專利名稱：：一種利用pcr-rflp技術(shù)快速鑒定斑潛蠅近似種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及昆蟲種類鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種利用PCR-RFLP技術(shù)鑒定三葉斑潛蠅及其近似種的分子方法。
背景技術(shù)：
：斑潛蠅屬(liriomyza)中，大約有100多種可為害或取食栽培作物和觀賞作物，其中有20多種具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。從世界范圍看，危害最大的斑潛蠅有3禾中美洲斑潛蟲黽(L.sativaeBlanchard)、南美斑潛蟲黽(L.huidorensisBlanchard)禾口三口十斑潛蟲蠅.(LtrifoiiBurgess)，目前這3禾中斑潛蟲雖均已成功入侵我國，給我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失；其中三葉斑潛蠅現(xiàn)在在我國已確定為檢疫性有害生物，隨著地區(qū)間農(nóng)產(chǎn)品的頻繁調(diào)運(yùn)，其分布范圍和危害程度更有擴(kuò)大、加重的趨勢。由于三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅及南美斑潛蠅在生態(tài)位上有重疊，幾種斑潛蠅經(jīng)?；旌习l(fā)生；在為害產(chǎn)品調(diào)運(yùn)途中主要以蛹和幼蟲的蟲態(tài)存在，而待幼蟲發(fā)育為成蟲再進(jìn)行形態(tài)鑒定需要2周以上時(shí)間；同時(shí)，它們的成蟲體型微小，外部形態(tài)特征非常相似，在形態(tài)鑒定上難以準(zhǔn)確把握，容易混淆，這給檢疫、測報(bào)和防治等工作帶來了困難，因此在檢疫工作中迫切需要一種快速準(zhǔn)確的鑒定方法。20世紀(jì)80年代以后，生化技術(shù)開始應(yīng)用于斑潛蠅的分類鑒定，Zehender(1993)用淀粉凝膠技術(shù)進(jìn)行了三葉草斑潛蠅、番茄斑潛蠅和南美斑潛蠅的鑒定；Collin(1996)利用醋酸纖維電泳區(qū)分了不同地區(qū)的南美斑潛蠅與三葉草斑潛蠅種群。隨著科技的發(fā)展，電子顯微鏡也開始應(yīng)用到斑潛蠅的分類研究中馬瑞燕(1999)應(yīng)用電子顯微鏡對美洲斑潛蠅及南美斑潛蠅的外部形態(tài)特征進(jìn)行了觀察，但這些技術(shù)鑒定周期較長，且操作復(fù)雜不利于斑潛蠅的快速檢測。近年來，以PCR為基礎(chǔ)的DNA測序技術(shù)的興起和廣泛應(yīng)用，因此以DNA為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)為實(shí)驗(yàn)手段，研究昆蟲分類鑒定、類群遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化的昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)得到了很大發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于近似物種的鑒定。目前被廣泛應(yīng)用于昆蟲的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中的標(biāo)記基因有線粒體DNA(MitochondrialDNA，mtDNA)、核糖體DNA(RibosomalDNA，rDNA)和核蛋白編碼基因(Nuclearproteincodinggenes)等，其中mtDNA禾口rDNA中多個(gè)標(biāo)記基因在昆蟲的分子系統(tǒng)研究中應(yīng)用最廣。由于mtDNA小、相對快的進(jìn)化速率和母本的遺傳特性使得它很適合于種群歷史和親緣關(guān)系相近的分類單元間進(jìn)化的研究。mtDNA細(xì)胞色素氧化酶n(con)基因是昆蟲分子系統(tǒng)進(jìn)化應(yīng)用較多的標(biāo)記基因之一，其中包含進(jìn)化速率較慢的保守片段和進(jìn)化較快的可變區(qū)，既可用于系統(tǒng)進(jìn)化研究，又可用于種類區(qū)分或者種下階元的比較研究，適合于種內(nèi)和近緣種間的系統(tǒng)關(guān)系研究。因此，COII基因越來越多地應(yīng)用于昆蟲的鑒定中，例如斑潛蠅近緣種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究。PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技術(shù)。由于PCR-RFLP技術(shù)對樣品純度的要求不高，適用于個(gè)體分析，且快速而簡便，因此在物種多態(tài)性檢測、品種分類、物種鑒定、細(xì)菌病毒檢測等方面得到廣泛應(yīng)用。在斑潛蠅鑒定方面，[1]AntonioM,AndreaL，BarbaraMetal.Polymerasechainrection-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaystodistinguishliriomyzahuidobresis(Diptera:Agromyzidae)fromassociatedspeciesonlettucecroppingsystemsinItaly.AnnalsoftheentomologicalsocietyofAmerica.2006，99(4):1268_1272.