專利名稱：產(chǎn)脲酶微生物及其固化地基中重金屬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物及其固化重金屬技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及產(chǎn)脲酶微生物及其固化地基中重金屬的方法。
背景技術(shù)：
重金屬污染是指由于人類的生產(chǎn)和活動，致使環(huán)境中重金屬含量明顯高于其背景值，由于重金屬離子具有長期滯留和不可降解的特性，對生態(tài)環(huán)境造成了極大破壞。隨著大規(guī)模的城市擴張和建設(shè)，許多建筑物建設(shè)在廢棄的工廠及垃圾場附近，地基中重金屬污染嚴(yán)重。重金屬元素能通過食物鏈最終進入生物體內(nèi)，破壞生物體正常的新陳代謝，嚴(yán)重危害人體健康，已成為不可忽視的環(huán)境問題。傳統(tǒng)的重金屬處理方法主要包括化學(xué)沉淀法、離子交換法、蒸發(fā)濃縮法、電解法、活性炭和硅膠吸附法和膜分離法等，但這些方法存在去除不徹底、費用昂貴、產(chǎn)生有毒污泥 或其他廢料等缺點。因此，研究與開發(fā)高效環(huán)保型的重金屬處理技術(shù)和工藝成為研究的熱點之一 O現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，使微生物治理重金屬污染逐漸受到重視。微生物處理法是利用細菌、真菌、藻類等生物材料及其生命代謝活動去除和/或積累重金屬，從而降低土壤環(huán)境中重金屬離子的濃度。同傳統(tǒng)處理技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢，如其處理成本低，處理效果好，生化處理后污染物殘留量可達到很低水平，因而該技術(shù)成為最有發(fā)展?jié)摿褪袌銮熬暗男迯?fù)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供產(chǎn)脲酶微生物及其固化地基中重金屬的方法，采用本發(fā)明微生物固化地基中重金屬，具有固化時間短、效果好、成本低，且不會對環(huán)境造成二次污染。為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是產(chǎn)脲酶微生物圓孢芽孢八疊球菌Sporosarcina antarctica UR53、韓國芽孢八疊球菌 Sporosarcina koreensis UR47、芽抱八疊球菌 Sporosarcina sp. UR31 以及遲緩芽孢桿菌Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC No. 5916、CGMCC No. 5915、CGMCC No. 5913、CGMCC No. 5914，該保藏中心簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。所述的產(chǎn)服酶微生物Sporosarcinaantarctica UR53>Sporosarcina koreensisUR47>Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacillus lentus UR41 均呈捕圓桿狀，有芽抱，無英膜，革蘭氏陽性。在NH4-YE即酵母提取物20g/L，硫酸銨10g/L平板上，菌落呈圓形，表面濕潤光滑，邊緣整齊，菌落大小為l_2mm，菌落呈淡黃色，該菌在4°C -37°C的培養(yǎng)基溫度及pH7_9. 5的范圍下均能生長。
產(chǎn)脲酶微生物固化地基中重金屬的方法，包括如下步驟步驟I :將微生物 Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31以及Bacillus lentus UR41單個菌落分別在25°C _37°C條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)12-60小時得到六種菌液；步驟2 :向步驟I得到的六種菌液中分別加入濃度為O. 01-2mol/L的反應(yīng)液尿素溶液，菌液體積與尿素溶液體積比為I : 1-1 : 20,再將加入反應(yīng)液尿素溶液的菌液分別加入到含重金屬濃度為O. lg/L-5g/L的重金屬溶液中形成混合溶液,重金屬溶液與含反應(yīng)液尿素溶液的菌液體積比為I : 1-1 100，使混合溶液中形成微生物-重金屬絮凝體，進而生成不溶于水的重金屬碳酸鹽。步驟I所述微生物Sporosarcina pasteurii來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection),編號為 ATCCl 1859 ;所述微生物 Terrabacter tumescens來自于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,編號為AS. I. 2690步驟I所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括酵母提取物10_20g/L，硫酸銨或氯化銨10g/L，pH為7-9. 5。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點I、從已有產(chǎn)脲酶菌株、土樣和水樣中篩選能固化重金屬的微生物，并對未知菌進行分子鑒定，為獲得可有效治理重金屬污染的微生物菌株提供候選資源；2、尿素在微生物所產(chǎn)生的脲酶的作用下，分解為銨根和二氧化碳，同時使細菌周圍PH升高，促使溶液中形成微生物-重金屬絮凝體，進一步生成不溶于水的重金屬碳酸鹽，從而使重金屬離子被固化；具有重金屬污染固化治理的時間短，效果好，在48小時之內(nèi)就可以使重金屬離子固化率達到90%以上；3、所用的營養(yǎng)液的成本低；4、本發(fā)明中所利用微生物為地基(土壤)中本身存在的微生物或其中某種微生物的培養(yǎng)物，營養(yǎng)物質(zhì)也為天然物質(zhì)，不會對環(huán)境造成二次污染。


