專利名稱：一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的 SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌是目前全球受累人數(shù)最多的惡性腫瘤。據(jù)國際癌癥研究署(IARC)估計(jì)， 2008年肺癌新發(fā)病例160. 7萬人，死亡137. 5萬人，位居全球范圍內(nèi)腫瘤發(fā)病率和死亡率的首位。由于持續(xù)增長的煙草消費(fèi)、環(huán)境污染以及生活方式的改變，近二十年來，我國肺癌發(fā)病和死亡一直呈上升趨勢，僅2000年至2005年間，中國肺癌的發(fā)病人數(shù)和因肺癌死亡的人數(shù)分別增加了 12萬和10萬，據(jù)估計(jì)，2008年我國男性肺癌發(fā)病率為45. 9/10萬，女性為21. 3/10萬，高于世界的平均水平并接近發(fā)達(dá)的工業(yè)化國家水平。英國著名腫瘤學(xué)家 R. Peto預(yù)言如果中國不及時控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年肺癌將超過100 萬，成為世界第一肺癌大國。由此可見，肺癌是威脅全球及我國居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。自20世紀(jì)60年代Dol 1和Hi 11通過病例-對照研究和隊(duì)列研究首次發(fā)現(xiàn)吸煙與肺癌的關(guān)系以來，煙草暴露已經(jīng)被認(rèn)為是肺癌發(fā)生的最主要環(huán)境危險因素。研究表明，吸煙者發(fā)生肺癌的風(fēng)險可比非吸煙者高出10倍。肺癌家庭聚集性的研究顯示，遺傳因素在肺癌的發(fā)生中同樣扮演重要角色。雙生子研究表明，肺癌是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果。流行病學(xué)研究表明，80%以上的肺癌可以歸咎為煙草暴露，但僅有不到20%的吸煙者發(fā)生肺癌， 說明在同等環(huán)境暴露下，具有不同遺傳背景的個體對肺癌的易感性不同。其中單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism, SNP)起重要作用。SNP是一類基于單堿基變異引起的DNA多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記。 主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占大約90%。 這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感性和對環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。因此SNP可能是導(dǎo)致個體對常見疾病發(fā)病和預(yù)后易感性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。利用疾病易感的SNP譜預(yù)測疾病的發(fā)生，不僅靈敏、準(zhǔn)確和快速，具有廣闊的應(yīng)用前景，而且通過SNP預(yù)測譜的構(gòu)建，還可以對疾病作出前瞻性的診斷。 近年來，利用SNP預(yù)測疾病的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn)，在腫瘤和心腦血管疾病等常見重大疾病預(yù)測上的應(yīng)用價值已初見端倪。然而，目前還沒有將SNP應(yīng)用于原發(fā)性肺癌診斷的報道，若能篩選出原發(fā)性肺癌易感的SNP作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對我國原發(fā)性肺癌診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。本發(fā)明的第二個目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性引物。本發(fā)明的第三個目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對。本發(fā)明的第四個目的是提供上述SNP標(biāo)志物及其特異性引物和特異性熒光探針在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明第五個目的是提供原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒。發(fā)明人通過分離和研究原發(fā)性肺癌患者及與其年齡匹配的健康對照外周血DNA 中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與原發(fā)性肺癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應(yīng)用的原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒，為原發(fā)性肺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，該標(biāo)志物為rsl07401、rs465498、 rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rsl544694、rsl663689、 rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rsl0066153、 rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、rsl3000907、 rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、rsl039119、 rsl726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894545、 rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、rsl2793370、 rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642 的組合。所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物，這些引物為rsl07401 的引物序列為 SEQ ID No:liPSEQ ID No :2 ;rs465498 的引物序列為 SEQID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rs663414 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rs622917 的引物序列為 SEQ ID No:13 禾口 SEQ ID No :14 ;rs636586 的引物序列為 SEQID No: 17 禾口 SEQ ID No :18 ;rs741061 的引物序列為 SEQ ID No :21 禾口 SEQ ID No 22 ；rs855641 的引物序列為SEQ ID No 25和SEQ ID No 26 ；rs948783的引物序列為SEQID No 29和 SEQ ID No 30 ；rsl544694 的引物序列為 SEQ ID No :33 禾口 SEQ ID No 34 ；rsl663689 的引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No :38 ;rs2030378 的引物序列為 SEQID No :41 和 SEQ ID No 42 ；rs2225588 的引物序列為 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No 46 ；rs2317683 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rs2395166 的引物序列為 SEQID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rs2405271 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ；rs2788713 的引物序列為 SEQ ID No 61 和 SEQ ID No 62 ；rs3130975 的引物序列為 SEQID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rs4344933 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No 70 ；rs4488809 的引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No :74 ;rs4493136 的引物序列為 SEQ ID No 77 和 SEQ ID No: 78 ；rs4669621 的引物序列為 SEQ ID No 81 和 SEQ IDNo 82 ；rs4697406 的引物序列為 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No :86 ;rs4749794 的引物序列為 SEQ ID No 89 和 SEQ ID No 90 ； rs4809957 的引物序列為 SEQ ID No 93 和 SEQ ID No 94 ；rs6102795 的引物序列為 SEQ ID No 97 和 SEQ ID No 98 ；rs6490820 的引物序列為 SEQ ID No :101 和 SEQ ID No :102 ；