曾利用/V〃II跟6)7aBI內(nèi)切酶進(jìn)行南美斑潛蠅鑒定，但這兩種內(nèi)切酶只能夠進(jìn)行南美斑潛蠅的鑒定而不能用于三葉斑潛蠅同美洲斑潛蠅的區(qū)分，并且價(jià)格昂貴，一個(gè)樣品需要$5。[2]SchefferS丄LewisML.Twonucleargenesconfirmmitochondrialevidenceofcrypticspecieswithinh'rio歷j"za力i/j.c/a&re/5^'51.AnnalsoftheentomologicalsocietyofAmerica.2001，94(5):1177-1182.和[3]L.F.F.Kox，H,E.vandenBeldetal.Identificationofeconomicallyimportant2irj'o/zjzaspeciesbyPCR—RFLPanalysis.Bulletin0EPP/EPP02005，35:79_85.也分別利用了相關(guān)內(nèi)切酶進(jìn)行不同種斑潛蠅的鑒定，但他們選擇的內(nèi)切酶或是比較昂貴不常用，如5^el、^&pl等；或是不能進(jìn)行多種斑潛蠅的準(zhǔn)確區(qū)分，如歷'"fl、fcoRV等，并且他們所檢測的樣本絕大部分來自國外，由于昆蟲有地理種群差異的現(xiàn)象，所以他們所選擇的內(nèi)切酶是否適合于我國國內(nèi)近似種斑潛蠅的鑒定還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是針對三葉斑潛蠅與其外部形態(tài)極易混淆的近似種——美洲斑潛蠅與南美斑潛蠅進(jìn)行區(qū)分鑒定時(shí)，采用的PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)中所存在的，選用的內(nèi)切酶或價(jià)格昂貴或不能清晰辨別這三種近似種斑潛蠅的缺陷；提出一種以合適的目的序列為鑒定依據(jù)，通過測序明確國內(nèi)這三種常見近似種斑潛蠅相應(yīng)序列間的差異，進(jìn)而選擇一種廉價(jià)、穩(wěn)定的內(nèi)切酶進(jìn)行分析鑒定，以達(dá)到快速、準(zhǔn)確、低成本鑒定區(qū)分三葉斑潛蠅及其近似種的方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)。斑潛蠅DNA分子鑒定的COII(線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶II)特異性片斷，其序列為SEQN0:1，SEQN0:2，SEQN0:3所示。一種利用PCR-RFLP技術(shù)快速鑒定斑潛蠅近似種的方法，該方法按如下步驟進(jìn)行(1)分別提取三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅樣品總DNA;(2)參照Liu(1992)設(shè)計(jì)的昆蟲COII通用引物，進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增長度為805bp的DNA片段(圖1)，引物序列為上游引物5'—ATTTCTAATATGGCAGATTAGTGCA—3'下游引物5'—ATATGGTTTAAGAGACCAGTACTT—3';(3)通過克隆、轉(zhuǎn)化、測序三種近似種斑潛蠅分別獲得COn序列，如SEQN0:1，SEQN0:2，SEQN0:3所示;(4)通過相關(guān)的分子生物學(xué)軟件對歩驟(3)所得三種COII序列進(jìn)行拼接、分析后，選擇"rsl作為限制性內(nèi)切酶；(5)利用DraI內(nèi)切酶對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳；通過酶切圖譜進(jìn)行三種近似種斑潛蠅的區(qū)分；(6)通過對不同蟲態(tài)、不同寄主、不同地理種群的斑潛蠅及近似種豌豆彩潛蠅進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)此內(nèi)切酶的準(zhǔn)確、穩(wěn)定；其中，所述PCR反應(yīng)條件如下體系50p1，反應(yīng)液組成為10XTaqBuffer5ul，MgCl2(25mmol/L)4ul，dNTP(10mol/L)4ul，模版DNA(60ng/ul)lul，上下游引物(10umol/L)各2.5lU，TaqDNA聚合酶(TaKaRa)(5U/ul)0.25p1，滅菌ddH2030.75ul;反應(yīng)程序?yàn)?4"預(yù)變性5min;94'C變性30s，5(TC退火30s，72。C延伸60s;35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存;WddH20代替模板作空白對照。本發(fā)明的有益效果是①利用進(jìn)行三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅跟南美斑潛蠅的C0II酶切鑒定，可準(zhǔn)確區(qū)分國內(nèi)這三種近似種斑潛蠅(圖2)。②進(jìn)行了三種斑潛蠅成蟲、蛹、幼蟲的酶切鑒定，得到的酶切電泳條帶一致，因此利用內(nèi)切酶進(jìn)行分析不會受到昆蟲蟲態(tài)的干擾(圖2)。③利用"rsl進(jìn)行鑒定不會受到同三種斑潛蠅形態(tài)較為相似、在寄主上同斑潛蠅有重疊現(xiàn)象的豌豆彩潛蠅的影響，確保此內(nèi)切酶的準(zhǔn)確與穩(wěn)定(圖3)。④通過對不同地區(qū)、不同寄主三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅酶切分析，表明同種之間不同個(gè)體可保持很高的穩(wěn)定性(圖4)。