專利名稱：肺癌治療和診斷的靶基因cstf2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及癌癥研究、癌癥診斷和癌癥治療領(lǐng)域。 特別地，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和診斷肺癌的方法以及用于對(duì)具有肺癌的受試者治療和預(yù)防或評(píng)估/測(cè)定預(yù)后的方法。此外，本發(fā)明涉及篩選用于治療和/或預(yù)防肺癌的候選物質(zhì)的方法。優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)要求2009年8月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/274，800的權(quán)益，通過(guò)述及將其完整內(nèi)容收入本文。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肺癌是大多數(shù)國(guó)家中首要的癌癥死亡的原因，而且非小肺癌(NSCLC)占那些死亡的約80% (NPL 1)。肺癌發(fā)生的詳細(xì)分子機(jī)制仍然不清楚，盡管報(bào)告了肺癌中的多種基因改變(NPL 2)。雖然手術(shù)技術(shù)和化療取得了進(jìn)展，但晚期肺癌患者的病情發(fā)展往往是致命的(NPL 1)。因此，認(rèn)為了解肺癌的生物學(xué)和引入更加有效的治療來(lái)改善患者的存活是極端重要的(NPL 3)。在最近二十年里，一些新開發(fā)的細(xì)胞毒劑諸如帕利他賽、多西他賽、吉西他濱、和長(zhǎng)春瑞濱已開始為具有晚期NSCLC的患者提供多種治療選擇項(xiàng)，然而，與基于順鉬的常規(guī)療法相比，那些方案顯示的存活效益不突出(NPL 4，5)?，F(xiàn)在，特異性分子靶向的概念已應(yīng)用于開發(fā)改良癌癥治療策略，而且主要的兩種辦法用于治療治療性單克隆抗體和小分子劑(NPL 6)。至今，多種分子靶向療法已在晚期肺癌的化療的II期和III期試驗(yàn)中得到了考察，包括表皮生長(zhǎng)因子的酪氨酸激酶抑制劑諸如吉非替尼吉非替尼和埃羅替尼(erlotinib)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的酪氨酸激酶抑制劑諸如vandetanib、sorafenib、sunitinib，和針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的單克隆抗體諸如貝伐單抗和西妥昔單抗(NPL 6-10)。然而，由于毒性問題，僅有限數(shù)目的患者能選擇這些治療方案，而且即使應(yīng)用所有種類的治療，顯示較好響應(yīng)的患者的比例仍然有限 (NPL 6-10)。引用表[非專利文獻(xiàn)][NPL IjAhmedin J, Rebecca S, Elizabeth W, et al. Cancer statistics,2007. CA Cancer J Clin 2007 ；57 :43-66[NPL 2]Sozzi G. Molecular biology of lung cancer. Eur J Cancer 2001 ； 37Suppl 7 :S63-73[NPL 3]Daigo Y, Nakamura Y.Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53[NPL 4]Kelly K, Crowley J，Bunn PA et al. J Clin Oncol 2001；19 :3210-18[NPL 5]Schiller JH, Harrington D,Belani CP et al. N Engl J Med2002 ；346 92-8[NPL 6]Thatcher Lung Cancer 2007 ；57 Suppl 2 :S18-23
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Mol Cancer Ther2007 ；6 :542-51, Yamabuki Τ, Takano A, Hayama S, et al.Cancer Res2007；67 :2517-25, Hayama S,Daigo Y, Yamabuki Τ, et al.Cancer Res 2007 ；67 :4113-22, Taniwaki Μ, Takano A,Ishikawa N,et al. Clin Cancer Res2007 ；13 6624-31,Ishikawa N, Takano A, Yasui W,et al. Cancer Res2007 ；67 :11601-11, Mano Y, Takahashi, K, Ishikawa N, et al. Cancer Sci2007 ；98 :1902-13, Kato Τ, Sato N, Hayama S, et al. Cancer Res 2007 ；67 :8544-53, Kato Τ, Sato N, Takano A, et al. Clin Cancer Res 2008 ； 14 :2363-70, Dunleavy EM, Roche D, Tagami H, et al. Cell 2009 ； 137 :485-97, Hirata D,Yamabuki Τ,Ito Τ,et al. Clin Cancer Res 2009,15 :256-66,Suda T,Tsunoda T, Daigo Y, Nakamura Y, Tahara H. Cancer Sci 2007 ；98 :1803-8, Mizukami Y, Kono K, Daigo Y,et al.Cancer Sci 2008 ；99 :1448-54, Harao Μ,Hirata S,Irie A,et al. Int J Cancer2008 ；123 :2616-25)。這種系統(tǒng)性策略揭示，切割刺激因子3’前-RNA，亞基2，64kDa (CSTF2)在大多數(shù)原發(fā)性肺癌中頻繁過(guò)表達(dá)。CSTF2編碼一種核蛋白，其在N端區(qū)中含有核糖核蛋白(RNP)型RNA結(jié)合域。該蛋白是切割刺激因子復(fù)合物(CSTF)的一個(gè)成員，其與切割刺激因子的其它2 個(gè)成員一起在mRNA的聚腺苷酸化中發(fā)揮作用(Takagaki Y,MacDonald CC, Shenk T,Manley JL. Proc. Nat. Acad. Sci 1992 ；89 :1403-1407)。CSTF2 結(jié)合 mRNA 的 3，-非翻譯區(qū)內(nèi)的富含 GU 的元件(Colgan DF,Manley JL. Genes Dev 1997 ；11 :2755-2766,MacDonald CC,Wilusz J, Shenk T. Mol Cell Biol 1994;14:6647-6654，TakagakiY, Manley JL. Mol Cell Biol 1997 ；17 :3907-3914, Deka P, Rajan PK, Perez-Canadillas JM, J Mol Biol 2005 ；347 719-33)。