專利名稱：一種獲取α-亞麻酸的內(nèi)生菌發(fā)酵工藝技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然食藥原料的制備技術(shù)及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及的是α-亞麻酸原料的制備技術(shù)與方法。
背景技術(shù)：
α -亞麻酸，學名 9,12,15-十八碳三烯酸(cis 9,12,15-oc-tadecatrienoicacid)，為全順式，非共軛立體構(gòu)型，分子式為C18H3tlO2,性狀為淡黃色油狀液體。α -亞麻酸作為人體必需脂肪酸，是體內(nèi)各組織生物膜的結(jié)構(gòu)材料，也是合成人體一系列前列腺素的前體。正常人體從食物中攝取α-亞麻酸后，經(jīng)Λ6-脫氫酶、碳鏈延長酶等的作用，生成一系列代謝產(chǎn)物，其中最重要的是ΕΡΑ(全順式-5，8，11，14，17-二十二碳五烯酸)和DHA (全順式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。EPA是體內(nèi)三烯前列腺素(如PGI3，TXA3)前體，DHA是大腦、視網(wǎng)膜等神經(jīng)系統(tǒng)磷脂的主要成分。當人體攝取過量飽和酸或出現(xiàn)其它代謝紊亂時，體內(nèi)的△ 6-脫氫酶受到抑制，從而影響亞麻酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生。近年來，通過國內(nèi)外大量的研究和流行病學調(diào)查顯示，α -亞麻酸不僅是維持大腦和神經(jīng)功能必需的因子，同時具有降血脂、預(yù)防和治療冠心病、動脈硬化、某些癌癥的發(fā)生以及抗氧化、清除自由基等功能，是當前的研究熱點之一。因此，及時補充α-亞麻酸對保證體內(nèi)正常代謝和保持健康具有重要意義。正常人體需每日平均攝取α -亞麻酸約I. 5g。然而，醫(yī)學和營養(yǎng)學家根據(jù)膳食結(jié)構(gòu)的流行病學調(diào)查證實，目前人群日攝入量不足世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦量(1.25g)的一半，提示人類普遍缺乏α-亞麻酸。對此，WHO和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)曾于1993年發(fā)表聯(lián)合聲明鑒于α-亞麻酸的重要性和人類普遍缺乏的現(xiàn)狀，決定在世界范圍內(nèi)專項推廣膳食補充α-亞麻酸。但迄今為止α-亞麻酸不能人工合成，其人體中α-亞麻酸來源的唯一途徑只能依賴從自然食物中攝入，如各種含有α-亞麻酸的籽油等。但與之矛盾主要問題一是α -亞麻酸主要存在于豆科類植物的種籽中，其分離和提純工藝技術(shù)非常困難，且成本很高；二是食物中α-亞麻酸含量指數(shù)、結(jié)合狀態(tài)和體內(nèi)吸收等因素不清，難以制訂膳食中α -亞麻酸含量SOP ;三是全球每年食品、醫(yī)藥對高純度α -亞麻酸原料的需求量缺額高達2千噸。由此可見，探討和創(chuàng)建高純度α-亞麻酸原料的制備工藝技術(shù)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為食品和醫(yī)藥提供α-亞麻酸原料，并通過如下制備工藝實現(xiàn)其目標，以滿足市場的巨大需求。為實現(xiàn)上述目的，采用的工藝技術(shù)策略是外植體發(fā)菌，單克隆菌株發(fā)酵液培養(yǎng)，篩選α -亞麻酸高產(chǎn)量菌株，高產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)獲得原料液，分離富集α -亞麻酸。
具體實施方案
I、外植體發(fā)菌取流水沖凈藿香莖桿、葉片若干，蒸餾水沖洗后，浸于70 %乙醇中30s，再浸于
