wèi)星微點；3.篩選在云斑尖塘鱧群體中呈單態(tài)位點；4.用單態(tài)位點引物擴(kuò)河川沙塘鱧群體；5.篩選出I對在兩個群體均能穩(wěn)定擴(kuò)增，且片段大小明顯不同的引物，用于云斑尖塘鱧和河川沙塘鱧魚苗的鑒別。所述步驟1，基因組DNA的提取包括剪取實驗魚的尾鰭0. ro. 2g，采取常規(guī)酚-氯法提取基因組DNA ;核酸蛋白測定儀測定其純度及濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。所述步驟2，磁珠富集法篩選云斑尖塘鱧微衛(wèi)星微點將云斑尖塘鱧基因組DNA經(jīng)Bspl43 I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后連接接頭，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行磁珠富集，富集產(chǎn)物經(jīng)克隆后對陽性克隆測序。所述步驟3，篩選在云斑尖塘鱧群體中呈單態(tài)位點對測序結(jié)果中含有微衛(wèi)星微點的序列進(jìn)行引物設(shè)計，引物合成后在云斑尖塘鱧群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選，選出只擴(kuò)增出一條清晰條帶，即呈現(xiàn)單態(tài)的微衛(wèi)星引物。所述步驟4，用單態(tài)位點引物擴(kuò)河川沙塘鱧群體用篩選出來的引物對河川沙塘鱧群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增過程中，退火溫度、MgCl2濃度等條件與云斑尖塘鱧群體擴(kuò)增完全相同。所述步驟5，篩選出在兩個群體均能穩(wěn)定擴(kuò)增，且片段大小明顯不同的引物，用于云斑尖塘鱧和河川沙塘鱧魚苗的鑒別用1%瓊脂糖凝膠電泳同時檢測云斑尖塘鱧群體和河川沙塘鱧群體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選出能夠?qū)υ瓢呒馓流k群體和河川沙塘鱧群體進(jìn)行鑒別的微衛(wèi)星引物。本發(fā)明所獲得的微衛(wèi)星引物H228 (退火溫度51°C)，在云斑尖塘鱧群里和河川沙塘鱧群體中均能穩(wěn)定擴(kuò)増，結(jié)果穩(wěn)定，條帶清晰，只需用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測就可看到、明顯差異，且操作簡單方便，成本低，實用強(qiáng)，對養(yǎng)殖生產(chǎn)很有幫助。


圖I :H13在云斑尖塘鱧群體中擴(kuò)增的部分結(jié)果(聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選單態(tài)引物)
圖2 H228微衛(wèi)星標(biāo)記在部分云斑尖塘鱧群體和河川沙塘鱧群體中的擴(kuò)增結(jié)果(瓊脂糖凝膠電泳篩選鑒別引物)
具體實施例方式I.基因組DNA的提取(云斑尖塘鱧群體、河川沙塘鱧群體):
I)取實驗魚的尾鰭0. I 0. 3g加入450i! L DNA抽提緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, 75 mmol/L NaCl)，混勻后依次加入SDS和蛋白酶K至終濃度分別為0. 5%和200吒/mL，然后于55°C水浴消化過夜。2)加入等體積飽和苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)、氯仿/異戊醇(24:1)各抽提一次。每次抽提均輕柔混合10分鐘后，4°C，12000rpm離心20分鐘，取上清。3)將所得上清液加入2. 5 mo I/L NaCl (終濃度為0. 2 mol/L)和預(yù)冷的2倍體積的無水こ醇沉淀，12000rpm離心20分鐘取沉淀；用70%こ醇漂洗2次后在室溫下自然干燥，待こ醇揮發(fā)后溶于200 y L的TE中，置于4°C冰箱備用。在核酸蛋白測定儀上測定其純度及濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.磁珠富集法篩選云斑尖塘鱧微衛(wèi)星微點
I)將云斑尖塘鱧基因組DNA經(jīng)ガ印7ぬI四種粘末端限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切反應(yīng)。篩選出酶切片段主要分布在400-1200bp范圍的酶切體系。酶切體系基因組DNA 8呢，IOXbuffer 4ML，內(nèi)切酶5U，總體積40ML。反應(yīng)條件為37°C恒溫水浴5h，酶切結(jié)束后65°C水浴20分鐘終止反應(yīng)。取5ML酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測。使用Axygen公司的AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。2)將回收的DNA兩端接上磷酸化接頭Linker A，接頭序列為
Linker A 5，-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3’ (SEQ ID No. I)
3，-CGCCATGGGCCCTTCGAACCCTAG-p-5’ (SEQ ID No. 2)