8rs9317873 的引物序列為 SEQ IDNo :105 和 SEQ ID No :106 ;rs9373105 的引物序列為 SEQ ID No :109 和 SEQ IDNo :110 ；rs9397087 的引物序列為 SEQ ID No :113 和 SEQ ID No :114 ； rs946;3490 的引物序列為 SEQ ID No :117 和 SEQ ID No :118 ；rsl0066153 的引物序列為 SEQ IDNo :121 禾口 SEQ ID No :122 ；rsl 1144475 的引物序列為 SEQ ID No :125 和 SEQ IDNo :126 ； rslll55^6 的引物序列為 SEQ ID No :129 禾口 SEQ ID No :130 ;rsll264579 的引物序列為 SEQ ID No :133 和 SEQ ID No :134 ;rsll907465 的引物序列為 SEQ IDNo :137 和 SEQ ID No: 138 ；rsl2050469 的引物序列為 SEQ ID No :141 和 SEQ IDNo :142 ；rsl2992554 的引物序列為 SEQ ID No :145 和 SEQ ID No :146 ；rsl3000907 的引物序列為 SEQ ID No :149 禾口 SEQ ID No 150 ；rsl6883398 的引物序列為 SEQ IDNo :153和 SEQ ID No 1 ;rsl6959825 的引物序列為 SEQ ID No :157和 SEQ IDNo :158 ；rsl7058190 的引物序列為 SEQ ID No :161 和 SEQ ID No 162 ；rsl7075390 的引物序列為 SEQ ID No :165 和 SEQ ID No :166 ；rsl7728461 的引物序列為 SEQ IDNo 169 和 SEQ ID No :170 ；rsl014588 的引物序列為 SEQ ID No :173 和 SEQ IDNo :174 ;rsl039119 的引物序列為 SEQ ID No :177 和 SEQ ID No :178 ；rsl726744 的引物序列為 SEQ ID No :181 和 SEQ ID No :182 ；rs2^5947 的引物序列為 SEQ ID No :185 和 SEQ ID No 186 ；rs2895680 的引物序列為 SEQ ID No :189和 SEQ ID No :190 ；rs3969178 的引物序列為 SEQ ID No :193 和 SEQ ID No :194 ；rs4693311 的引物序列為 SEQ ID No :197 和 SEQ ID No 198 ；rs4766994 的引物序列為 SEQ ID No :201 和 SEQ IDNo :202 ；rs4894545 的引物序列為 SEQ ID No :205 和 SEQ ID No :206 ；rs4940849 的引物序列為 SEQ ID No :209 和 SEQ ID No 210 ；rs6490294 的引物序列為 SEQ ID No :213 和 SEQ ID No :214 ；rs6780858 的引物序列為 SEQ ID No 217 和 SEQ ID No :218 ；rs9439527 的引物序列為 SEQ ID No :221 和 SEQ ID No 222 ；rs9556016 的引物序列為 SEQ ID No :225 和 SEQ ID No :226 ；rsl2002185 的引物序列為 SEQ ID No :229 和 SEQID No :230 ；rsl2793370 的引物序列為 SEQ ID No :233 和 SEQ ID No 234 ；rsl549058 的引物序列為 SEQ ID No :237 和 SEQ ID No :238 ；rs2736100 的引物序列為 SEQ IDNo 241 和 SEQ ID No :242 ；rs6043705 的引物序列為 SEQ ID No :245 和 SEQ IDNo 246 ；rsll699642 的引物序列為 SEQ ID No :249 和 SEQ ID No :250。所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對，這些熒光探針為rsl07401的熒光探針對序列為SEQ ID No :3和SEQ ID No 4 ；rs465498的熒光探針對序列為SEQ ID No :7和SEQ ID No :8 ;rs663414的熒光探針對序列為SEQ ID No:ll禾口 SEQ ID No 12 ；rs622917 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ；rs636586 的熒光探針對序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No 20 ；rs741061的熒光探針對序列為SEQ ID No 23 和 SEQ ID No 24 ；rs855641 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 27 和 SEQ ID No 28 ； rs948783的熒光探針對序列為SEQ ID No 31和SEQ ID No 32 ；rsl544694的熒光探針對序列為SEQ ID No 35和SEQ ID No 36 ；rsl663689的熒光探針對序列為SEQ ID No 39和 SEQ ID No 40 ；rs2030378 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :43 和 SEQ IDNo 44 ；rs2225588 的熒光探針對序列為SEQ ID No:47和SEQ ID No 48 ；rs2317683的熒光探針對序列為SEQ ID No 51 和 SEQ ID No 52 ；rs2395166 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo 55 和 SEQ ID No 56 ；rs2405271的熒光探針對序列為SEQ ID No 59和SEQ ID No 60 ；rs2788713的熒光探針對序列為SEQ ID No 63和SEQ ID No 64 ；rs3130975的熒光探針對序列為SEQ ID No 67 和 SEQ ID No :68 ;rs4344933 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :71 和 SEQ ID No 72 ；rs4488809的熒光探針對序列為SEQ ID No:75和SEQ ID No 76 ；rs4493136的熒光探針對序列為SEQ ID No 79和SEQ ID No 80 ；rs4669621的熒光探針對序列為SEQ ID No 83和 SEQ ID No 84 ；rs4697406 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :87 和 SEQ ID No 88 ；rs4749794 的熒光探針對序列為SEQ ID No:91和SEQ ID No 92 ；rs4809957的熒光探針對序列為SEQ ID No 95 和 SEQ ID No 96 ；rs6102795 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 99 和 SEQ ID No 100 ；rs6490820 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :103 和 SEQ ID No :104 ；rs9317873 的熒光探針對序列為SEQ ID No 107和SEQ IDNo :108 ；rs9373105的熒光探針對序列為SEQ ID No :111 和 SEQ ID No :112 ;rs9397087 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :115 和 SEQ ID No: 116 ；rs9463490 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :119禾口 SEQ ID No :120 ；rsl0066153 的熒光探針對序列為SEQ ID No :123和SEQ ID No 124 ；rsl 1144475的熒光探針對序列為SEQ ID No :127和 SEQ ID No 128 ；rsl 1155286 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :131 和 SEQ ID No 132 ；rsll264579 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :135 和 SEQ ID No :136 ；rsll907465 的熒光探針對序列為SEQID No :139和SEQ ID No :140 ；rsl2050469的熒光探針對序列為SEQ ID No :143 和 SEQ IDNo :144 ；rsl2992554 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :147 和 SEQ ID No 148 ；rsl3000907 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :151 和 SEQ ID No :152 ；rsl6883398 的熒光探針對序列為SEQ ID No 155和SEQ ID No :156 ；rsl6959825的熒光探針對序列為SEQ ID No :159 禾口 SEQ ID No :160 ；rsl7058190 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :163 和 SEQ ID No 164 ；rsl7075390 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :167 和 SEQ ID No :168 ；rsl7728461 的熒光探針對序列為SEQ ID No :171和SEQ ID No :172 ;rsl014588的熒光探針對序列為 SEQID No :175 和 SEQ ID No :176 ;rsl039119 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :179 禾口 SEQ IDNo 180 ；rsl726744 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :183 和 SEQ ID No :184 ；rs2285947 的熒光探針對序列為SEQ ID No :187和SEQ ID No :188 ;rs2895680的熒光探針對序列為 SEQ ID No 191 和 SEQ ID No :192 ；rs3969178 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :195 和 SEQ ID No 196 ；rs4693311 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :199 和 SEQ ID No :200 ；rs4766994 的熒光探針對序列為SEQ ID No :203和SEQ ID No :204 ;rs4894545的熒光探針對序列為 SEQ ID No :207 和 SEQ ID No :208 ；rs4940849 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :211 和 SEQ ID No 212 ；rs6490294 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :215 和 SEQ IDNo :216 ；rs6780858 的熒光探針對序列為SEQ ID No :219和SEQ ID No :220 ；rs9439527的熒光探針對序列為SEQ ID No 223 和 SEQ ID No :224 ；rs9556016 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :227 和 SEQ ID No 228 ；rsl2002185 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :231 和 SEQ ID No :232 ；rsl2793370 的熒光探針對序列為SEQ ID No :235和SEQ ID No :236 ;rslM9058的熒光探針對序列為 SEQ ID No :239 禾口 SEQ ID No :240 ；rs2736100 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :243 禾口 SEQ ID No 244 ；rs6043705 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :247 和 SEQ ID No :248 ；rsll699642 的熒光探針對序列為SEQ ID No 251和SEQ IDNo :252。所述的SNP標(biāo)志物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。一種原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測外周血DNA中rsl07401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rsl544694、 rsl663689、 rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、 rs9317873、 rs9373105、 rs9397087、 rs9463490、 rsl0066153、rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、 rsl3000907,rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390,rsl7728461、rsl014588、 rsl039119、rsl726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、 rs4894545、rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、 rsl2793370、rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標(biāo)志物的特異性引物和/或特異性熒光探針。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性引物為rsl07401 的引物序列為 SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2 ;rs465498 的引物序列為 SEQID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rs663414 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rs622917 的引物序列為 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No :14 ;rs636586 的引物序列為 SEQID No: 17 禾口 SEQ ID No :18 ;rs741061 的引物序列為 SEQ ID No :21 禾口 SEQ ID No 22 ；rs855641 的引物序列為SEQ ID No:25和SEQ ID No :26 ;rs948783的引物序列為SEQID No丨9和 SEQ ID No 30 ；rsl544694 的引物序列為 SEQ ID No :33 禾口 SEQ ID No 34 ；rsl663689 的引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No :38 ;rs2030378 的引物序列為 SEQID No :41 和 SEQ ID No :42 ;rs2225588 的引物序列為 SEQ ID No 45 和 SEQ ID No :46 ;rs2317683 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rs2395166 的引物序列為 SEQID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rs2405271 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ；rs2788713 的引物序列為 SEQ ID No 61 和 SEQ ID No 62 ；rs3130975 的引物序列為 SEQID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rs4344933 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No 70 ；rs4488809 的引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No :74 ;rs4493136 的引物序列為 SEQ ID No 77 和 SEQ ID No: 78 ；rs4669621 的引物序列為 SEQ ID No 81 和 SEQ IDNo 82 ；rs4697406 的引物序列為 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No :86 ;rs4749794 的引物序列為 SEQ ID No 89 和 SEQ ID No 90 ； rs4809957 的引物序列為 SEQ ID No 93 和 SEQ ID No 94 ；rs6102795 的引物序列為 SEQ ID No 97 和 SEQ ID No 98 ；rs6490820 的引物序列為 SEQ ID No :101 和 SEQ ID No :102 ； rs9317873 的引物序列為 SEQ IDNo :105 和 SEQ ID No :106 ;rs9373105 的引物序列為 SEQ ID No :109 禾口 SEQ IDNo :110 ；rs9397087 的引物序列為 SEQ ID No :113 和 SEQ ID No :114 ； rs946;3490 的引物序列為 SEQ ID No :117 和 SEQ ID No :118 ；rsl0066153 的引物序列為 SEQ IDNo :121 禾口 SEQ ID No :122 ；rslll44475 的引物序列為 SEQ ID No :125 和 SEQ IDNo :126 ； rslll55^6 的引物序列為 SEQ ID No :129 禾口 SEQ ID No :130 ;rsll264579 的引物序列為 SEQ ID No :133 和 SEQ ID No :134 ;rsll907465 的引物序列為 SEQ IDNo :137 和 SEQ ID No: 138 ；rsl2050469 的引物序列為 SEQ ID No :141 和 SEQ IDNo :142 ；rsl2992554 的引物序列為 SEQ ID No :145 和 SEQ ID No :146 ；rsl3000907 的引物序列為 SEQ ID No :149 禾口 SEQ ID No 150 ；rsl6883398 的引物序列為 SEQ IDNo :153和 SEQ ID No :154 ；rsl6959825 的引物序列為 SEQ ID No :157和 SEQ IDNo :158 ；rsl7058190 的引物序列為 SEQ ID No :161 和 SEQ IDNo 162 ；rsl7075390 的引物序列為 SEQ ID No :165 和 SEQ ID No :166 ；rsl7728461 的引物序列為 SEQ IDNo 169 和 SEQ ID No :170 ；rsl014588 的引物序列為 SEQ ID No :173 和 SEQ IDNo 174 ；rsl039119 的引物序列為 SEQ ID No :177 禾Π SEQ ID No :178 ；rsl726744 的引物序列為 SEQ ID No :181 和 SEQ ID No :182 ；rs2^5947 的引物序列為 SEQ ID No :185 和 SEQ ID No 186 ；rs2895680 的引物序列為 SEQ ID No :189和 SEQ ID No :190 ；rs3969178 的引物序列為 SEQ ID No :193 和 SEQ ID No :194 ；rs4693311 的引物序列為 SEQ ID No :197 禾口 SEQ ID No 198 ；rs4766994 的引物序列為 SEQ ID No :201 和 SEQ IDNo :202 ；rs4894545 的引物序列為 SEQ ID No :205 和 SEQ ID No :206 ；rs4940849 的引物序列為 SEQ ID No :209 禾口 SEQ ID No 210 ；rs6490294 的引物序列為 SEQ ID No :213 和 SEQ ID No :214 ；rs6780858 的引物序列為 SEQ ID No 217 和 SEQ ID No :218 ；rs9439527 的引物序列為 SEQ ID No :221 和 SEQ ID No 222 ；rs9556016 的引物序列為 SEQ ID No :225 和 SEQ ID No :226 ；rsl2002185 的引物序列為 SEQ ID No :229 和 SEQID No :230 ；rsl2793370 的引物序列為 SEQ ID No :233 和 SEQ ID No 234 ；rsl549058 的引物序列為 SEQ ID No :237 和 SEQ ID No :238 ；rs2736100 的引物序列為 SEQ IDNo 241 和 SEQ ID No :242 ；rs6043705 的引物序列為 SEQ ID No :245 和 SEQ IDNo 246 ；rsll699642 的引物序列為 SEQ ID No :249 和 SEQ ID No :250。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對為rsl07401的熒光探針對序列為SEQ ID No :3和SEQ ID No 4 ；rs465498的熒光探針對序列為SEQ ID No :7和SEQ ID No :8 ;rs663414的熒光探針對序列為SEQ ID No:ll禾口 SEQ ID No 12 ；rs622917 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ；rs636586 的熒光探針對序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No 20 ；rs741061的熒光探針對序列為SEQ ID No 23 和 SEQ ID No 24 ；rs855641 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 27 和 SEQ ID No 28 ； rs948783的熒光探針對序列為SEQ ID No 31和SEQ ID No 32 ；rsl544694的熒光探針對序列為SEQ ID No 35和SEQ ID No 36 ；rsl663689的熒光探針對序列為SEQ ID No 39和 SEQ ID No 40 ；rs2030378 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :43 和 SEQ IDNo 44 ；rs2225588 的熒光探針對序列為SEQ ID No:47和SEQ ID No 48 ；rs2317683的熒光探針對序列為SEQ ID No 51 和 SEQ ID No 52 ；rs2395166 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo 55 和 SEQ ID No 56 ；rs2405271的熒光探針對序列為SEQ ID No 59和SEQ ID No 60 ；rs2788713的熒光探針對序列為SEQ ID No 63和SEQ ID No 64 ；rs3130975的熒光探針對序列為SEQ ID No 67 和 SEQ ID No :68 ;rs4344933 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :71 和 SEQ ID No 72 ； rs4488809的熒光探針對序列為SEQ ID No:75和SEQ ID No 76 ；rs4493136的熒光探針對序列為SEQ ID No 79和SEQ ID No 80 ；rs4669621的熒光探針對序列為SEQ ID No 83和 SEQ ID No 84 ；rs4697406 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :87 和 SEQ ID No 88 ；rs4749794 的熒光探針對序列為SEQ ID No:91和SEQ ID No 92 ；rs4809957的熒光探針對序列為SEQ ID No :95 禾口 SEQ ID No 96 ；rs6102795 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :99 禾口 SEQ ID No 100 ；rs6490820 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :103 和 SEQ ID No :104 ；rs9317873 的熒光探針對序列為SEQ ID No :107和SEQ IDNo :108 ;rs9373105的熒光探針對序列為SEQ ID No :111 和 SEQ ID No :112 ;rs9397087 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :115 和 SEQ ID No: 116 ；rs946;3490 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :119和 SEQ ID No :120 ；rsl0066153 的熒光探針對序列為SEQ ID No :123和SEQ ID No :124 ；rsl 1144475的熒光探針對序列為SEQ IDNo :127 和 SEQ ID No 128 ；rslll55286 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :131 和 SEQ ID No: 132 ；rsll264579 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :135和 SEQ ID No :136 ；rsll907465 的熒光探針對序列為SEQID No :139和SEQ ID No :140 ；rsl2050469的熒光探針對序列為SEQ ID No :143 和 SEQ IDNo :144 ;rsU992554 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :147 和 SEQ ID No: 148 ；rsl3000907 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :151 和 SEQ ID No :152 ；rsl6883398 的熒光探針對序列為SEQ ID No 155和SEQ ID No :156 ；rsl6959825的熒光探針對序列為SEQ ID No :159 禾口 SEQ ID No :160 ；rsl7058190 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :163 和 SEQ ID No 164 ；rsl7075390 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :167 和 SEQ ID No :168 ；rsl7728461 的熒光探針對序列為SEQ ID No :171和SEQ ID No :172 ;rsl014588的熒光探針對序列為 SEQID No 175 和 SEQ ID No :176 ；rsl039119 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :179 和 SEQ IDNo 180 ；rsl726744 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :183 和 SEQ ID No :184 ；rs2285947 的熒光探針對序列為SEQ ID No :187和SEQ ID No :188 ;rs2895680的熒光探針對序列為 SEQ ID No 191 和 