O.I % HgCl2溶液中浸泡5min。取出后經(jīng)無菌水沖洗三遍，剪成莖段、葉片塊，將創(chuàng)口貼于培養(yǎng)基，接種到MS固體培養(yǎng)基上23°C避光發(fā)菌5d 15d ;生成大量菌落，取菌落直徑3cm左右備用。2、單克隆菌株發(fā)酵液培養(yǎng)分別從直徑3cm以上的菌群邊緣，用接種環(huán)挑取菌絲，并接種于PDA液體培養(yǎng)基，230C，120rpm暗培養(yǎng)5d 15d，獲得基因一致的單克隆菌液。3、篩選α-亞麻酸高產(chǎn)量菌株通過高效液相色譜法檢測內(nèi)生菌單克隆發(fā)酵液中α-亞麻酸含量。色譜條件與系統(tǒng)使用性試驗用固定相為C18柱(4.6mmX200mm，5ym);流動相為乙腈I %醋酸溶液(90 10);檢測波長為205nm ;流速為I. Oml/min ;柱溫25°C;進樣量20 μ L，理論塔板數(shù)按α -亞麻酸峰計算應(yīng)不少4000。對照品溶液的制備精密量取α -亞麻酸標準品適量，用乙腈1%醋酸溶液(9 I)制成每Iml含O. 5mg的溶液，即得。供試品溶液的制備，取內(nèi)生菌發(fā)酵液2ml置于IOml的容量瓶中，用流動相進行定容，超聲處理20分鐘，從IOml容量瓶中取Iml定容到10ml，再從上步取2. 5ml置于5ml的容量瓶中，用流動相定容。測定法，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀進行檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，從大量候選菌株中篩選得到α-亞麻酸高產(chǎn)量菌株。4、高產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)獲得原料液高產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)獲得原料液將篩選得到α -亞麻酸高產(chǎn)量菌株接種到到液體PDA培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，23°C、120rpm。在液體培養(yǎng)過程中應(yīng)注意及時進行繼代培養(yǎng)，因為在有限的營養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)物生長到一定時期將進入分裂的靜止期。通常在培養(yǎng)到第18d 25d時達到最大密度，此時可以收獲原料液，并應(yīng)進行第一次繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)時，應(yīng)將較大的團塊和接種物殘渣除去。5、分離富集α -亞麻酸 SFE CO2超臨界萃取將所得發(fā)酵液裝入萃取釜，進行超臨界CO2萃取。萃取壓力為32Mpa，萃取溫度為45°C ;分離壓力為5 lOMpa，分離溫度為35°C ；C02流量為80L/h，萃取3h。將超臨界萃取液與丙酮以I : 10的比例混合攪拌lh，60°C冷凍8h，分離得到清液與膏狀物。將清液與膏狀物分別減壓蒸餾回收丙酮溶劑，獲得純度不低于80%的α-亞麻酸原料。
權(quán)利要求
1.一種獲取α-亞麻酸的內(nèi)生菌發(fā)酵工藝技術(shù)，其特征是 (1)外植體發(fā)菌取流水沖洗干凈的藿香莖桿、葉片若干，蒸餾水沖洗后，浸于70%乙醇中30s，再浸于O. 1% HgCl2溶液中浸泡5min。取出后經(jīng)無菌水沖洗三遍，剪成莖段、葉片塊，將創(chuàng)口貼于培養(yǎng)基，接種到MS固體培養(yǎng)基上23 °C避光發(fā)菌5d 15d ;生成大量菌落，取菌落直徑3cm左右備用； (2)單克隆菌株發(fā)酵液培養(yǎng)分別從直徑3cm以上的菌群邊緣，用接種環(huán)挑取菌絲，并接種于PDA液體培養(yǎng)基，230C，120rpm暗培養(yǎng)5d 15d，獲得基因一致的單克隆菌液； (3)篩選α-亞麻酸高產(chǎn)量菌株通過高效液相色譜法檢測內(nèi)生菌單克隆發(fā)酵液中α-亞麻酸含量。色譜條件與系統(tǒng)使用性試驗用固定相為C18柱(4. 6mmX 200mm，5 μ m)；流動相為乙腈I %醋酸溶液(90 10);檢測波長為205nm ;流速為I. Oml/min ;柱溫25。。