接頭長鏈粘末端(5’端)帶磷酸根。取酶切后回收DNA 14ML，加入Linker A(100剛)2ML，連接buffer 2ML，T4連接酶，總體積20ML，16°C連接過夜。連接產(chǎn)物經(jīng)AxyPr印DNA試劑盒回收，去除多余的接頭，使用40ML洗脫液洗脫，取5ML電泳檢測。3)剩余的洗脫液用于Pre-PCR，一共作10管PCR，每個反應(yīng)管中加入IOXTaqbuffer 2ML，dNTP (2mM)lML，MgCl2 (25mM)l. 5ML，引物 Primer I (10剛)1ML，Taq 酶 1U，模板 DNA3. 5ML，總體積為 20ML。Primer I 的序列為5’-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG_3’ (SEQ IDNo. 3)。PCR反應(yīng)為12個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸60s。反應(yīng)結(jié)束后取少量預(yù)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測。剩余約200ML反應(yīng)液經(jīng)AxyPr印DNA試劑盒回收，洗脫于40ML的洗脫液中。4)生物素探針與文庫雜交，鏈霉素磁珠富集及Post-PCR 取全部40ML的DNA洗脫液，加ddH20 460ML，將反應(yīng)管置于95°C水浴變性5分鐘；同時將50剛的生物素探針Biotin (CA)3ML加入另ー EP管中，并加入20XSSC (8. 8g NaCl，4. 4g檸檬酸鈉，配置成IOOmL溶液，調(diào)節(jié)pH 7. 2后滅菌)13ML，68°C預(yù)熱，加入完成變性步驟的DNA溶液并繼續(xù)68°C保溫雜交10分鐘，之后放置室溫冷卻。生物素探針Biotin (CA)的序列如下Biotin-5，-ATAGAATATCACACACACACACACACACACACACACACACA-3’ (SEQ ID No. 4)用磁珠(Promega)進(jìn)行片段富集，磁珠使用前需要洗滌輕彈管底，懸浮磁珠，利用磁架Separation Stand收集,棄溶液；往管中加入300ML 0. 5 X SSC,輕彈管底混勻，磁架收集后棄溶液(洗滌3次)；加入100ML 0. 5XSSC并重懸磁珠待用。在洗滌完畢的磁珠管中加入全量雜交好的DNA溶液，每1-2分鐘顛倒混勻一次，混勻5-10次；利用磁架收集磁珠，/吸出溶液留存(防止磁珠失效造成實驗失敗，如Post-PCR反應(yīng)失敗可用此留存溶液與新磁珠反應(yīng))，使用300ML0. IXSSC洗滌磁珠，洗滌4次，最后一次盡可能吸盡溶液；加入100MLddH20，重懸磁珠，95°C水浴5分鐘，利用磁架收集磁珠，將DNA溶液轉(zhuǎn)入新管；利用真空干燥儀或烘箱將100MLDNA液濃縮至20ML左右。Post-PCR—共作 5 管，每個反應(yīng)管中加入 IOXTaq buffer 2ML，dNTP (2mM) lML，MgCl2 (25mM) I. 5ML，引物 Primer I (10剛)1ML，Taq 酶 1U，模板 DNA 4ML，總體積為 20ML。PCR反應(yīng)為12個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸60s。PCR反應(yīng)液取少量瓊脂糖電泳檢測，其余經(jīng)AxyPr印DNA試劑盒回收，洗脫于40ML的洗脫液中并使用核酸蛋白儀測量DNA濃度。3.篩選在云斑尖塘鱧群體中呈單態(tài)位點
I)根據(jù)所得DNA的濃度，調(diào)節(jié)外源DNA與T載體的比例載體DNA與插入片段摩爾數(shù)之比范圍為I :2-10。連接體系為:外源DNA 1-4ML，T載體(0. 03pmol)lML，連接buffer 5ML，總體積10ML，16°C連接過夜。2)將全量IOML連接液加入100ML DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘；42°C熱激60s后立即冰上放置I分鐘；加入900ML LB培養(yǎng)基，37°C IOOrpm震蕩培養(yǎng)60分鐘；取100ML 菌液均勻鋪在含有 X-gal (40ML，20mg/mL)、IPTG (7ML，200mg/mL)、Amp (終濃度 60吒/mL)的90mL瓊脂平板上，待液體被瓊脂板完全吸收后，37°C培養(yǎng)12-15小時；挑取單個白色菌落，接種于500ML含有60Pg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm振蕩培養(yǎng)3小吋。3)使用M13和RV-M引物做菌液PCR，檢測細(xì)菌克隆是否含有插入片段，反應(yīng)條件為 IOXTaq buffer 1ML，dNTP (2mM) 0. 5ML，MgCl2 (25mM) 0. 8ML，引物+ (10 剛)0. 3ML，弓 I物-(10剛)0. 3ML，Taq酶0. 5U，菌液0. 5ML，總體積為10ML。PCR反應(yīng)為25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s。瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取擴(kuò)增片段400-1200bp范圍的陽性克隆做二次PCR篩選。M13 5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，(SEQ ID No. 5)
RV-M :5’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ (SEQ ID No. 6)