SEQ ID No :192 ；rs3969178 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :195 和 SEQ ID No 196 ；rs4693311 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :199 和 SEQ ID No :200 ；rs4766994 的熒光探針對序列為SEQ ID No 203和SEQ ID No :204 ；rs4894545的熒光探針對序列為 SEQ ID No :207 和 SEQ ID No :208 ；rs4940849 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :211 和 SEQ ID No 212 ；rs6490294 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :215 和 SEQ IDNo :216 ；rs6780858 的熒光探針對序列為SEQ ID No :219和SEQ ID No :220 ；rs9439527的熒光探針對序列為SEQ ID No 223 和 SEQ ID No :224 ；rs9556016 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :227 和 SEQ ID No 228 ；rsl2002185 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :231 和 SEQ ID No :232 ；rsl2793370 的熒光探針對序列為SEQ ID No :235和SEQ ID No :236 ;rslM9058的熒光探針對序列為 SEQ ID No :239 禾口 SEQ ID No :240 ；rs2736100 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :243 禾口 SEQ ID No 244 ；rs6043705 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo :247 和 SEQ ID No :248 ；rsl 1699642 的熒光探針對序列為SEQ ID No 251和SEQ IDNo :252。所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰＞唧w地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括(1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。( 基因型檢測選擇原發(fā)性肺癌病例，與原發(fā)性肺癌病例年齡、性別匹配的對照，利用高密度SNP芯片，在全基因組范圍內(nèi)找出與原發(fā)性肺癌相關(guān)的SNP。(3)對篩選出的陽性關(guān)聯(lián)SNP，進(jìn)一步在另外的樣本中進(jìn)行檢測，以判斷其關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定性。(4)原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒的研制根據(jù)原發(fā)性肺癌病例和健康對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP 開發(fā)SNP輔助診斷試劑盒。本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料等，并采用了 Affymetrixe. O芯片進(jìn)行全基因組掃描，TaqMan基因分型進(jìn)行單個位點(diǎn)的檢測等。具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個部分1.研究樣本的選擇(1)臨床確診為原發(fā)性肺癌；
(2)與病例年齡、性別匹配的對照；本研究共采用9934例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/ μ 1DNA,純度(紫外 2600D 與 2800D 比值)在 1. 6-2. 0。3. Affymetrix 6. 0 芯片檢測(1)取受試者全基因組DNA樣本；(2)在Affymetrix 6. 0芯片(購于美國昂飛公司，下同)上進(jìn)行全基因組掃描；(3)檢測并比較各基因型在原發(fā)性肺癌病例與健康對照中的分別差異。4.單個SNP的TaqMan基因分型(1)取受試者DNA樣本；(2)設(shè)計(jì)單個SNP的特異性引物和特異性熒光探針對；(3)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)；(4)檢測并比較原發(fā)性肺癌病例與健康對照中不同基因型的分布差異。5.診斷試劑盒制備方法Affymetrix6. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描和單個SNP檢測后確定原發(fā)性肺癌病例與健康對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為原發(fā)性肺癌診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與原發(fā)性肺癌發(fā)病有關(guān)的SNP組成輔助診斷試劑盒rsl07401、rs465498、rs663414、 rs622917、rs636586、rs74106U rs855641、rs948783、rsl544694、rsl663689、rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rsl0066153、rslll44475、 rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、rsl3000907、rsl6883398、 rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、rsl039119、rsl726744、 rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894545、rs4940849、 rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、rsl2793370、rsl549058、 rs2736100、rs6043705和rsl 169964 。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性引物和特異性熒光探針對，以及Taq酶、dNTP等試劑。6.統(tǒng)計(jì)分析方法運(yùn)用χ 2檢驗(yàn)(用于分類變量)或者student檢驗(yàn)(用于連續(xù)性變量)比較人口學(xué)特征等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。為了進(jìn)一步研究這63個SNP構(gòu)成的綜合指征用于早期診斷的效果，我們構(gòu)建了一個數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個SNP與原發(fā)性肺癌發(fā)病的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。具體來說，我們對每個SNP的三種基因型進(jìn)行評分，野生純合型=“0”，雜合型=“1”，變異純合型=“2”，以單個SNP分析時的additive模型下的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個 SNP的情況給每個研究研究對照確定一個危險分值。危險分值的計(jì)算方法如下危險分值=(-0. 15Xrs9439527 的評分)+ (0. 33Xrsl7728461 的評分)+ (0. 14Xrs2225588 的評分)+ (0. 25Xrs510321 的評分)+ (-0. 12Xrs663414 的評分)+ (0. 14Xrs4669621 的評分)+ (0. 25Xrs6490294 的評分)+ (0. 13Xrs4894545 的評分)+ (0. 14Xrs6780858 的評分)+ (-0. 16Xrs 107401 的評分)+ (-0. 16Xrs 1663689 的評分)+ (0. 16Xrs4697406 的評分)+ (0. 18Xrsl014588 的評分)+ (-0. 13Xrs2405271 的評分)+ (-0. 16Xrs6490820 的評分)+ (-0. 20Xrs9463490 的評分)+ (0. 27Xrs2788713 的評分)+ (0. 22Xrs855641 的評分)+ (-0. 22Xrs3130975 的評分)+ (-0. 16Xrs9397087 的評分)+ (0. 20Xrs622917 的評分)+ (0. 20Xrsl2793370 的評分)+ (0. 14Xrsl 1155286 的評分)+ (0. 15Xrs2285947 的評分)+ (0. 21Xrs2395166 的評分)+ (0. 22Xrs741061 的評分)+ (-0. 17Xrsl7058190 的評分)+ (-0. 17Xrsl 1144475 的評分)+ (-0. 14Xrsl2002185 的評分)+ (0. 16Xrs4749794 的評分)+ (-0. 14Xrsl6883398 的評分)+ (0. 13Xrsl726744 的評分)+ (-0. 17Xrs2030378 的評分)+ (0. 19Xrs2895680 的評分)+ (0. 