專利名稱：一種南美蟛蜞菊總rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菊科植物總RNA提取的優(yōu)化方法，適用于南美蟛蜞菊等富含多糖、酚類化合物植物組織總RNA的提取，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
從植物組織中提取高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)研究的必要前提和關(guān)鍵。很多植物組織中富含多糖、酚類等次生代謝物質(zhì)，造成RNA在提取過(guò)程中氧化、褐化和降解，不利于RNA的分離和純化。針對(duì)普通多糖、酚類含量低的植物材料，Trizol類方法產(chǎn)品便可以提取，但ー些多糖，多酚及次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的植物組織，采用普通的提取方法并不能得到高質(zhì)量的RNA，常殘留大量的多糖、多酚和ー些次級(jí)代謝產(chǎn)物。細(xì)胞在破碎后能釋放很多的酚類物質(zhì)，這些酚類物質(zhì)極易被氧化成褐色物質(zhì)而與RNA發(fā)生不可逆結(jié)合。而多糖的許多理化性質(zhì)由于與RNA極為相似而很難將兩者分開(kāi)，一方面在去除多糖的同時(shí)，很容易將RNA也裹攜帶走，造成RNA提取量減少；另一方面在沉淀RNA吋，多糖和RNA易混合產(chǎn)生凝膠狀沉淀，由于多糖能抑制許多酶的活性，被多糖污染的RNA樣品很難用于進(jìn)ー步的分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)和研究。由此看來(lái)，能否在RNA的提取過(guò)程中有效抑制或去除多糖，酚類等次生代謝物是提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。南美蟛蜞菊是菊科蟛蜞菊屬植物，全年常緑，花朵淡雅，著生緊簇，景觀效果極佳，加之生性粗放，繁殖容易，是華南地區(qū)的重要雜草和園林綠化植物。目前對(duì)于南美蟛蜞菊的研究主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖特性、藥用價(jià)值及對(duì)其他ー些植物化感作用的生理生化機(jī)理等方面，而對(duì)其分子水平上的研究較少。隨著植物功能基因組學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和手段對(duì)重要的雜草和園林綠化植物進(jìn)行遺傳改造已成為當(dāng)前的ー個(gè)研究熱點(diǎn)。因而，對(duì)這些重要園林綠化植物的分子水平的研究，如構(gòu)建cDNA文庫(kù)、Northern雜交、RT-PCR等就顯得十分重要，甚至可以運(yùn)用轉(zhuǎn)基因的方法對(duì)南美蟛蜞菊的花色進(jìn)行遺傳改造，培育具有不同花色的新品種，使其擁有更高的觀賞價(jià)值，從而更好地發(fā)揮其作為地被、造景植物的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種富含多糖多酚類植物總RNA的高效提取方法，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，能獲得高質(zhì)量的RNA，為進(jìn)行植物分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明所提供的提取南美蟛蜞菊總RNA的方法，按照以下步驟進(jìn)行
I)取O. 5^1. Og新鮮的南美蟛蜞菊葉片在液氮中充分研磨至細(xì)粉狀，并快速轉(zhuǎn)移到裝有I. 5^2mL預(yù)冷RNA提取緩沖液的離心管中，振蕩混勻后于65°C水浴30mirT60min。2)加入1.5 2mL氯仿，上下顛倒離心管混勻，4 °C，1200(Tl4000r/min，離心IOmin 15min。3)從上層水相中轉(zhuǎn)移900 1200uL至另ー離心管中，加入300 400uL 8mol/L的LiCl 溶液，混勻后，_20°C沉淀過(guò)夜；4°C，1200(Tl4000r/min，離心 30mirT60min，棄上清，カロΛ 500ulTE 溶解。4)加入 500uL 氯仿，上下顛倒混勻，4°C, 12000 14000r/min,離心 10min 15min。5)轉(zhuǎn)移400uL上層水相至新的離心管中，加入400uLこ醚，并劇烈震蕩混勻，4°C，12000 14000r/min，離心 IOmin 15min。6)將300uL上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入IOOuL 3mol/LNaAc (ρΗ5· 2)和750uL 無(wú)水こ醇，-50°C放置 30min 60min。