專利名稱：食品及加工品中蘿卜源性成分pcr檢測(cè)引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對(duì)食品加工品中植物源成分一蘿卜進(jìn)行快速篩選與檢測(cè)的引物，蘿卜源成分快速檢測(cè)具體的是針對(duì)蘿卜特異性基因所用引物進(jìn)行DNA檢查。應(yīng)用該引物能夠擴(kuò)增出食品及食品加工品中摻加的蘿卜源性成分，反應(yīng)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。
背景技術(shù)：
蘿卜是一種質(zhì)脆味美的蔬菜，具有辛辣氣味，屬于十字花科。在食品未加工前，根據(jù)形態(tài)很容易將蘿卜和其他物種進(jìn)行鑒別，但食品在進(jìn)行加工處理后中，往往失去可鑒別的形態(tài)特征，一些企業(yè)為了節(jié)約成本以次充好甚至摻雜相近成分，經(jīng)多次混合加工后消費(fèi)者難以目測(cè)辨別食品是否已摻加了蘿卜。食品中是否混有蘿卜源性成分，沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的判定方法或標(biāo)準(zhǔn)，降低消費(fèi)者的生活質(zhì)量。2010年9月，韓國(guó)駐華大使館向國(guó)家質(zhì)檢總局有關(guān)部門通報(bào)了我國(guó)輸韓蒜泥制品中有摻雜蘿卜原料進(jìn)行加工的情況，輸韓蒜泥制品中有檢出蘿卜成分摻假。為保障消費(fèi)者權(quán)益，避免出現(xiàn)用蘿卜進(jìn)行摻假的情況，需要開發(fā)一種快速有效的檢測(cè)蘿卜的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)蘿卜中orf B基因設(shè)計(jì)一組特異性引物，建立一種快速篩選和檢測(cè)蘿卜中基因成分PCR檢測(cè)方法，克服基于外部形態(tài)或蛋白的檢測(cè)方法在蘿卜等深加工產(chǎn)品檢測(cè)中的局限性，為食品加工品中可能含蘿卜的產(chǎn)品檢測(cè)提供有效工具，確保產(chǎn)品標(biāo)簽的一致性，保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益。本發(fā)明的主要原理為設(shè)計(jì)一組可以特異的識(shí)別蘿卜序列的兩個(gè)引物，通過(guò)普通PCR反應(yīng)在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到IO9 IOltl拷貝。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判別。本發(fā)明涉及的PCR擴(kuò)增檢測(cè)用的蘿卜引物，其序列如下(I)上游引物5，-TCACCTGGGCATTCTTTC-3 ；(2)下游引物5’ -CTGACTTCGITCGTTAGAAG-3’ ；在實(shí)際應(yīng)用中，上游引物、下游引物體積比為1 I。使用上述引物，檢測(cè)可能含有蘿卜源性食品加工產(chǎn)品中蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)(I)待檢樣品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿提取法或使用相同提取方法的DNA提取試劑盒。(2) PCR 擴(kuò)增A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入dNTP 2 u LUOXBuffer 2. 5 U L ；10 u mol/L 上游引物 0. 5 ii L、10 u mol/L 下游引物 0. 5 y L、Taq 酶 0. 5 y L、待檢樣品 DNA2 ii L (約200ng)、ddH20 (滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至總體積25u I,混勻；
B.在普通PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)35-40個(gè)循環(huán)，程序?yàn)?40C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)結(jié)果檢測(cè)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，制備濃度I %的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將混有上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物，加入樣品孔中，并用DL2000Marker分子質(zhì)量標(biāo)記,進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后,在凝膠成像系統(tǒng)的紫外投射光下觀察IOObp處是否有擴(kuò)增儲(chǔ)預(yù)期的特異性條帶拍攝并記錄。


用PCR技術(shù)檢測(cè)某待測(cè)含蘿卜樣品DNA，樣品的電泳圖譜。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(I)待測(cè)可能含蘿卜成分混合樣品DNA的提取A.稱取0. Ig樣品，轉(zhuǎn)至I. 5mL離心管中。加入600 U L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 u L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L緩沖液,上下顛倒混勻10次；E.取出離心柱，將離心柱放置在I個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加A 200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；G.在離心柱中加入200ii L70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個(gè)新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50ii L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。(2)待測(cè)含蘿卜成分混合樣品PCR擴(kuò)增A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入 dNTP 2 U LUOXBuffer 2. 5 ii L ;10 ii mol/L 上游弓丨物 0. 5 ii LUO u mol/L 下游引物 0. 5 y L、Taq 酶 0. 5 y L、待檢樣品 DNA2 y L(約 200ng)、ddH20(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至總體積25 u 1，混勻；B.在普通PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)35_40個(gè)循環(huán)程序?yàn)?40C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)結(jié)果檢測(cè)
根據(jù)濃度約I %的瓊脂糖電泳條帶進(jìn)行判斷，待測(cè)樣品的擴(kuò)增條帶片段大小在lOObp，陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常 ，判斷為樣品中檢出蘿卜基因。
權(quán)利要求
1. 一種蘿卜源性成分快速檢測(cè)用的上游引物和下游引物，其特征在于上游引物序列 rad F :5，-TCA CCT GGG CAT TCT TTC-3，；下游引物序列 rad R:5，-CTG ACT TCG TTC GTTAGAAG-3’。
全文摘要
本發(fā)明屬于蘿卜源性成分基因快速篩查與檢測(cè)技術(shù)，具體地是用于檢測(cè)蘿卜基因orfB片段的引物組。本發(fā)明針對(duì)orfB基因根據(jù)其保守區(qū)，設(shè)計(jì)特異性引物。使用該對(duì)引物采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，可快速、靈敏、特異地檢測(cè)蘿卜源性基因，從而篩選產(chǎn)品中是否含食品及加工品中是否含有植物源成分蘿卜。該引物也可以試劑盒的形式和其他試劑一起提供，用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102732611SQ201210142309
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月1日
發(fā)明者劉彩霞, 孫敏, 徐彪, 林超, 梁成珠, 高宏偉 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心