專利名稱：美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及斑潛蠅的有關(guān)特異引物的鑒定方法，具體來說是美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法。
背景技術(shù)：
美洲斑潛蜆L. sativae Blanchard又名蔬菜斑潛蜆、美洲甜瓜斑潛蜆、苜猜斑潛蠅，1938年在阿根廷首次被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在我國(guó)29個(gè)省、自治區(qū)和直轄市分布，如海南、廣東、 福建、湖北、湖南、浙江、安徽、四川、河南、山東、北京等，對(duì)我國(guó)的瓜果蔬菜、棉花、煙草、花卉等造成了嚴(yán)重的危害，并逐漸成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的一個(gè)突出問題。美洲斑潛蠅的食性為雜食性，寄主范圍廣，可危害葫蘆科、茄科、豆科、十字花科等40余科110多種蔬菜瓜果。該蟲主要以幼蟲為害,成蟲擴(kuò)散能力不強(qiáng),主要吸取植株葉片汁液,成蟲產(chǎn)卵于植物葉片內(nèi)，幼蟲在葉脈間取食葉片正面葉肉組織并形成先細(xì)后寬的非常彎曲、縱橫交錯(cuò)的蛇形潛道，潛道兩側(cè)有黑色排糞線。植株受害后會(huì)導(dǎo)致葉片光和作用下降或脫落，果實(shí)發(fā)育不良，造成減產(chǎn)。南美斑潛蜆L. huidobrensis (Blanchard)又名拉美斑潛蜆，原產(chǎn)于南美洲，1993 年在我國(guó)云南首次被報(bào)道，現(xiàn)已蔓延至云南、貴州、湖北、四川、重慶、福建、山東、北京、陜西、陜西及內(nèi)蒙古等地，對(duì)我國(guó)的花卉及蔬菜危害嚴(yán)重。該蟲食性為雜食性，可危害葫蘆科、 茄科、豆科、十字花科、傘形科、菊科等約40科140多種植物。該蟲成蟲和幼蟲均可危害植株，雌蟲通過在葉片刺孔形成刻點(diǎn)取食及產(chǎn)卵，雄蟲不形成刻點(diǎn)，但可通過雌蟲形成的刻點(diǎn)取食，造成植株光和作用下降。幼蟲潛食葉肉，但與美洲斑潛蠅幼蟲不同的是，南美斑潛蠅幼蟲主要沿葉脈潛食，其次潛食葉脈間葉肉并形成較寬較直潛道。三葉草斑潛蜆L. trifolii (Burgess)又名三葉斑潛蜆、非洲菊斑潛蜆，原產(chǎn)于北美洲。1998年首先在臺(tái)灣省被發(fā)現(xiàn)，大陸地區(qū)于2005年12月在廣東省中山市首次發(fā)現(xiàn)，后于2006年4月在海南省被報(bào)道，后又于2008年7月在江蘇省泰興市被報(bào)道，是我國(guó)重要的檢疫性有害生物之一。三葉草斑潛蠅是典型的雜食性昆蟲，寄主范圍包括葫蘆科、茄科、豆科、十字花科、傘形科、菊科、錦葵科等20多科300余種植物。該蟲幼蟲在葉片和葉柄中取食，形成彎彎曲曲的潛道，雌蟲在葉片上取食形成缺刻并最終形成白色斑點(diǎn)，該蟲對(duì)農(nóng)作物的危害與美洲斑潛蠅與南美斑潛蠅類似。這三種斑潛蠅為口岸經(jīng)常截獲斑潛蠅屬種類，其中三葉草斑潛蠅為進(jìn)境檢疫性有害生物，但由于形態(tài)極其相似，給快速鑒定帶來了一定的困難。因此，研究這三種斑潛蠅的特異引物，對(duì)于我們?cè)诳诎吨袑?duì)于截獲的斑潛蠅進(jìn)行快速鑒定具有重要意義。傳統(tǒng)鑒定斑潛蠅的研究方法包傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)方法鑒定。其中分子生物學(xué)方法包括同工酶電泳技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(RFLP-PCR)技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA PCR(RAPD-PCR)技術(shù)和核酸序列分析鑒定技術(shù)。同工酶電泳技術(shù)對(duì)于操作人員的專業(yè)技能要求較高，要求操作人員能夠準(zhǔn)確的解讀電泳酶譜；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 PCR技術(shù)可準(zhǔn)確區(qū)分斑潛蠅近緣種，但篩選所需限制性內(nèi)切酶種類的工作量較大；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA PCR雖然操作簡(jiǎn)單，但重復(fù)性較差，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高。因此，縮短種類鑒別時(shí)間，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟成為了斑潛蠅屬近緣種分子生物學(xué)方法鑒定的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)，靈敏度高且穩(wěn)定、快速的美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法。