25Xrs4940849 的評分)+ (-0. 22Xrs3969178 的評分)+ (0. 19Xrs6102795 的評分)+ (-0. 15Xrsl7075390 的評分)+ (0. 14Xrs9317873 的評分)+ (0. 13Xrs9556016 的評分)+ (0. 17Xrs4809957 的評分)+ (-0. 24Xrsl2050469 的評分)+ (0. 14Xrsl6959825 的評分)+ (0. 26Xrs9373105 的評分)+ (0. 12Xrs948783 的評分)+ (-0. 13Xrsl 1907465 的評分)+ (-0. 22Xrs6043705 的評分)+ (0. 16Xrs2317683 的評分)+ (0. 17Xrsl 1264579 的評分)+ (0. 17Xrs636586 的評分)+ (-0. 14Xrsl3000907 的評分)+ (-0. 17Xrsl544694 的評分)+ (0. 25Xrsl2992554 的評分)+ (0. 18Xrsl 1699642 的評分)+ (-0. 17Xrs4493136 的評分)+ (0. 18Xrs4766994 的評分)+ (0. ^Xrs4344933 的評分)+ (0. 18Xrs4488809 的評分)+ (0. 28Xrsl039119 的評分)+ (-0. 15Xrs4693311 的評分)+ (0. 16Xrs2736100 的評分)+ (-0. 28Xrs465498 的評分)+ (-0. 17Xrsl0066153 的評分))，獲得的危險分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究的M08例樣本中。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成(PLINK1. 07)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平 P值設(shè)為0. 05，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明在上述2331例符合條件的原發(fā)性肺癌病例及3077例健康對照中，兩組年齡、性別均衡可比。我們將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描獲得相關(guān)結(jié)果。根據(jù)Affymetrixe. 0芯片檢測，本發(fā)明人檢測到在“原發(fā)性肺癌病例”組和“健康對照”組中基因型分布頻率存在差異的SNP包括rsl07401、rs465498、rs663414、 rs622917、rs636586、rs74106U rs855641、rs948783、rsl544694、rsl663689、rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs240527U rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820, rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rsl0066153, rslll44475、 rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、rsl3000907、rsl6883398、 rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、rsl039119、rsl726744、 rs2283947、rs2893680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894343、rs4940849、 rs6490294, rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、rs 12793370、rsl549058、 rs2736100、rs6043705 和 rsll699642。根據(jù)上述檢測結(jié)果，我們將這63個與原發(fā)性肺癌發(fā)病相關(guān)的SNP在另外2283例原發(fā)性肺癌病例和與其年齡、性別匹配的2243例健康對照中進(jìn)行了單個SNP的檢測，結(jié)果與芯片檢測一致。單因素和多因素Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這63個SNP與原發(fā)性肺癌的發(fā)
15病存在著顯著關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步分析這63個SNP的組合用于原發(fā)性肺癌診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠很好的區(qū)分病例與對照。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于原發(fā)性肺癌輔助診斷的試劑盒， 包含測定受試者血標(biāo)本DNA中上述SNP的特異性引物、特異性熒光探針對和其他檢測試劑。具體而言，這63個SNP的組合，或者這63個SNP的特異性引物及特異性熒光探針對的組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于原發(fā)性肺癌的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。本發(fā)明有益效果本發(fā)明提供的SNP標(biāo)志物作為原發(fā)性肺癌輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于(I)SNP是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為原發(fā)性肺癌的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。O) SNP試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于原發(fā)性肺癌的輔助診斷，有助于反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。(3)采用嚴(yán)密的驗(yàn)證和評價體系，本發(fā)明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取疾病相關(guān)的SNP譜，并應(yīng)用TaqMan基因分型方法在大樣本中進(jìn)行了驗(yàn)證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了 SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。本發(fā)明通過控制年齡、性別、吸煙等對疾病發(fā)展的影響因素，研究SNP在原發(fā)性肺癌輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述SNP對于原發(fā)性肺癌進(jìn)展的影響，揭示其診斷價值。因此，本發(fā)明獲得了原發(fā)性肺癌發(fā)病相關(guān)SNP譜和特異性標(biāo)志物；通過SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得原發(fā)性肺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。


圖1 顯示全基因組關(guān)聯(lián)研究病例組和對照組的ROC曲線。顯示原發(fā)性肺癌病例組對健康對照組為參照的ROC曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理發(fā)明人于2005月4月開始至2011年1月從南京醫(yī)科大學(xué)腫瘤中心收集了大量的原發(fā)性肺癌患者血標(biāo)本，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 9934例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本全基因組芯片掃描和單個SNP TaqMan基因分型的實(shí)驗(yàn)樣品1、病理組織學(xué)確診的原發(fā)性肺癌患者；2、與病例年齡、性別匹配的健康對照；并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
實(shí)施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描在上述符合條件的2331例原發(fā)性肺癌患者和3077例健康對照中，兩組年齡、性別匹配。將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe.O芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為1、向儲存于2ml凍存管中的白細(xì)胞加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。2、去除紅細(xì)胞用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至細(xì)1，顛倒混勻，4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入細(xì)1溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄上清。3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122. 5ml 0.2M氯化鈉， 14.4ml 0. 5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二烷基硫酸鈉，148. Iml雙蒸水，下同)和8 μ 1蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。4、去除蛋白質(zhì)加Iml飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿異戊醇=M 1，v/v，下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清(分入兩個1. 5ml的離心管)。5、DNA沉淀在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。6、DNA洗滌在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心lOmin，棄上清后真空抽
