專(zhuān)利名稱(chēng)：鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法。
背景技術(shù)：
繁殖性能是家禽業(yè)生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，但是，大多數(shù)品種的鵝都保持著較強(qiáng)的就巢行為，嚴(yán)重影響其繁殖能力。雖然家禽的就巢行為是可遺傳的，通過(guò)常規(guī)選育能降低和減少其就巢行為和就巢時(shí)間，但是，由于其就巢性狀的遺傳力很低，常規(guī)選育方法很難徹底根除其就巢性，特別是隨著選育世代的增加，遺傳進(jìn)展變的十分緩慢。除此，家禽就巢性還與其自身的生殖內(nèi)分泌激素水平變化密切相關(guān)，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞家禽就巢生殖內(nèi)分泌展開(kāi)大量研究，闡明家禽就巢行為發(fā)生、維持和結(jié)束的內(nèi)分泌機(jī)制。最終，通過(guò)常規(guī)選育結(jié)合生殖激素的調(diào)控來(lái)阻斷家禽就巢行為的發(fā)生，提高其繁殖能力。催乳素(Prolactin，PRL)是家禽就巢行為發(fā)生和維持的關(guān)鍵激素。Lea(1981)證明血液中高水平的PRL是引起和維持母禽就巢行為的主要原因。隨后，El Halawani (1999) 證明活性血管腸肽(Vasoactive Intestinal Peptide, VIP)是家禽PRL的釋放因子,能促進(jìn)垂體細(xì)胞分泌PRL，調(diào)控其就巢行為。并且，其他PRL調(diào)控因子(如5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(Dopamine，DA))也是通過(guò)VIP來(lái)調(diào)節(jié)PRL的分泌。由此可見(jiàn)，VIP在調(diào)節(jié)家禽PRL 分泌和就巢行為的發(fā)生中起到至關(guān)重要的作用。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的VIP基因序列和其結(jié)構(gòu)功能都有大量報(bào)道。相對(duì)于哺乳動(dòng)物， 家禽的VIP基因序列研究較少，只有火雞和雞的VIP基因序列和結(jié)構(gòu)有一些報(bào)道，鴨的VIP 基因有部分片段已經(jīng)克隆測(cè)序，鵝VIP基因序列和結(jié)構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道。目前，由于鵝VIP基因序列和結(jié)構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道，可用的基礎(chǔ)資料匱乏，這給運(yùn)用 PCR和RACE技術(shù)獲得該基因cDNA、DNA和PHI編碼序列帶來(lái)不小困難，阻礙后續(xù)的該基因結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控通路等研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供鵝VIP基因cDNA、DNA和 PHI編碼序列克隆的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法，用于擴(kuò)展鵝VIP基因編碼區(qū)部分序列的特異性引物為VIP1/VIP2，擴(kuò)增鵝VIP基因cDNA5'序列的特異性巢式引物為 GSP2和GSP3，3'端的特異性引物為GSPl，將測(cè)序的片段拼接，獲得鵝VIP基因cDNA全長(zhǎng)序列；用所獲得的鵝VIP基因cDNA序列作為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增鵝VIP基因DNA序列的引物，首先篩選到VIP5/VIP6和VIP7/VIP8特異性引物，擴(kuò)增出鵝VIP基因DNA兩個(gè)片段，然后根據(jù)鵝 VIP基因cDNA序列和所獲得的DNA片段設(shè)計(jì)出VIP3/VIP4引物；結(jié)合鵝DNA中PHI樣編碼序列和cDNA序列，用Primer premier 5. O設(shè)計(jì)兩對(duì)鵝PHI編碼特異性引物PHI1/PHI2和 PHI3/PHI4，用PHI特異性引物擴(kuò)增鵝PHI編碼序列。
所述的方法，擴(kuò)展鵝VIP基因編碼區(qū)部分序列的PCR反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中2XMaster Mix Taq25ul, cDNA模板4ul，10 μ M上下游引物各I. 5ul, ddH2018ul ；PCR 反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30sec，60°C退火 45sec，72°C延長(zhǎng)45sec，從第二步開(kāi)始循環(huán)38次，最后72°C延長(zhǎng)lOmin。所述的方法，擴(kuò)增鵝VIP基因DNA序列的PCR反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)總體積為 50ul，其中 Premix LATaq (Takara) 30ul，DNA 模板 Iul，上下游弓 I 物(20 μ M)各 Iul， ddH2017ul ;PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin,引物特異退火溫度 VIP3/VIP4引物的退火為63。。、VIP5/VIP6和VIP7/VIP8引物的退火為60。。，退火90sec, 72°C延長(zhǎng)4min，從第二步開(kāi)始循環(huán)38次，最后72°C延長(zhǎng)20min。所述的方法，擴(kuò)增鵝PHI編碼序列的PCR反應(yīng)體系和條件如下PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中2XMaster Mix Taq25ul, cDNA模板6ul，10 μ M上下游引物各I. 5ul，ddH2016ul ；PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec,引物特異退火溫度PHI1/PHI2引物的退火為63°C、PHI3/PHI4引物的退火為65°C，退火45sec，72°C延長(zhǎng) 45sec，從第二步開(kāi)始循環(huán)38次，最后72°C延長(zhǎng)lOmin。采用上述方案，本發(fā)明首次獲得鵝VIP基因序列和其cDNA序列，對(duì)后續(xù)研究其結(jié)構(gòu)功能，闡明VIP對(duì)PRL的調(diào)控機(jī)制和家禽就巢內(nèi)分泌機(jī)制，降低或阻止其就巢來(lái)提高繁殖能力意義重大。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。I.鵝VIP基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆A.引物設(shè)計(jì)參考和比對(duì)火雞(X80906.I)、雞(U09350. I)和小鼠(NM-053991. I) VIP 基因 cDNA 序列，用Primer premier 5. O設(shè)計(jì)用于擴(kuò)展鵝VIP基因編碼區(qū)部分序列的特異性引物 (VIP1/VIP2)，引物序列和位點(diǎn)見(jiàn)表I。B. PCR 擴(kuò)增PCR擴(kuò)增模板的制備用Trizol (Invitrogen)提取浙東白鵝下丘腦總RNA, 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性和用核酸蛋白檢測(cè)儀評(píng)估其純度。按照 PrimeScriptTM RT reagent Kit (Takara)操作說(shuō)明將質(zhì)量好的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,作為下步PCR擴(kuò)增的模板。PCR反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中2 XMaster Mix Taq(Takara) 25ul，cDNA 模板 4ul，上下游引物(10 μ Μ)各 I. 5ul，ddH2018ul。PCR 反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，60°C退火45sec，72°C延長(zhǎng)45sec，從第二步開(kāi)始循環(huán)38次，最后72°C延長(zhǎng)lOmin。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。C. PCR產(chǎn)物純化、克隆和測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物用I. 5%的瓊脂糖凝膠在120V電壓下電泳25min，切割下目的片段，用Gel Extraction Mini kit (Omega)試劑盒純化目的片段，再將目的片段連接到 PMD-19T (Takara)載體中，最后轉(zhuǎn)染到DH5 α感受態(tài)大腸桿菌中(天根)，挑取陽(yáng)性單克隆菌送華大基因公司測(cè)序。測(cè)得的序列在NCBI上BLAST比對(duì)確認(rèn)其為VIP基因的部分片段。
D.鵝VIP基因CDNA5'和3'端序列的擴(kuò)增根據(jù)已經(jīng)獲得的鵝VIP部分序列作為模板,用Primer premier 5. O設(shè)計(jì)擴(kuò)增鵝 VIP基因CDNA5'序列的特異性巢式引物GSP2和GSP3，以及其3'端的特異性引物GSPl， 序列和位點(diǎn)見(jiàn)表 I，按照Marathon rapid amplification of cDNA ends (RACE) (Clontech) 試劑盒說(shuō)明操作擴(kuò)增鵝VIP基因CDNA5'和3'端序列。得到的PCR產(chǎn)物按照上面描述的方法純化、克隆和測(cè)序。最后將測(cè)序的片段拼接，獲得鵝VIP基因cDNA全長(zhǎng)序列，序列如下 (包括鵝VIP基因cDNA全長(zhǎng)序列和推測(cè)的氨基酸序列，大寫(xiě)字母表示該基因5'和3'不翻譯序列，小寫(xiě)字母表示該基因開(kāi)放閱讀框序列，起始密碼子(ATG)用黑體標(biāo)示，終止密碼子 (TGA)用*標(biāo)示，在3'端包含兩個(gè)AATAAA和TAAT多腺苷環(huán)化信號(hào)序列以及一個(gè)ployA結(jié)構(gòu)，信號(hào)肽用黑色下劃線(xiàn)標(biāo)示，陰影序列表示VIP成熟肽序列)ICCCACCGACGGACTCGCGGCTCCGTGGCGGCCAtggagcaccgcggagcctc54 ccgctcctcctcgccctcgccctcctcagcgctctctgctggcgggcaagggcgctgcccccccggPLLLALALLSALCffRARA L P P R 29120ggggccgccttccctgccgtgccgcgattgggaaacagaatgccatttgatgcagccagtgaacctGAAFPAVPRLGNRMPFDAASEP51186gaccgtgcccatgggtctttaaagtctgaatcagacattttgcagaacacactacctgaaaatgagDRAHGSLKSESDILQNTLPENE73252aaattctattttgatctgtccagaattattgatagttcccaggacagtcctgtcaaacgccactctKFYFDLSRI I D S S Q D S P V K R n S (95318gatgctgtcttcaccgacaactacagccgctttcggaagcaaatggctgtgaagaaatatttaaac