⑤本方法鑒定快速僅需1個(gè)工作日即可；同時(shí)成本較低，進(jìn)行一個(gè)樣本的檢測僅需4元左右。綜上所述，本發(fā)明通過進(jìn)行國內(nèi)三種近似種斑潛蠅的C0II序列測定，進(jìn)而選擇穩(wěn)定、準(zhǔn)確、廉價(jià)的/ral內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定，并且通過不同地理種群和不同蟲態(tài)的斑潛蠅進(jìn)行驗(yàn)證，明確本發(fā)明具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速、廉價(jià)等特點(diǎn)，可在檢疫、測報(bào)、防治等相關(guān)部門應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)對此三種近似種斑潛蠅的快速檢測。圖1三種斑潛蠅分別進(jìn)行C0II基因PCR反應(yīng)得到的805bpDNA序列其中Ls美洲斑潛蠅；Lt三葉斑潛蠅；Lh南美斑潛蠅圖2三種斑潛蠅成蟲、蛹和幼蟲經(jīng)Z^al內(nèi)切酶酶切分析結(jié)果圖；其中Ls美洲斑潛蠅；Lt三葉斑潛蠅；Lh南美斑潛蠅圖3不同地區(qū)的三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅及南美斑潛蠅經(jīng)ral內(nèi)切酶酶切分析結(jié)果圖4不同地區(qū)的豌豆彩潛蠅經(jīng)"ral內(nèi)切酶酶切分析結(jié)果圖。注UM為未被酶切的COIIPCR產(chǎn)物，長805bp，M為100bpDNAladder(TaKaRa)具體實(shí)施方案以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。對所涉蟲源、試劑等的說明試驗(yàn)中所用的3種斑潛蠅成蟲為本實(shí)驗(yàn)室保持的實(shí)驗(yàn)種群，飼養(yǎng)所用的寄主植物均為菜豆(品種天馬地豆)。其中三葉斑潛蠅于2007年4月采自浙江慈溪，經(jīng)中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院陳乃中研究員鑒定確認(rèn)；美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅分別由中國農(nóng)科院植保所劉萬學(xué)副研究員和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)龐保平教授惠贈。Tris:AMRESCOSDS:AMRESC0蛋白酶K:AMRESC0Tris飽和酚北京鼎國實(shí)施例1:(利用對三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅與南美斑潛蠅的C0II酶切鑒定)按以下步驟進(jìn)行一、DNA提取和相關(guān)序列的獲得取三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅成蟲標(biāo)本各1頭，并分別按以下步驟提取DNA:取標(biāo)本1頭置于盛無菌水的1.5ml離心管中浸泡1h;取出標(biāo)本，于100ul提取液(Tris:10mM，EDTA:lmM，SDS:1%，PH=8.0)中研磨，力口入2.5ul蛋白酶K(20mg/ml)于56。C水浴消化2h;加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合液抽提，取上清液加入2倍體積無水乙醇，沉淀DNA;最后用無菌水溶解DNA;-2(TC保存，作為PCR反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)條件如下體系50ul，反應(yīng)液組成為IOXT叫Buffer5ul，MgCl2(25腿ol/L)4u1，dNTP(10腿ol/L)4u1，模版DNA(60ng/u1)1u1，參照LiuH.,BeckenbachAT.EvolutionofthemitochondrialcytochromeoxidaseIIgeneamong10ordersofinsects.MolecularPhylogeneticsandEvolution.1992,1:41-52.設(shè)計(jì)的，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的昆蟲COII上、下游引物(10iimol/L)各2.5ixl，TaqDNA聚合酶(5U/ul)0.25nl(TaKaRa)，滅菌ddH2030.75ul;反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min;94。C變性30s，50。C退火30s，72。C延伸60s;35個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10min，4。C保存。以ddH20代替模板作空白對照。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖電泳lh，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，lkbpDNAladder作分子量標(biāo)記(圖l)。具體步驟如下PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用凝膠回收試劑盒(U-GENE，回收純化；本實(shí)驗(yàn)用PromegapGEM⑧-TeasyVector試劑盒完成連接反應(yīng)，用菌種DH5"制備感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，用篩選出的陽性克隆菌液抽提質(zhì)粒，用^boRI酶切確定是否含有目的片段。