圖I為依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的產(chǎn)脲酶菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2為培養(yǎng)菌株的生物量(用OD6tltl值表示)及脲酶活性，橫坐標(biāo)為不同種類的產(chǎn)脲酶菌株，縱坐標(biāo)為生物量及脲酶活性。圖3為對不同種類重金屬的沉淀移除率，橫坐標(biāo)為不同的種類的產(chǎn)脲酶菌株，縱坐標(biāo)重金屬的固化移除率。圖4為重金屬沉淀曲線，橫坐標(biāo)為時間，以小時為單位，縱坐標(biāo)重金屬的固化移除率。圖5為重金屬的固化物的掃描電鏡照片；其中圖5a為重金屬鎳的固化物的掃描電鏡照片；圖5b為重金屬銅的固化物的掃描電鏡照片；圖5c為重金屬鉛的固化物的掃描電鏡照片；圖5d為重金屬鈷的固化物的掃描電鏡照片；
圖5e為重金屬鋅的固化物的掃描電鏡照片；圖5f為重金屬鎘的固化物的掃描電鏡照片。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例產(chǎn)脲酶具有固化重金屬能力菌株的分離篩選I、樣品采集Sporosarcina pasteurii 來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American typeculture collection),編號為 ATCCl 1859, Terrabacter tumescens來自于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為AS. I. 2690。2、產(chǎn)脲酶菌株的分離和篩選產(chǎn)脲酶菌株分離自清華大學(xué)花圃采集土壤樣品。細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性，顯紅色。本實驗利用這一特性，將試驗樣品先在37°C、5M高濃度尿素條件下富集培養(yǎng)24 h后，殺死不能耐受和利用高濃度尿素的各種微生物營養(yǎng)體細胞，再將處理后的培養(yǎng)液進行梯度稀釋，涂布脲酶篩選培養(yǎng)平板，37°C下培養(yǎng)，挑取使培養(yǎng)基顏色變紅的菌株，劃線分離單菌落，獲得的微生物為產(chǎn)脲酶微生物，并利用16S rDNA方法進行鑒定，分別命名為Sporosarcinaantarctica UR53，Sporosarcina koreensis UR47，Sporosarcina sp. UR31, Bacilluslentus UR41 ;圖I為依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的產(chǎn)脲酶菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。產(chǎn)脲酶菌株的培養(yǎng)基重金屬固化I、菌株培養(yǎng)配制發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物10_20g/L，硫酸銨或氯化銨10g/L，pH為7-9. 5，將IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500ml培養(yǎng)瓶中滅菌,分別從平板中挑取單個菌落Sporosarcina pasteurii、 Terrabacter tumescens、 Sporosarcina antarctica UR53、 Sporosarcinakoreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacillus lentus UR41 分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C溫度下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150rpm-250rpm。培養(yǎng)16小時后收集菌液，檢測六種菌液的生物量(用0D_值表示)和脲酶活性，檢測結(jié)果如圖2所示。2、重金屬的固化分別取六種菌液1ml，加入等體積O. 5mol/L的尿素溶液制成混合溶液，每種菌液制備六種平行樣，再將體積為2ml的混合溶液分別加入到體積為O. 5ml，濃度為2g/L的重金屬溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2以及CdCl2中，結(jié)果表明，所有產(chǎn)脲酶菌株對以上六種重金屬的固化去除率都在88%以上，UR47對銅和鉛的固化去除率最高，UR31對鈷和鋅的固化去除率最高，Terrabacter tumescens對鎳和鎘的固化去除率最高,結(jié)果如圖3所示。在實驗中還分別取菌液Sporosarcina koreensis UR47>Sporosarcina sp.UR31、Terrabacter tumescens,分別加入不同濃度的尿素溶液,菌液體積與尿素溶液體積比分別為I : 1，1 10,1 20，使尿素終濃度為O. 25mol/L，取含尿素溶液的Sporosarcinakoreensis UR47溶液的兩個試樣，分別加入濃度為O. 5g/L的銅溶液，濃度為5g/L的鉛溶液，兩個試樣分別與銅溶液和鉛溶液的體積比為I : 10和I : 100;取含尿素溶液的Sporosarcina sp. UR31溶液的兩個試樣，分別加入鈷和鋅溶液，取含尿素溶液的Terrabacter tumescens溶液的兩個試樣,分別加入鎳和鎘溶液，金屬溶液的濃度和體積比與Sporosarcina koreensis UR47和金屬溶液加入相同。結(jié)果表明在不同的菌液、尿素、重金屬離子濃度條件下，重金屬離子的沉積率都在88%以上。