;進樣量20 μ L，理論塔板數(shù)按α -亞麻酸峰計算應(yīng)不少4000。對照品溶液的制備精密量取α -亞麻酸標準品適量，用乙腈1%醋酸溶液(9 I)制成每Iml含O. 5mg的溶液，即得。供試品溶液的制備，取內(nèi)生菌發(fā)酵液2ml置于IOml的容量瓶中，用流動相進行定容，超聲處理20分鐘，從IOml容量瓶中取Iml定容到10ml，再從上步取2. 5ml置于5ml的容量瓶中，用流動相定容。測定法，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀進行檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，從大量候選菌株中篩選得到α-亞麻酸高產(chǎn)量菌株； (4)高產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)獲得原料液將篩選得到α-亞麻酸高產(chǎn)量菌株接種到到液體PDA培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，230C、120rpm。在液體培養(yǎng)過程中應(yīng)注意及時進行繼代培養(yǎng)，因為在有限的營養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)物生長到一定時期將進入分裂的靜止期。通常在培養(yǎng)到第18d 25d時達到最大密度，此時可以收獲原料液，并應(yīng)進行第一次繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)時，應(yīng)將較大的團塊和接種物殘渣除去； (5)分離和富集α-亞麻酸將所得發(fā)酵液裝入萃取釜，進行超臨界CO2萃取。萃取壓力為32Mpa，萃取溫度為45°C ;分離壓力為5 lOMpa，分離溫度為35°C ；C02流量為80L/h，萃取3h;將超臨界萃取液與丙酮以I : 10的比例混合攪拌lh，60°C冷凍8h，分離得到清液與膏狀物。將清液與膏狀物分別減壓蒸餾回收丙酮溶劑，獲得純度不低于80%的α-亞麻酸原料。
2.由權(quán)利要求I制備成α-亞麻酸原料，α -亞麻酸作為人體必需脂肪酸，是體內(nèi)各組織生物膜的結(jié)構(gòu)材料，也是合成人體一系列前列腺素的前體。是維持大腦和神經(jīng)功能必需的因子，同時具有降血脂、預(yù)防和治療冠心病、動脈硬化、某些癌癥的發(fā)生以及抗氧化、清除自由基等功能。
全文摘要
本發(fā)明是一種獲取α-亞麻酸的內(nèi)生菌發(fā)酵工藝技術(shù)，主要通過如下制備工藝實現(xiàn)其目標取洗凈的藿香莖稈、葉片若干，經(jīng)70％乙醇和0.1％HgCl2溶液消毒，剪成塊，將創(chuàng)口貼于培養(yǎng)基，接種到固體培養(yǎng)基23℃避光發(fā)菌5d～15d；從發(fā)菌所得菌群中挑取單克隆，接種于PDA液體培養(yǎng)基，23℃，120rpm暗培養(yǎng)5d～15d，獲得基因一致的單克隆菌群發(fā)酵液；應(yīng)用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中α-亞麻酸含量，以挑選生產(chǎn)α-亞麻酸高含量的菌株；之后通過理化誘變，獲得生產(chǎn)高產(chǎn)量高純度α-亞麻酸菌株。將此菌株進行液體培養(yǎng)，18d～25d收獲發(fā)酵液；對發(fā)酵液進行超臨界CO2萃??；再將超臨界萃取液與丙酮以一定比例混合攪拌1h，60℃冷凍8h，分離得到清液與膏狀物。將清液與膏狀物分別減壓蒸餾回收丙酮溶劑，獲得純度高于80％的α-亞麻酸。
文檔編號C12P7/64GK102643877SQ20121014685
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者王劍波, 王四旺, 謝艷華, 邱鵬程 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學