一種美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法是根據(jù)美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的mtDNA COI序列分別合成各自的特異引物，以所述三種斑潛蠅基因組DNA為模板，分別同時(shí)進(jìn)行使用相同模板但引物不同的三次PCR擴(kuò)增獲得各自的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，取各自的 PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液中電泳檢測(cè)，經(jīng)染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像，同時(shí)，對(duì)出現(xiàn)特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過BOLD在線比對(duì)，如果在使用美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為250-500bp,常為410bp,確定該斑潛蠅為美洲斑潛蠅；如果在使用南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為550-600bp，常為 550bp，確定該斑潛蠅為南美斑潛蠅；如果在使用三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為450-550bp，常為520bp，確定該斑潛蠅為三葉草斑潛蠅。所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的mtDNA COI序列是美洲斑潛蠅 GBDP4555-08,南美斑潛蠅 GBDP4553-08，三葉草斑潛蠅 GBDP4554-08。所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅各自合成的特異引物是通過對(duì)獲得的各自序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比較，獲得三種斑潛蠅在相同區(qū)段序列中不同的堿基位點(diǎn)作為特異引物的合成依據(jù)。所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的合成各自的特異引物均由上游引物與下游引物構(gòu)成，所述各斑潛蠅特異引物序列如下美洲斑潛蠅LS :上游引物 LS344F17 :5，-ACCCTCCACTTTCTTCA-3，，下游引物 LS733R19 :5，-TTTTACCTGATTCGTGACT-3，； 南美斑潛蠅 LH :上游引物 LH276F22 :5，-TCCAGCTCTTACCCTTCTACTT-3，，下游引物 LH799R26 :5’ -CTCACACAATAAATCCTAATAACCC-3’ ；三葉草斑潛蠅 LT :上游引物 LT298F24 5’ -ATAAGCAGAATAGTAGAAAACGGA-3’，下游引物 LT798R26 :5’ -CTCATACAATAAAACCTAACAATCC A-3’;所述各特異引物的上下游引物的Delta G值絕對(duì)值不超過9 ;可形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的結(jié)合堿基對(duì)不要超過3個(gè)；GC%含量控制在30% -70%之間，且上下游之間不要相差太大；錯(cuò)誤引發(fā)效率不超過100 ;各特異引物最適退火溫度均設(shè)定為52°C。所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅合成的各自的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR擴(kuò)增的目的片段為斑潛蠅mtDNA中COI基因的一段序列，擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)總體積為 56 ii L，其中 6 ii L IOX ReactionBuffer, 2u L dNTPmixture, Taq 酶 0. 4 y L， ddH20 32. 6 uL,模板6uL,上游引物3 u L,下游引物3 u L，引物濃度均為IOuM ;擴(kuò)增條件 940C 3min ；94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用I %瓊脂糖凝膠120v恒壓下電泳30分鐘，EB染色15分鐘后在紫外燈下觀察結(jié)果。陰性對(duì)照不加DNA模板，以檢測(cè)所用的PCR試劑有無DNA污染。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)。通過本發(fā)明所述的技術(shù)方案，所篩選出的特異引物可鑒別出美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅和三葉草斑潛蠅。與其他分子生物學(xué)鑒定方法相比，該特異引物對(duì)的發(fā)明簡(jiǎn)化了以上三種斑潛蠅的分子檢測(cè)步驟，提高了以上三種斑潛蠅的檢測(cè)效率，為進(jìn)一步鑒定斑潛蠅屬其他近緣種的研究奠定了基礎(chǔ)。通過分子鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的確認(rèn)，所篩選出的引物均為對(duì)應(yīng)種的特異引物，可以穩(wěn)定的區(qū)分美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅等斑潛蠅屬近緣種，故本發(fā)明是一種操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)，靈敏度高且穩(wěn)定的美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的特異引物的鑒定方法。