干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。7、測量濃度通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在 1. 6-2. O。8、進(jìn)行全基因組掃描；9、數(shù)據(jù)分析與處理在“原發(fā)性肺癌病例”組和“健康對照”組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見表1。表1病例組與對照組全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為rsl07401、 rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rsl544694、 rsl663689、 rs2030378、 rs2225588、 rs2317683、 rs2395166、 rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、rs4344933、rs4488809、rs4493136、rs4669621、rs4697406、rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、 rs9317873、 rs9373105、 rs9397087、 rs9463490、 rsl0066153、rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、rsl2992554、 rsl3000907、rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、rsl014588、 rsl039119、rsl726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、 rs4894545, rs4940849、rs6490294, rs6780858、rs9439527、rs9556016、rsl2002185、 rsl2793370、rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642 的組合。
2.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物，其特征在于該引物為 rs 107401 的引物序列為 SEQ ID No 1 和 SEQ ID No 2 ；rs465498 的引物序列為 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ； rs663414 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rs622917 的引物序列為 SEQ ID No 13 和 SEQ ID No 14 ； rs636586 的引物序列為 SEQ ID No 17 和 SEQ ID No 18 ； rs741061 的引物序列為 SEQ ID No 21 和 SEQ ID No 22 ； rs855641 的引物序列為 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ；rs948783的引物序列為SEQ ID No 29 禾口 SEQ ID No 30 ；rsl544694的引物序列為SEQIDNo33 禾口SEQIDNo34 ；rsl663689的引物序列為SEQIDNo:37和SEQIDNo38 ；rs2030378的引物序列為SEQIDNo41 禾 PSEQIDNo42 ；rs2225588的引物序列為SEQIDNo45和SEQIDNo46 ；rs2317683的引物序列為SEQIDNo49 禾PSEQIDNo50 ；rs2395166的引物序列為SEQIDNo53 禾口SEQIDNo54 ；rs2405271的引物序列為SEQIDNo:57 禾口SEQIDNo58 ；rs2788713的引物序列為SEQIDNo61 禾口SEQIDNo62 ；rs3130975的引物序列為SEQIDNo65 禾口SEQIDNo66 ；rs4344933的引物序列為SEQIDNo69 禾口SEQIDNo70 ；rs4488809的引物序列為SEQIDNo:73和SEQIDNo74 ；rs4493136的引物序列為SEQIDNo:77和SEQIDNo78 ；rs4669621的引物序列為SEQIDNo81 禾口SEQIDNo82 ；rs4697406的引物序列為SEQIDNo85和SEQIDNo86 ；rs4749794的引物序列為SEQIDNo89和SEQIDNo90 ；rs4809957的引物序列為SEQIDNo93和SEQIDNo94 ；rs6102795的引物序列為SEQIDNo97和SEQIDNo98 ；rs6490820的引物序列為SEQIDNo:101和 SEQ ID No102rs9317873的引物序列為SEQIDNo105 和 SEQ ID No106rs9373105的引物序列為SEQIDNo109 和 SEQ ID No110rs9397087 的引物序列為 SEQ ID No :113 和 SEQ ID No :114 ； rs9463490 的引物序列為 SEQ ID No :117 和 SEQ ID No :118 ；rsl0066153的引物序列為SEQIDNo121 禾口 SEQIDNo122rsl 1144475的引物序列為SEQIDNo:125 禾口 SEQIDNo126rsl 1155286的引物序列為SEQIDNo:129 禾口 SEQIDNo130rsll264579的引物序列為SEQIDNo:133 禾口 SEQIDNo134rsl 1907465的引物序列為SEQIDNo:137 禾口 SEQIDNo138rs 12050469的引物序列為SEQIDNo141 禾口 SEQIDNo142rsl2992554的引物序列為SEQIDNo:145 和 SEQIDNo146rs 13000907的引物序列為SEQIDNo:149 和 SEQIDNo150rs 16883398的引物序列為SEQIDNo:153 禾口 SEQIDNo154rs 16959825的引物序列為SEQIDNo:157 禾口 SEQIDNo158rsl7058190的引物序列為SEQIDNo:161 禾口 SEQIDNo162rs 17075390的引物序列為SEQIDNo165 和 SEQIDNo166rs 17728461的引物序列為SEQIDNo:169 和 SEQIDNo170rsl014588的引物序列為SEQIDNo 173和SEQIDNo 174rsl039119的引物序列為SEQIDNo 177和SEQIDNo 178rsl726744的引物序列為SEQIDNo 181和SEQIDNo 182rs2285947的引物序列為SEQIDNo 185和SEQIDNo 186rs2895680的引物序列為SEQIDNo 189和SEQIDNo 190rs3969178的引物序列為SEQIDNo 193和SEQIDNo 194rs4693311的引物序列為SEQIDNo 197和SEQIDNo 198rs4766994的引物序列為SEQIDNo 201和SEQIDNo 202rs4894545的引物序列為SEQIDNo 205和SEQIDNo 206rs4940849的引物序列為SEQIDNo 209和SEQIDNo 210rs6490294的引物序列為SEQIDNo 213和SEQIDNo 214rs6780858的引物序列為SEQIDNo 217和SEQIDNo 218rs9439527的引物序列為SEQIDNo 221和SEQIDNo 222rs9556016的引物序列為SEQIDNo 225和SEQIDNo 226rsl2002185 的引物序列為 SEQ ID No :229 和 SEQ ID No :230 ；rsl2793370 的引物序列為 SEQ ID No :233 和 SEQ ID No :234 ；rsl549058 的引物序列為 SEQ ID No :237 和 SEQ ID No :238 ；rs2736100 的引物序列為 SEQ ID No :241 和 SEQ ID No :242 ；rs6043705 的引物序列為 SEQ ID No :245 和 SEQ ID No :246 ；rsll699642 的引物序列為 SEQ ID No :249 和 SEQ ID No :250。