7) 4°C, 12000 14000r/min 離心 IOmin 15min,棄上清，收集沉淀。8)沉淀用ImL 70% 80% (體積百分濃度)こ醇洗滌兩次，4°C，800(Tl0000r/min離 心，棄上清，室溫下自然干燥。9)用滅菌的DEPC水溶解沉淀，_80°C保存?zhèn)溆?。其中所述的RNA提取緩沖液每IOOmL中含有IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL500mM EDTA pH8. 0,2% (質(zhì)量體積百分濃度)的CTAB，O. HmolNaCl，2% 3% (體積百分濃度)β-巰基こ醇，O. 5mol ニ硫蘇糖醇(DTT)，2°/Γ4% (質(zhì)量體積百分濃度)聚こ烯吡咯烷酮(PVP)0其中所述的溶劑氯化鋰(LiCl)、醋酸鈉(NaAc)、TE緩沖液用O. 1%的焦碳酸ニこ酯(DEPC)水配制，滅菌。其中所述的70°/Γ80%的こ醇用滅菌后的O. 1%的DEPC水配制。
本發(fā)明的方法優(yōu)點(diǎn)是特別適合一些多糖、酚類等次生代謝物質(zhì)含量豐富的植物材料。利用CTAB抽提緩沖液來(lái)提取南美蟛蜞菊組織的RNA，是鑒于菊科植物中含有大量多糖和酚類等次生代謝物質(zhì)。在采取CTAB法裂解南美蟛蜞菊細(xì)胞并除去其組織碎片后利用LiCl選擇性地沉淀RNA，以除去其他物質(zhì)對(duì)RNA提取和純度的干擾，以獲得高質(zhì)量的RNA樣品。


圖I為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)南美蟛蜞菊組織總RNA的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
1.實(shí)驗(yàn)藥品的配制
配制 RNA 提取緩沖液(IOOmL) : IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL 500mM EDTA pH8. 0,2%(質(zhì)量體積百分濃度)的CTAB，0. 14mol NaCl，2°/T3% (體積百分濃度)β -巰基こ醇，O. 5molニ硫蘇糖醇(DTT)，2°/Γ4% (質(zhì)量體積百分濃度)聚こ烯吡咯烷酮(PVP)。8mol/L 的 LiCl (O. 1% 的 DEPC 水配制)
TE緩沖液(O. 1%的DEPC水配制)
3mol/LNaAc (O. 1% 的 DEPC 水配制)
70% 80%こ醇(用滅菌后的O. 1%的DEPC水配制)
2.實(shí)驗(yàn)用品處理
實(shí)驗(yàn)所用的所有陶瓷玻璃器皿，離心管及槍頭等均用O. 1%的DEPC水37°C浸泡過(guò)夜，120°C高壓滅菌Ih以上。65°C烘干備用。電泳槽，制膠板及加樣梳均用2. 59Γ3. 5%的雙氧水浸泡處理。
實(shí)驗(yàn)步驟
I)取O. 5g新鮮的南美蟛蜞菊葉片在液氮中充分研磨至細(xì)粉狀，并快速轉(zhuǎn)移到裝有
1.5mL預(yù)冷RNA提取緩沖液的離心管中，振蕩混勻后于65°C水浴30min。2)加入I. 5mL氯仿,上下顛倒離心管混勻,4°C, 12000r/min,離心lOmin。3)從上層水相中轉(zhuǎn)移900uL至另ー離心管中，加入300uL 8mol/L的LiCl溶液，混勻后，_20°C沉淀過(guò)夜；4°C，12000r/min，離心30min，棄上清，加入500ulTE溶解。4)加入500uL氯仿，上下顛倒混勻，4°C, 12000r/min,離心lOmin。5)轉(zhuǎn)移400uL上層水相至新的離心管中，加入400uLこ醚，并劇烈震蕩混勻，4°C，12000r/min,離心 IOmin06)將300uL上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入IOOuL 3mol/LNaAc (ρΗ5· 2)和·750uL無(wú)水こ醇，-50°C放置30min。7) 4°C, 12000r/min 離心 lOmin,棄上清，收集沉淀。8)沉淀用ImL 70% (體積百分濃度)こ醇洗漆兩次,4°C, 8000r/min離心,棄上清，
室溫下自然干燥。. RNA樣品純度和完整性的檢測(cè)
用兩種方法檢測(cè)紫外吸收光譜檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(I)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所抽提的南美蟛蜞菊RNA樣品在 230nm、260nm 和 280nm 處的吸光光度值 A23tl=O. 031、A260=O. 068、A280=O. 035. A260A280 值為I. 94，A260A230值為2. 19。一般RNA的A260/A280的值在I. 8—2. O之間，且越接近于