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的特異引物鑒定方法作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本發(fā)明美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法是根據(jù)美洲斑潛蠅、 南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的mtDNA COI序列分別合成各自的特異引物，以所述三種斑潛蠅基因組DNA為模板，分別同時(shí)進(jìn)行使用相同模板但引物不同的三次PCR擴(kuò)增獲得各自的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，取各自的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液中電泳檢測(cè)，且染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像，同時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過BOLD 在線比對(duì)，如果在在使用美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果且其分子量大小為 250-500bp處有擴(kuò)增的明亮條帶，其中分子量實(shí)施例值為端值、270、480、410，確定該斑潛蠅為美洲斑潛蠅；如果在使用南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果且其分子量大小為550-600bp，處有擴(kuò)增的明亮條帶，其中分子量實(shí)施例值為端值、570、590、550，確定該斑潛蠅為南美斑潛蠅；如果在使用三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果且其分子量大小為450-550bp處有擴(kuò)增的明亮條帶，其中分子量實(shí)施例值為端值、480、500、520，確定該斑潛蠅為三葉草斑潛蠅。本發(fā)明美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法即特異引物的鑒定方法。下面更加詳細(xì)描述如下一、針對(duì)美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅特異引物的設(shè)計(jì)(I)斑潛蠅mtDNA COI序列獲得在BOLD數(shù)據(jù)庫中獲得美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅和三葉草斑潛蠅長(zhǎng)為850bp的COI 序列。根據(jù)序列長(zhǎng)短以及序列的準(zhǔn)確性，最終在BOLD數(shù)據(jù)庫中使用的序列為美洲斑潛蠅 GBDP4555-08,南美斑潛蠅 GBDP4553-08，三葉草斑潛蠅 GBDP4554-08。⑵引物設(shè)計(jì)對(duì)獲得的序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比較，獲得三種斑潛蠅在相同區(qū)段序列中不同的堿基位點(diǎn)作為特異引物設(shè)計(jì)的依據(jù)。⑶引物評(píng)估采用Oligo 7軟件對(duì)引物對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估內(nèi)容及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)如下上下游引物的Delta G值絕對(duì)值不超過9 ;可形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的結(jié)合堿基對(duì)不要超過3個(gè)；GC%含量控制在30% -70%之間，且上下游之間不要相差太大；錯(cuò)誤引發(fā)效率不超過100 ;最后，結(jié)合Oligo 7軟件給出不同引物對(duì)最適退火溫度，將退火溫度同一設(shè)定為52°C。
設(shè)計(jì)的斑潛蠅特異引物序列如下
美洲斑潛蠅LS
上游引物(LS344F17):5，-ACCCTCCACTTTCTTCA-3，
下游引物(LS733R19):5，-TTTTACCTGATTCGTGACT-3，
南美斑潛蠅LH
上游引物(LH276F22):5，-TCCAGCTCTTACCCTTCTACTT-3，
下游引物(LH799R26):5，-CTCACACAATAAATCCTAATAACCC-3，
三葉草斑潛蠅LT
上游引物(LT298F24):5，-ATAAGCAGAATAGTAGAAAACGGA-3，
下游引物(LT798R26):5，-CTCATACAATAAAACCTAACAATCCA-3，
二、三種斑潛蠅特異弓I物的篩選
(I)斑潛蠅基因組DNA的提取
采用北京天根生化科技有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(該
試劑盒可從商業(yè)途徑購買)，提取單頭斑潛蠅成蟲整個(gè)蟲體的總DNA，根據(jù)提取效果做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整(溶解DNA使用ddH20)，保證提取DNA質(zhì)量良好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。DNA提取前觀察斑潛蠅樣品形態(tài)，同時(shí)擴(kuò)增明確所用樣品(2)采用設(shè)計(jì)的不同特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)的特異引物由北京奧科生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增的目的片段為斑潛蠅mtDNA中COI基因的一段序列，擴(kuò)增體系為56ul
ddH2032.6ul