3.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對，其特征在于該熒光探針為rsl07401的熒光探針對序列為SEQ ID No 3和SEQ ID No 4 ；rs465498的熒光探針對序列為SEQ ID No 7和SEQ ID No 8 ；rs663414的熒光探針對序列為SEQ ID No 11和SEQ ID No 12 ；rs622917的熒光探針對序列為SEQID No 15和SEQID No 16 ；rs636586的熒光探針對序列為SEQID No 19和SEQID No 20 ；rs741061的熒光探針對序列為SEQID No 23和SEQID No 24 ；rs855641的熒光探針對序列為SEQID No 27和SEQID No 28 ；rs948783的熒光探針對序列為SEQID No :31和SEQID No 32 ；rsl544694的熒光探針對序列為SEQIDNo35 禾口SEQIDNo36 ；rsl663689的熒光探針對序列為SEQIDNo39 禾口SEQIDNo40 ；rs2030378的熒光探針對序列為SEQIDNo43和SEQIDNo44 ；rs2225588的熒光探針對序列為SEQIDNo47和SEQIDNo48 ；rs2317683的熒光探針對序列為SEQIDNo51和SEQIDNo52 ；rs2395166的熒光探針對序列為SEQIDNo55和SEQIDNo56 ；rs2405271的熒光探針對序列為SEQIDNo59和SEQIDNo60 ；rs2788713的熒光探針對序列為SEQIDNo63和SEQIDNo64 ；rs3130975的熒光探針對序列為SEQIDNo67和SEQIDNo68 ；rs4344933的熒光探針對序列為SEQIDNo71和SEQIDNo72 ；rs4488809的熒光探針對序列為SEQIDNo75和SEQIDNo76 ；rs4493136的熒光探針對序列為SEQIDNo79和SEQIDNo80 ；rs4669621的熒光探針對序列為SEQIDNo83和SEQIDNo84 ；rs4697406的熒光探針對序列為SEQIDNo87和SEQIDNo88 ；rs4749794的熒光探針對序列為SEQIDNo91和SEQIDNo92 ；rs4809957的熒光探針對序列為SEQIDNo95和SEQIDNo96 ；rs6102795的熒光探針對序列為SEQIDNo99和SEQIDNo100rs6490820的熒光探針對序列為SEQIDNo103 和 SEQ ID No104rs9317873的熒光探針對序列為SEQIDNo107 和 SEQ ID No108rs9373105的熒光探針對序列為SEQIDNo111和 SEQ ID No112rs9397087的熒光探針對序列為SEQIDNo:115 和 SEQ ID No116rs9463490的熒光探針對序列為SEQIDNo:119 禾口 SEQ ID No120rsl0066153的熒光探針對序列為SEQIDNo123 和SEQIDNo124rslll44475的熒光探針對序列為SEQIDNo127 和SEQIDNo128rslll55286的熒光探針對序列為SEQIDNo131 禾口SEQIDNo132rsll264579的熒光探針對序列為SEQIDNo135 和SEQIDNo136rsll907465的熒光探針對序列為SEQIDNo139 和SEQIDNo140rsl2050469的熒光探針對序列為SEQIDNo143 和SEQIDNo144rsl2992554的熒光探針對序列為SEQIDNo147 和SEQIDNo148rsl3000907的熒光探針對序列為SEQIDNo151 禾口SEQIDNo152rsl6883398的熒光探針對序列為SEQIDNo155 和SEQIDNo156rsl6959825的熒光探針對序列為SEQIDNo159 和SEQIDNo160rsl7058190的熒光探針對序列為SEQIDNo163 和SEQIDNo164rsl7075390的熒光探針對序列為SEQIDNo167 和SEQIDNo168rsl7728461 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :171 和 SEQ ID No :172 ；rsl014588的熒光探針對序列為SEQIDNo175和SEQIDNo176rsl039119的熒光探針對序列為SEQIDNo179和SEQIDNo180rsl726744的熒光探針對序列為SEQIDNo183和SEQIDNo184rs2285947的熒光探針對序列為SEQIDNo187和SEQIDNo188rs2895680的熒光探針對序列為SEQIDNo191和SEQIDNo192rs3969178的熒光探針對序列為SEQIDNo195和SEQIDNo196rs4693311的熒光探針對序列為SEQIDNo199和SEQIDNo200rs4766994的熒光探針對序列為SEQIDNo203和SEQIDNo204rs4894545的熒光探針對序列為SEQIDNo207和SEQIDNo208rs4940849的熒光探針對序列為SEQIDNo211和SEQIDNo212rs6490294的熒光探針對序列為SEQIDNo215和SEQIDNo216rs6780858的熒光探針對序列為SEQIDNo219和SEQIDNo220rs9439527的熒光探針對序列為SEQIDNo223和SEQIDNo224rs9556016的熒光探針對序列為SEQIDNo227和SEQIDNo228rsl2002185 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :231 和 SEQ ID No :232 ； rsl2793370 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :235 和 SEQ ID No :236 ； rsl549058 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :239 和 SEQ ID No :240 ； rs2736100 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :243 和 SEQ ID No :244 ； rs6043705 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :247 和 SEQ ID No :248 ； rs 11699642 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :251 和 SEQ ID No :252。
4.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的SNP標(biāo)志物的特異性引物在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對在制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7.—種原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測外周血DNA中 rsl07401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、 rsl544694、rsl663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、 rs2788713、 rs3130975、 rs4344933、 rs4488809、 rs4493136、 rs4669621、 rs4697406、 rs4749794、 rs4809957、 rs6102795、 rs6490820、 rs9317873、 rs9373105、 rs9397087、 rs9463490、rsl0066153、rslll44475、rslll55286、rsll264579、rsll907465、rsl2050469、 rsl2992554、rsl3000907、rsl6883398、rsl6959825、rsl7058190、rsl7075390、rsl7728461、 rsl014588、 rsl039119、 rsl726744、 rs2285947、 rs2895680、 rs3969178、 rs4693311、 rs4766994、 rs4894545、 rs4940849、 rs6490294、 rs6780858、 rs9439527、 rs9556016、 rsl2002185、rsl2793370、rsl549058、rs2736100、rs6043705 和 rsll699642。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述SNP 標(biāo)志物的特異性引物和/或權(quán)利要求3所述SNP標(biāo)志物的特異性熒光探針對。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR技術(shù)常用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與原發(fā)性肺癌輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs107401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、rs1663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、rs2788713、rs3130975、rs4344933、rs4488809等63個SNP的組合，該標(biāo)志物可用于制備原發(fā)性肺癌輔助診斷試劑盒。
文檔編號C12N15/11GK102534009SQ201210013090
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者孫重期, 沈洪兵, 胡志斌, 董靜, 靳光付, 馬紅霞 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)