2.O, RNA的純度越高；A260/A230的值大于2. 0，表明所提RNA樣品沒(méi)有鹽類污染，RNA純度較聞。(2)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)用I. 0%的含EB的瓊脂糖凝膠，在120V的電壓下電泳15min。15min后關(guān)閉電泳儀開(kāi)關(guān),在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。圖I電泳圖結(jié)果顯示三條RNA條帶，分別為28S、18S、5S。28S與18S的寬度和亮度比接近2 : 1，5S帶的亮度則比較淺，并且沒(méi)有DNA的污染，說(shuō)明按上述方法所提取的RNA質(zhì)量較好，達(dá)到純度要求。與其他方法相比，所提取的南美蟛蜞菊的RNA發(fā)生降解和DNA殘留情況都不明顯，RNA質(zhì)量高，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2
1.實(shí)驗(yàn)藥品的配制
配制 RNA 提取緩沖液(IOOmL) : IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL 500mM EDTA pH8. 0,2%(質(zhì)量體積百分濃度)的CTAB，0. 14mol NaCl，2°/T3% (體積百分濃度)β -巰基こ醇，O. 5molニ硫蘇糖醇(DTT)，2°/Γ4% (質(zhì)量體積百分濃度)聚こ烯吡咯烷酮(PVP)。8mol/L 的 LiCl (O. 1% 的 DEPC 水配制)
TE緩沖液(O. 1%的DEPC水配制)
3mol/LNaAc (O. 1% 的 DEPC 水配制)
70% 80%こ醇(用滅菌后的O. 1%的DEPC水配制)
2.實(shí)驗(yàn)用品處理
實(shí)驗(yàn)所用的所有陶瓷玻璃器皿，離心管及槍頭等均用O. 1%的DEPC水37°C浸泡過(guò)夜，120°C高壓滅菌Ih以上。65°C烘干備用。電泳槽，制膠板及加樣梳均用2. 59Γ3. 5%的雙氧水浸泡處理。實(shí)驗(yàn)步驟
I)取I. Og新鮮的南美蟛蜞菊葉片在液氮中充分研磨至細(xì)粉狀，并快速轉(zhuǎn)移到裝有2mL預(yù)冷RNA提取緩沖液的離心管中，振蕩混勻后于65°C水浴60min。2)加入2mL氯仿,上下顛倒離心管混勻，4°C, 14000r/min,離心15min。3)從上層水相中轉(zhuǎn)移1200uL至另ー離心管中，加入400uL 8mol/L的LiCl溶液，混勻后，_20°C沉淀過(guò)夜；4°C，14000r/min，離心60min，棄上清，加入500ulTE溶解。4)加入500uL氯仿，上下顛倒混勻，4°C, 14000r/min,離心15min。
5)轉(zhuǎn)移400uL上層水相至新的離心管中，加入400uLこ醚，并劇烈震蕩混勻，4°C，14000r/min,離心 15min。6)將300uL上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入IOOuL 3mol/LNaAc (ρΗ5· 2)和750uL無(wú)水こ醇，-50°C放置60min。7) 4°C, 14000r/min 離心 15min,棄上清，收集沉淀。8)沉淀用ImL 80% (體積百分濃度)こ醇洗滌兩次，4°C，10000r/min離心，棄上
清，室溫下自然干燥。本發(fā)明中CTAB是ー種較強(qiáng)的陽(yáng)離子去污劑，在高離子強(qiáng)度的溶液中能與蛋白質(zhì)、多聚糖形成復(fù)合物，而不能沉淀核酸，通過(guò)抽提能將核酸從蛋白、多糖等雜質(zhì)中分離出來(lái)。緩沖液中的EDTA能螯合Mg2+等金屬離子，從而抑制RNase的活性。β -巰基こ醇和ニ硫蘇糖醇(DTT)—方面能抑制RNase和酚類氧化酶的活性，同時(shí)作為抗氧化劑，可以與酚類競(jìng)爭(zhēng)性氧化，有效防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚類在提取過(guò)程中更易被除去。聚こ烯吡咯烷酮(PVP)能與酚類形成一種不溶的的絡(luò)合物，有效地去除多酚，減少酚類對(duì)RNA的影響；同時(shí)也能與多糖結(jié)合，去除多糖。Li+能將步驟ー種未被氧化的酚類化合物去除，同時(shí)將部分多糖留在上清液中，使RNA更易沉淀。NaAc能選擇性沉淀RNA,而不沉淀多糖和蛋白質(zhì)等,達(dá)到進(jìn)ー步使RNA和蛋白質(zhì)、多糖分離的效果。在提取RNA的過(guò)程中，防止RNA的降解是關(guān)鍵的一歩，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用ー些變性劑使RNA酶失活，防止酚類氧化，如β -巰基こ醇、ニ硫蘇糖醇(DTT)、聚こ烯吡咯烷酮(PVP)等。