IOxBuffer6. Oul
mgCl23. Oul
dNTPs2. Oul
Taq 酶0. 4ul
引物(上下游)各3. Oul
模板 DNA6. Oul擴(kuò)增條件94°C加熱3分鐘，然后進(jìn)行30次PCR循環(huán)94°C變性I分鐘，退火溫度為52°C，時(shí)間為I分鐘，72°C延伸I分鐘，最后72°C變性延伸10分鐘，PCR產(chǎn)物保存于4°C。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用I %瓊脂糖凝膠120v恒壓下電泳30分鐘， EB染色15分鐘后在紫外燈下觀察結(jié)果。陰性對(duì)照不加DNA模板，以檢測(cè)所用的PCR試劑有無DNA污染。(3)特異引物擴(kuò)增條帶測(cè)序驗(yàn)證取特異引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后顯示為陽性的PCR粗產(chǎn)物委托北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行純化并進(jìn)行雙向測(cè)序，以保證序列的準(zhǔn)確性。測(cè)序反應(yīng)均在ABI-3730測(cè)序儀上進(jìn)行。雙向序列返回后，由DNAMAN軟件對(duì)每一樣品正反向測(cè)序的結(jié)果拼接，得到單條
7準(zhǔn)確序列。然后在 BOLD (Barcode Of Life Date Systems v2. 5)數(shù)據(jù)庫中的 Identify Specimen功能進(jìn)行序列特異性驗(yàn)證，以確定所擴(kuò)增的片段的種類。三、三種斑潛蠅特異引物的驗(yàn)證以篩選特異引物所使用的四種斑潛蠅樣品基因組DNA為模板，采用上述特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系=PCR反應(yīng)總體積為 56 μ L，其中 6 μ L IOX Reaction Buffer (含 Mg2+)， 2 μ L dNTPmixture (2. 5mM)，Taq 酶 0· 4 μ L(2. 5U/ μ L,北京天根生化科技有限公司)，ddH20 32. 6 μ 1^,模板6“ L,上游引物3 μ L,下游引物3 μ L,引物濃度均為10 μ Μ。擴(kuò)增條件94°C3min ；94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0取5 μ L PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在I %的瓊脂糖凝膠，I倍的TAE電泳緩沖液中電泳檢測(cè)， 溴化乙錠(EB)染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像(Gel Logical Pro 212)。同時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物直接送公司(奧科鼎盛生物科技有限公司)雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過BOLD在線比對(duì)， 進(jìn)一步確定特異引物所擴(kuò)增的是否所設(shè)計(jì)種。驗(yàn)證結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物大小美洲斑潛蠅為410bp左右，南美斑潛蠅550bp左右，三葉草斑潛蠅520bp左右。每組由11個(gè)泳道組成，其中M為DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，11泳道為陰性對(duì)照，其他泳道信息為1、2 :寄主為豆角的美洲斑潛蠅，采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；3、4 :寄主為絲瓜的美洲斑潛蠅，采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；5、6 :寄主未知的南美斑潛蠅，中科院動(dòng)物所純化飼養(yǎng)；7、8 :寄主為大豆的三葉草斑潛蠅，采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；9、10 :寄主為蔥的蔥斑潛蠅(做為外群)，由廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供。通過分子鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的確認(rèn)，本發(fā)明所篩選出的引物對(duì)均為對(duì)應(yīng)種的特異引物對(duì)，可以比較穩(wěn)定的區(qū)分美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅和三葉草斑潛蠅等斑潛蠅屬近緣種。本發(fā)明工作過程I)斑潛蠅基因組DNA的提取采用北京天根生化科技有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(該試劑盒可從商業(yè)途徑購買)，提取單頭斑潛蠅成蟲整個(gè)蟲體的總DNA。DNA質(zhì)量采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。2) PCR 擴(kuò)增以四種斑潛蠅基因組DNA為模板，采用不同種特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體積為 56 μ L，其中 6 μ L 10Χ Reaction Buffer (含 Mg2+)，2 μ L dNTPmi xture (2. 5mM)，Taq 酶 0. 4 μ L (2. 5U/ μ L，北京天根生化科技有限公司)，ddH20 32. 6 μ 1^,模板6“ L,上游引物3 μ L,下游引物3 μ L,引物濃度均為10 μ Μ。擴(kuò)增條件940C 3min ；94°C lmin, 52°C lmin, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