權(quán)利要求
1.一種鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法，其特征在于，用于擴(kuò)展鵝 VIP基因編碼區(qū)部分序列的特異性引物為VIP1/VIP2，擴(kuò)增鵝VIP基因CDNA5'序列的特異性巢式引物為GSP2和GSP3，3'端的特異性引物為GSP1，將測(cè)序的片段拼接，獲得鵝VIP基因cDNA全長(zhǎng)序列；用所獲得的鵝VIP基因cDNA序列作為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增鵝VIP基因DNA序列的引物，首先篩選到VIP5/VIP6和VIP7/VIP8特異性引物，擴(kuò)增出鵝VIP基因DNA兩個(gè)片段，然后根據(jù)鵝VIP基因cDNA序列和所獲得的DNA片段設(shè)計(jì)出VIP3/VIP4引物；結(jié)合鵝DNA 中PHI樣編碼序列和cDNA序列，用Primer premier 5. O設(shè)計(jì)兩對(duì)鵝PHI編碼特異性引物 PHI1/PHI2和PHI3/PHI4，用PHI特異性引物擴(kuò)增鵝PHI編碼序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，擴(kuò)展鵝VIP基因編碼區(qū)部分序列的PCR反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中2XMaster Mix Taq25ul，cDNA模板4ul，10 μ M 上下游引物各I. 5ul，ddH2018ul ;PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec, 60°C退火45sec，72°C延長(zhǎng)45sec，從第二步開(kāi)始循環(huán)38次，最后72°C延長(zhǎng)lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增鵝VIP基因DNA序列的PCR反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中Premix LA Taq30ul, DNA模板Iul，20 μ M上下游引物各lul, ddH2017ul ;PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，引物特異退火溫度VIP3/VIP座引物的退火為63°C、VIP5/VIP6和VIP7/VIP8引物的退火為60°C，退火 90sec，72°C延長(zhǎng)4min，從第二步開(kāi)始循環(huán)38次，最后72°C延長(zhǎng)20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增鵝PHI編碼序列的PCR反應(yīng)體系和條件如下PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中2XMaster Mix Taq25ul，cDNA模板6ul，10 μ M上下游引物各I. 5ul, ddH2016ul ;PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性 30seC，引物特異退火溫度PHI1/PHI2引物的退火為63°C、PHI3/PHI4引物的退火為65°C， 退火45sec，72°C延長(zhǎng)45sec，從第二步開(kāi)始循環(huán)38次，最后72°C延長(zhǎng)lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法，用于擴(kuò)展鵝VIP基因編碼區(qū)部分序列的特異性引物為VIP1/VIP2，擴(kuò)增鵝VIP基因cDNA5′序列的特異性巢式引物為GSP2和GSP3，3′端的特異性引物為GSP1，將測(cè)序的片段拼接，獲得鵝VIP基因cDNA全長(zhǎng)序列；用所獲得的鵝VIP基因cDNA序列作為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增鵝VIP基因DNA序列的引物，首先篩選到VIP5/VIP6和VIP7/VIP8特異性引物，擴(kuò)增出鵝VIP基因DNA兩個(gè)片段，然后根據(jù)鵝VIP基因cDNA序列和所獲得的DNA片段設(shè)計(jì)出VIP3/VIP4引物；結(jié)合鵝DNA中PHI樣編碼序列和cDNA序列，用Primer premier5.0設(shè)計(jì)兩對(duì)鵝PHI編碼特異性引物PHI1/PHI2和PHI3/PHI4，用PHI特異性引物擴(kuò)增鵝PHI編碼序列。采用上述方案，本發(fā)明首次獲得鵝VIP基因序列和其cDNA序列。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102604933SQ201210071270
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者何大乾, 劉毅, 吳華莉, 吳斌, 王惠影 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院