こ醚能夠使混雜在RNA中的多糖在離心后分布于有機(jī)相，以達(dá)到分離多糖和RNA的目的。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于RNA很容易降解，故實(shí)驗(yàn)操作盡可能在低溫下進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.ー種南美蟛蜞菊總RNA的方法，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行 I)取O. 5^1. Og新鮮的南美蟛蜞菊葉片在液氮中充分研磨至細(xì)粉狀，并快速轉(zhuǎn)移到裝有I. 5^2mL預(yù)冷RNA提取緩沖液的離心管中，振蕩混勻后于65°C水浴30mirT60min ； 2)加入I.5 2mL氯仿，上下顛倒離心管混勻，4で，1200(Tl4000r/min，離心IOmin 15min ； 3)從上層水相中轉(zhuǎn)移90(Tl200uL至另ー離心管中，加入30(T400uL8mol/L的LiCl溶液，混勻后，-20°C沉淀過(guò)夜；4°C, 12000 14000r/min,離心30min 60min,棄上清，加入500ulTE 溶解；4)加入500uL氯仿，上下顛倒混勻，4°C,12000 14000r/min,離心10min 15min ； 5)轉(zhuǎn)移400uL上層水相至新的離心管中，加入400uLこ醚，并劇烈震蕩混勻，4°C，12000min 14000r/min,離心 IOmin 15min ； 6)將300uL上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入IOOuLpH5. 2的3mol/LNaAc和750uL無(wú)水こ醇，-50°C放置30mirT60min ；7)4°C, 12000 14000r/min 離心 10min 15min,棄上清，收集沉淀； 8)沉淀用ImL體積百分濃度為70% 80%こ醇洗滌兩次，4°C，800(Tl0000r/min離心，棄上清，室溫下自然干燥； 9)用滅菌的DEPC水溶解沉淀，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種南美蟛蜞菊總RNA的方法，其特征在于其中所述的RNA提取緩沖液每 IOOmL 中含有IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL 500mM EDTA pH8. 0，質(zhì)量體積百分濃度為2%的CTAB，0. 14molNaCl，體積百分濃度2% 3% β -巰基こ醇，O. 5mol ニ硫蘇糖醇，質(zhì)量體積百分濃度2°/Γ4%，聚こ烯吡咯烷酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種南美蟛蜞菊總RNA的方法，其特征在于其中所述的溶劑氯化鋰、醋酸鈉、TE緩沖液用O. 1%的焦碳酸ニこ酯水配制，滅菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種南美蟛蜞菊總RNA的方法，其特征在于其中所述的70% 80%的こ醇用滅菌后的O. 1%的DEPC水配制。
全文摘要
本發(fā)明一種南美蟛蜞菊總RNA的提取方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。將新鮮的南美蟛蜞菊材料用液氮研磨成細(xì)粉狀，65℃溫浴30分鐘后加入等體積的氯仿混勻，4℃低溫離心。加入LiCl溶液進(jìn)行沉淀，離心棄上清，用TE溶解沉淀后加入等體積的氯仿，離心，取上清至新的離心管中，加入乙醚離心取上清，重復(fù)乙醚操作兩次后，再加入NaAc和無(wú)水乙醇沉淀RNA。離心后棄上清，用70%的乙醇洗滌一次，獲得的沉淀室溫下干燥，用滅菌的DEPC水溶解，-80℃中保存?zhèn)溆?。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，設(shè)備和實(shí)驗(yàn)條件要求低，結(jié)果準(zhǔn)確、有效，重復(fù)性好，對(duì)于富含酚類、多糖的植物組織總RNA的提取具有重要的指導(dǎo)和實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102676502SQ20121013105
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者付衛(wèi)國(guó), 杜道林, 楊冉, 田遠(yuǎn)飛, 薛永來(lái), 黃萍 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)