3)結(jié)果取5 μ L的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在I %的瓊脂糖凝膠，I倍的TAE電泳緩沖液中電泳檢測(cè)，溴化乙錠(EB)染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像。如果在410bp左右處有擴(kuò)增的明亮條帶，確定該斑潛蠅為美洲斑潛蠅；如果在550bp左右處有擴(kuò)增的明亮條帶，確定該斑潛蠅為南美斑潛蠅；如果在520bp左右處有擴(kuò)增的明亮條帶,確定該斑潛蠅為三葉草斑潛蠅。本發(fā)明采用此特異引物檢測(cè)了混合了美洲斑潛蠅，南美斑潛蠅和三葉草斑潛蠅的8頭斑潛蠅樣品庫。采用北京天根生化科技有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(該試劑盒可從商業(yè)途徑購買)，提取整個(gè)蟲體的總DNA ；以斑潛蠅基因組DNA為模板，使用針對(duì)不同種的特異引物同時(shí)進(jìn)行使用相同模板但引物不同的三次PCR擴(kuò)增；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，如果在使用美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為250-500bp,常為410bp,確定該斑潛蠅為美洲斑潛蠅；如果在使用南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為550-600bp， 常為550bp，確定該斑潛蠅為南美斑潛蠅；如果在使用三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為450-550bp，常為520bp，確定該斑潛蠅為三葉草斑潛蠅。實(shí)驗(yàn)共分三組同時(shí)進(jìn)行，第一組在PCR體系中加入的是美洲斑潛蠅特異引物，第二組在PCR體系中加入的是南美斑潛蠅特異引物，第三組在PCR體系中加入的是三葉草斑潛蠅特異引物，體系中其他成分相同。通過檢測(cè)，得到三組符合泳道信息的試驗(yàn)結(jié)果，即8頭斑潛蠅中,4頭美洲斑潛蠅分布在泳道1-4,2頭南美斑潛蠅分布在泳道5-6,2頭三葉草斑潛蠅分布在泳道7-8。
權(quán)利要求
1.一種美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法是根據(jù)美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的mtDNA COI序列分別合成各自的特異引物，以所述三種斑潛蠅基因組DNA為模板，分別同時(shí)進(jìn)行使用相同模板但引物不同的三次PCR擴(kuò)增獲得各自的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，取各自的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液中電泳檢測(cè)，且染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像，同時(shí)，對(duì)擴(kuò)增中出現(xiàn)特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物直接判定為相應(yīng)特異引物擴(kuò)增的針對(duì)種，如果在使用美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為250-500bp且包括端值，確定該斑潛蠅為美洲斑潛蠅；如果在使用南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為550-600bp且包括端值，確定該斑潛蠅為南美斑潛蠅；如果在使用三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量大小為450-550bp且包括端值，確定該斑潛蠅為三葉草斑潛蠅。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述確定斑潛蠅為美洲斑潛蠅中的美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為 270bp，所述確定斑潛蠅為南美斑潛蠅中的南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為570bp，所述確定斑潛蠅為三葉草斑潛蠅中的三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為480bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述確定斑潛蠅為美洲斑潛蠅中的美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為 480bp，所述確定斑潛蠅為南美斑潛蠅中的南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為590bp，所述確定斑潛蠅為三葉草斑潛蠅中的三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為500bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述確定斑潛蠅為美洲斑潛蠅中的美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為 410bp，所述確定斑潛蠅為南美斑潛蠅中的南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為550bp，所述確定斑潛蠅為三葉草斑潛蠅中的三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物分子量大小為520bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的mtDNA COI序列是美洲斑潛蠅 GBDP4555-08,南美斑潛蠅 GBDP4553-08，三葉草斑潛蠅 GBDP4554-08。