最終將含有目的片段的克隆菌液送上海英駿(irwitrogen)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。為了確保序列的準(zhǔn)確性，本研究對樣品進(jìn)行克隆測序，每條DNA各取三個(gè)對應(yīng)的重組質(zhì)粒測序，每個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行正反雙向測序，最終的序列由三個(gè)質(zhì)粒的序列綜合而定，以保證序列的準(zhǔn)確性。經(jīng)以上步驟，分別取得SEQN0:1(三葉斑潛蠅C0II序列);SEQN0:2(美洲斑潛蠅C0II序列);SEQN0:3(南美斑潛蠅C0II序列)三種序列。二、內(nèi)切酶選擇及酶切分析序列的編輯、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析等通過DNASTAR公司的LaserGene軟件完成；序列的拼接通過SeqMan軟件完成；同源序列的搜索工作在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用BLAST程序完成；限制性內(nèi)切酶的査找通過DNAman軟件完成。純化后3種斑潛蠅的擴(kuò)增產(chǎn)物C0II在20iil酶切體系下，反應(yīng)液組成為滅菌去離子水10ul，10Xbuffer2W，純化后PCR產(chǎn)物7W，(lOUAil)lnl;37。C進(jìn)行"ral(TaKaRa)酶切2h，10Xloadingbuffer終止反應(yīng)，取酶切產(chǎn)物5uL，用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳完畢溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，100bpDNAladder作分子量標(biāo)記(圖l)。從電泳圖中電泳條帶位置可明顯區(qū)分三種斑潛蠅美洲斑潛蠅僅為一條805bp電泳條帶；三葉斑潛蠅的C0II基因可被酶切為92bp，270bp，443bp三條帶；南美斑潛蠅COII基因可被酶切為194bp，249bp，362bp三條帶。三種斑潛蠅成蟲通過克隆、轉(zhuǎn)化、測序分別獲得的COII序列圖，如SEQNO:1，SEQNO:2，SEQN0:3所示，附后。實(shí)施例2:(利用內(nèi)切酶對三種斑潛蠅不同蟲態(tài)同種性的驗(yàn)證)三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅蛹與幼蟲的DNA提取和相關(guān)序列的獲得與實(shí)施例l成蟲的做法相同；酶切鑒定，得到的酶切電泳條帶與實(shí)施例1成蟲相一致，因此，利用"_rsl內(nèi)切酶進(jìn)行區(qū)分分析不會受到昆蟲蟲態(tài)的干擾(圖2)。實(shí)施例3:(利用"ral內(nèi)切酶對豌豆彩潛蠅與三種斑潛蠅不同種的驗(yàn)證)由于同三種斑潛蠅形態(tài)較為相似的豌豆彩潛蠅在寄主上又同斑潛蠅有重疊現(xiàn)象，因此需要將豌豆彩潛蠅作為驗(yàn)證種進(jìn)行驗(yàn)證；豌豆彩潛蠅經(jīng)"ral酶切后(與實(shí)施例l相同)，其電泳條帶明顯不同于三種斑潛蠅酶切電泳條帶，說明利用DraI內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定不會受到混雜的豌豆彩潛蠅影響(圖3)。實(shí)施例4:(三種斑潛蠅各自不同地區(qū)、寄主蟲源同種性的驗(yàn)證)采用實(shí)施例1的方法同時(shí)對不同地區(qū)、不同寄主的三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(表1)，得出同種之間不同個(gè)體可保持很高的穩(wěn)定性，以此也表明采用"ral內(nèi)切酶對本鑒定蟲種進(jìn)行酶切鑒定的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性(圖4)。通過實(shí)施例1、2、3與4說明，利用DraI進(jìn)行三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅跟南美斑潛蠅的COII酶切鑒定，可準(zhǔn)確、快速地區(qū)分國內(nèi)的三種近似種斑潛蠅。表1不同地區(qū)、不同寄主的三種斑潛蠅及彩潛蠅的驗(yàn)證結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表〈110〉中國計(jì)量學(xué)院〈120〉一種利用PCR-RFLP技術(shù)快速鑒定斑潛蠅近似種的方法<160〉3〈210〉1〈211〉805〈212>DNA<213〉來源于三葉斑王潛潛蠅(Liriomyzatrifolii(Burgess))<400〉1<sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage13</sequence>ccgggtcgattaaatcaaaccaatttttttatcaatcgacctggtttattttalggac3a660tgttctgaaaUtgtggtgctttatgccaattgtgattgaaagagttcct720ttatcaaatgaatcataaat3atcatt3ggtggctg腿g780ca^gtactggtctcttaaaccatat805〈210〉3<211〉805〈212〉DNA〈213〉來、源于南美蘿王潛