3、重金屬固化速率分別分析Sporosarcina koreensis UR47 對銅和鉛，Sporosarcina sp. UR31 對鈷和鋅，Terrabacter tumescens對鎳和鎘的固化去除率隨時間的變化,結(jié)果如圖4所示,這六種重金屬的固化過程均主要發(fā)生在加入菌液的前20分鐘，在48小時達到最大值。對所形成重金屬固化物的分析I、重金屬固化物的分析對沉淀物質(zhì)進行XRD分析，所形成的重金屬固化物均為重金屬碳酸鹽。對沉淀物 進行電鏡觀察，結(jié)果如圖5所示，其中圖5a，圖5d是重金屬Ni和Co固化物，呈六面體狀，邊長10-40 μ m ;圖5b，圖5f是重金屬Cu和Cd的固化物，呈球狀，直徑5_10 μ m ;圖5c和圖5e是重金屬Pb和Zn的固化物，呈針狀長度在20-50 μ m。2、重金屬固化物的耐酸性質(zhì)分析微生物所形成的重金屬固化物，暴露于空氣中，會受到環(huán)境中酸雨的威脅，因此，需要檢測其耐酸性質(zhì)。用一系列pH值的硫酸來測試所形成重金屬固化物的耐酸性質(zhì)，pH值分別為0. 5,1. O, I. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O, and 5.5。從 pH 5.5 的硫酸開始測試，滴一滴硫酸到粘結(jié)的砂柱上，用放大鏡仔細觀察兩分鐘，觀察是否有氣泡生成。如果沒有氣泡生成，則可以耐受此PH的酸，然后用下一個pH值的硫酸繼續(xù)實驗，直到有氣泡生成，則耐酸能力為產(chǎn)生氣泡的前一個硫酸的pH值。結(jié)果見表1，六種重金屬固化物的耐受酸pH值均為2. 0，能在酸雨環(huán)境中穩(wěn)定存在。表I重金屬固化物的耐酸實驗結(jié)果(+ :無氣泡產(chǎn)生-:有氣泡產(chǎn)生)
權(quán)利要求
1.產(chǎn)服酶微生物Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及Bacillus lentus UR41 已于2012年3月 16 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC No. 5916,CGMCC No. 5915、CGMCC No. 5913,CGMCC No. 5914，該保藏中心簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的產(chǎn)脲酶微生物Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacillus lentus UR41 均呈橢圓桿狀，有芽孢，無莢膜，革蘭氏陽性。在NH4-YE即酵母提取物20g/L，硫酸銨10g/L平板上，菌落呈圓形，表面濕潤光滑，邊緣整齊，菌落大小為l_2mm，菌落呈淡黃色，該菌在40C _37°C的培養(yǎng)基溫度及pH7-9. 5的范圍下均能生長。
3.產(chǎn)脲酶微生物固化地基中重金屬的方法，其特征在于包括如下步驟 步驟 I :將微生物 Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacilluslentus UR41單個菌落分別在25°C _37°C條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)12-60小時得到六種菌液； 步驟2 向步驟I得到的六種菌液分別中加入濃度為0. 01-2mol/L的反應(yīng)液尿素溶液，菌液體積與尿素溶液體積比為I : 1-1 : 20,再將加入反應(yīng)液尿素溶液的菌液分別加入到含重金屬濃度為0. lg/L-5g/L的重金屬溶液中形成混合溶液,重金屬溶液與含反應(yīng)液尿素溶液的菌液體積比為I : 1-1 100，使混合溶液中形成微生物-重金屬絮凝體，進而生成不溶于水的重金屬碳酸鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟I所述微生物Sporosarcinapasteurii來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection),編號為ATCCl 1859 ;所述微生物Terrabacter tumescens來自于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為AS. I. 2690
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟I所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括酵母提取物10-20g/L，硫酸銨或氯化銨10g/L，pH為7-9. 5。
全文摘要
產(chǎn)脲酶微生物Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC No.5916、CGMCC No.5915、CGMCC No.5913、CGMCC No.5914，所述產(chǎn)脲酶微生物固化地基中重金屬的方法，將上述四種微生物及微生物Sporosarcina pasteurii和Terrabacter tumescens發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得到菌液，向菌液中加入反應(yīng)液尿素，然后加入到含重金屬的溶液中形成混合溶液使混合溶液中形成微生物-重金屬絮凝體，進而生成不溶于水的重金屬碳酸鹽；采用本發(fā)明微生物固化地基中重金屬的方法，具有固化時間短、效果好、成本低，且不會對環(huán)境造成二次污染。
文檔編號C12R1/07GK102703341SQ201210120838
公開日2012年10月3日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者李萌, 程曉輝, 郭紅仙 申請人:清華大學(xué)