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅各自合成的特異引物是通過對(duì)獲得的各自序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比較，獲得三種斑潛蠅在相同區(qū)段序列中不同的堿基位點(diǎn)作為特異引物的合成依據(jù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的合成各自的特異引物均由上游引物與下游引物構(gòu)成，各斑潛蠅特異引物序列如下美洲斑潛蠅LS 上游引物 LS344F17 :5’-ACCCTCCACTTTCTTCA-3’，下游引物 LS733R19 : 5’ -TTTTACCTGATTCGTGACT-3’ ；南美斑潛蠅LH 上游引物 LH276F22 :5’-TCCAGCTCTTACCCTTCTACTT_3’，下游引物 LH799R26 :5’_CTCACA CAATAAATCCTAATAACCC-3，；三葉草斑潛蠅LT 上游引物 LT298F24 :5 ’ -ATAAGCAGAATAGTAGAAAACGGA-3，，下游引物 LT798R26 :5 ’ -CTCA TACAATAAAACCTAACAATCCA-3’ ；所述各特異引物的上下游引物的Delta G值絕對(duì)值不超過9 ;可形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的結(jié)合堿基對(duì)不超過3個(gè)；GC%含量控制在30%-70%之間，且上下游之間不要相差太大；錯(cuò)誤引發(fā)效率不超過100 ;各特異引物最適退火溫度均設(shè)定為52°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅合成的各自的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)， 擴(kuò)增體系:PCR反應(yīng)總體積為 56ii L，其中 L IOX Reaction Buffer, 2 u L dNTP mixture, Taq酶0. 4 ii L，ddH20 32. 6 u L,模板6 y L，上游引物3 y L，下游引物3 y L，引物濃度均為 IOuM ；擴(kuò)增條件94°C 3min ；94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用I %瓊脂糖凝膠120v恒壓下電泳30分鐘，EB 染色15分鐘后在紫外燈下觀察結(jié)果。陰性對(duì)照不加DNA模板，以檢測(cè)所用的PCR試劑有無 DNA污染。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的鑒定方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的目的片段為斑潛蠅mtDNA中COI基因的一段序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種斑潛蠅的鑒定方法，具體是根據(jù)美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅的mtDNA COI序列分別合成各自的特異引物，以所述三種斑潛蠅基因組DNA為模板，分別同時(shí)進(jìn)行使用相同模板但引物不同的三次PCR擴(kuò)增獲得各自的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，取各自的PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)、染色、觀察并成像，如果美洲斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量為250-500bp，確定為美洲斑潛蠅；如果南美斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且其分子量為550-600bp，確定為南美斑潛蠅；如果三葉草斑潛蠅特異引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果中有明亮的擴(kuò)增帶，且分子量為450-550bp，確定為三葉草斑潛蠅。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)，靈敏度高且具有穩(wěn)定、快速的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605085SQ20121008796
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者劉海軍, 吳佳教, 李志江, 李春苑, 胡俊韜, 胡學(xué)難, 顧渝娟 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心