蟲黽(ZY,i(9/7/zs力〃/(3W7re/7sis(Blanchsrd))<400>3atttctaatatggcagattagtgcaatggatttaagctcctatttaactt60ttattagaataa^tgtcaacatgagctaatctaaatcttcttccccttta120atagaacaattaattttttttcatgatcatgctttaataattttagttataattacagta180ttagtcggtttactttattt111aataaatttacaaaccgactattatta240cacggacaaaaatctgaactattttacctgctattattcttttatttatt300gcttttccctctcttcgattgctttatttattagatgagatt朋tgaaccttcaattact360ttaaaggctattggtcaccastgatactg3agttatgaatattctgattttaataataat420atagaatttgaaaatgatgaatttcgatts■ttag已tgtagataatcgaacataaatactcaaattcgaattttagttaca540gctgc卿tgtattacactcttgaacagttcctgctctaggggtaaaggttgatgctacg600ccaggccgtttaaatcaaactaatttctttatt犯tcgaccaggattattttatggacag660tgttcagaaatttgtggggctttataccaaaagagttcct720tctgatatttcatcaaaaataattctaactaatcattagatgactgaaag780caagtactggtctcttaaaccatat80權(quán)利要求1、三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅DNA分子鑒定的COII特異性片斷，其序列為SEQNO1，SEQNO2，SEQNO3所示。2、一種利用PCR-RFLP技術(shù)快速鑒定斑潛蠅近似種的方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行(1)分別提取三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅樣品總DNA;(2)昆蟲COII基因通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增長度為805bp的DNA片段，引物序列為上游引物5'—ATTTCTAATATGGCAGATTAGTGCA—3'下游引物5'_ATATGGTTTAAGAGACCAGTACTT—3';(3)通過克隆、轉(zhuǎn)化、測序分別獲得COII序列，如SEQNO:1，SEQNO:2，SEQNO:3所示；(4)通過相關(guān)的分子生物學(xué)軟件對步驟(3)所得三種COII序列進(jìn)行拼接、分析后，選擇"ral作為限制性內(nèi)切酶；(5)利用DraI內(nèi)切酶對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳，通過酶切圖譜進(jìn)行三種近似種斑潛蠅的區(qū)分；(6)通過對不同蟲態(tài)、不同寄主、不同地理種群的斑潛蠅及近似種豌豆彩潛蠅進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)此內(nèi)切酶的準(zhǔn)確、穩(wěn)定；其中，所述PCR反應(yīng)條件如下體系50pl，反應(yīng)液組成為10xTaqBuffer5pl，25mmol/L的MgCl24pl,10mmol/L的dNTP4^1,60ng/pl的模版DNAlpl,10pmol/L的上、下游引物各2.5^1，5U/pl的TaqDNA聚合酶0.25^1,滅菌ddH2030.75|il;反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min;94。C變性30s，50。C退火30s，72。C延伸60s;35個(gè)循環(huán)，最后72"延伸10min，4。C保存；以ddH20代替模板作空白對照。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用PCR-RFLP技術(shù)快速鑒定斑潛蠅近似種的方法，屬于昆蟲種類鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法包括(1)三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅和南美斑潛蠅樣品DNA的提??；(2)按昆蟲COII基因通用引物進(jìn)行COII基因的PCR反應(yīng)，得到805bp的DNA序列；(3)通過克隆、轉(zhuǎn)化、測序分別獲得COII序列；(4)限制性內(nèi)切酶DraI的選擇；(5)通過酶切圖譜進(jìn)行三種近似種斑潛蠅的區(qū)分。本發(fā)明具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速、廉價(jià)等特點(diǎn)，可在檢疫、測報(bào)、防治等有關(guān)部門應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)對此三種近似種斑潛蠅的快速檢測。文檔編號C12Q1/68GK101200764SQ20071015706公開日2008年6月18日申請日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日發(fā)明者俞曉平,商晗武,崔旭紅,趙永旭申請人:中國計(jì)量學(xué)院