4)二次篩選采用M13、RV-M引物中的一條與PrimerII-CA組成ー對引物，一共兩個組合M13 + PrimerII-CA, RV-M + PrimerII-CA。反應(yīng)條件為 IOXTaq buffer 1ML，dNTP(2mM)0. 5ML，MgCl2 (25mM)0. 8ML，引物 + (10剛)0. 3ML，引物-(10剛)0. 3ML，Taq 酶 0. 5U，菌液0. 5ML，總體積為10ML。PCR反應(yīng)為25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s。瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取出現(xiàn)擴(kuò)增片段的對應(yīng)菌液送生物公司測序。PrimerII-CA :5，-CACACACACACACACACACACACA-3’ (SEQ ID No. 7)5)用Primer 5. O對含有微衛(wèi)星位點的序列設(shè)計引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物合成后用于云斑尖塘鱧群體PCR擴(kuò)增。體系為10 X Taq buffer 2ML，dNTP(2mM) 2ML，MgCl2 (25mM) I. 5ML，引物 + (10剛)1ML，引物-(10剛)1ML，Taq 酶 1U，模板DNAmL,加滅菌雙蒸水補(bǔ)足20ML體系。PCR程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，退火30sec，72°C延伸30sec，反應(yīng)30個循環(huán)，最后7°C延伸5min。6) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，功率80W，電泳I. 5h，硝酸銀染色，相機(jī)拍照，篩選出在云斑尖塘鱧群體中呈單態(tài)的多對微衛(wèi)星引物，以H13為例，效果如圖I所 4.用單態(tài)位點弓丨物擴(kuò)河)11沙塘鱧群體
用上一步篩選出來的微衛(wèi)星引物對河川沙塘鱧群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件和體系與在云斑尖塘鱧群體中完全相同，即體系為10XTaq buffer 2ML，dNTP (2mM)2ML，MgCl2(25mM) I. 5ML，引物+ (10剛)1ML，引物-(10剛)1虬，Taq酶1U，模板DNA1ML，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足20ML體系。PCR程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，退火30sec，72°C延伸30sec，反應(yīng)30個循環(huán)，最后TC延伸5min。雖然微衛(wèi)星側(cè)翼序列具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，但由于河川沙塘鱧與云斑尖塘鱧不屬于同屬魚類，仍有部分引物無法在河川沙塘鱧群體中擴(kuò)增。5.篩選出I對在兩個群體均能穩(wěn)定擴(kuò)增，且片段大小明顯不同的引物，用于云斑尖塘鱧和河川沙塘鱧魚苗的鑒別將在兩個群體中均有穩(wěn)定擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，篩選出條帶清晰，位置明顯不同，能夠用于云斑尖塘鱧和河川沙塘鱧魚苗的鑒別的一對微衛(wèi)星引物，命名為H228，引物序列如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示。H228微衛(wèi)星標(biāo)記在云斑尖塘鱧群體和河川沙塘鱧群體中的擴(kuò)增結(jié)果如圖2，250bp大小的為泰國筍殼魚，300bp大小的為本地筍殼魚。
權(quán)利要求
1.一種用于泰國筍殼魚和本地筍殼魚魚苗鑒別的引物，其特征在于所述引物序列如下FTCCAATCAGGCAGTAAGCAG ；R:GGGACATCAGGACCAACTCT。
2.ー種泰國筍殼魚和本地筍殼魚魚苗的鑒別方法，其特征在于，包括下列步驟 (1)用權(quán)利要求I所述引物對待鑒別樣本進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物； (2)用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，EB染色，250bp大小條帶的為泰國筍殼魚，300bp大小條帶的為本地筍殼魚。
全文摘要
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)領(lǐng)域DNA標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對泰國筍殼魚(云斑尖塘鱧Oxyeleotrismarmoratus)和本地筍殼魚(河川沙塘鱧Odontobutispotamophila)魚苗進(jìn)行鑒別。本發(fā)明的一對引物序列如SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示。鑒定時用上述引物對待鑒別樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，EB染色，250bp大小條帶的為泰國筍殼魚，300bp大小條帶的為本地筍殼魚；本發(fā)明所獲得的微衛(wèi)星引物，在云斑尖塘鱧群里和河川沙塘鱧群體中均能穩(wěn)定擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定，條帶清晰，且操作簡單方便，成本低，實用性強(qiáng)。
文檔編號C12N15/11GK102653795SQ20121015819
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者尹紹武, 朱曉平, 祝斐, 胡亞麗 申請人:南京師范大學(xué)