CSTF2的量在小鼠3T6成纖維細(xì)胞中在GO至S期轉(zhuǎn)換期間升高(Martincic K， Campbell R, Edwalds-Gilbert G, Souan L, Lotze MT, Milcarek C. 1998 ;95 :11095-100)。 報(bào)告了小鼠和大鼠的雄性生殖細(xì)胞和人癌細(xì)胞中的強(qiáng)CSTF2表達(dá)，或CSTF2在小鼠組織中遍在表達(dá)(Dass B,Tardif S,Park JY,Tian B,Weitlauf HM,Hess RA,Carnes K,Griswold MD, Small CL, Macdonald CC. Proc Natl Acad Sci U S Α. 2007 ； 104 :20374-9, Huber Ζ, Monarez RR, Dass B, MacDonald CC. Ann N YAcad Sci. 2005 ；1061 :163-72, Wallace AM, Denison TL, Attaya EN, MacDonald CC. Biol Reprod 2004 ；70 :1080-7, Dass B, Attaya EN, Michelle Wallace A, MacDonald CC. Biol Reprod 2001 ；64 :1722-9, Chennathukuzhi VM, Lefrancois S, Morales CR, Syed V, Hecht NB. Mol Reprod Dev 2001 ；58 :460-9, Dass B,McMahon KW，Jenkins NA,Gilbert DJ,Copeland NG,MacDonald CC. J Biol Chem 2001 ； 276 :8044-50,Wallace AM,Dass B,Ravnik SE,Tonk V,Jenkins NA,Gilbert DJ,Copeland NG, MacDonald CC. Proc Natl Acad Sci U S A1999 ；96 :6763-8, Shankarling GS, Coates PW，Dass B，Macdonald CC. BMC Mol Biol 2009 Mar ;10 :22)。盡管有 CSTF2 在體外作為 CSTF成員的功能的證據(jù)，CSTF2的激活在人癌癥進(jìn)展中的意義及其作為治療靶的臨床潛力尚無(wú)記載。如上所述，本發(fā)明涉及CSTF2及其在肺癌癌發(fā)生中發(fā)揮的作用。因此，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)、診斷、治療和/或預(yù)防肺癌的新組合物和方法以及用于篩選有用物質(zhì)的方法。特別地，本發(fā)明緣于下述發(fā)現(xiàn)，即CSTF2基因在癌癥中過(guò)表達(dá)，但在正常組織中不然；并且，靶向CSTF2基因的由特定序列(特別是SEQ ID NO :9和10)構(gòu)成的雙鏈分子可有效抑制肺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。具體地，本發(fā)明提供靶向CSTF2基因的小干擾RNA(SiRNA)。 這些雙鏈分子可在分離狀態(tài)下利用，或在載體中編碼且自該載體表達(dá)來(lái)利用。因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供此類雙鏈分子以及表達(dá)它們的載體和宿主細(xì)胞。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過(guò)將本發(fā)明的雙鏈分子或載體施用于有所需要的受試者來(lái)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或治療癌癥，包括肺癌的方法。此類方法涵蓋對(duì)受試者施用含有一種或多種該雙鏈分子或載體的組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于治療肺癌的組合物，其含有至少一種本發(fā)明的雙鏈分子或載體。在還有另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)測(cè)定源自受試者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平在受試者中診斷或測(cè)定癌癥傾向性(predisposition)的方法。該基因的表達(dá)水平與該基因的正常對(duì)照水平相比的升高指示該受試者罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥，包括肺癌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，CSTF2基因的表達(dá)水平可通過(guò)用適宜探針或引物檢測(cè)CSTF2 基因的mRNA或用抗CSTF2抗體檢測(cè)CSTF2蛋白來(lái)測(cè)定。此外，本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)，即較高的CSTF2表達(dá)水平與較差的存活率相關(guān)。因此，本發(fā)明提供一種用于對(duì)具有肺癌的患者評(píng)估或測(cè)定預(yù)后的方法，該方法包括下述步驟 檢測(cè)CSTF2基因的表達(dá)水平，將它與預(yù)定的參照表達(dá)水平比較并根據(jù)它們之間的差異為該患者確定預(yù)后。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法。此類物質(zhì)會(huì)結(jié)合CSTF2蛋白、降低CSTF2蛋白的生物學(xué)活性、降低CSTF2基因的表達(dá)或降低代替CSTF2基因的報(bào)告基因的表達(dá)或活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面能符合某些目的，而一個(gè)或多個(gè)其它方面能符合某些其它目的。每個(gè)目的可以不是在它的所有方面同等適用于本發(fā)明的每一個(gè)方面。因此，前述目的可視為關(guān)于本發(fā)明的任何一個(gè)的備選。本發(fā)明的這些和其它目的和特征在閱讀下面的詳細(xì)描述連同附圖和實(shí)施例之后會(huì)變得更加清楚明白。然而，要理解，上面的發(fā)明概述和下面的詳細(xì)描述都是優(yōu)選實(shí)施方案，而非對(duì)本發(fā)明或本發(fā)明其它備選實(shí)施方案的限制。附圖簡(jiǎn)述在考慮下面的附圖簡(jiǎn)要描述和發(fā)明詳細(xì)描述及其優(yōu)選實(shí)施方案之后，熟練技術(shù)人員容易想到本發(fā)明的各個(gè)方面和應(yīng)用[圖lab]

圖1描繪肺腫瘤中CSTF2的表達(dá)A，通過(guò)半定量RT-PCR檢查的15例臨床肺癌[肺腺癌(ADC)，肺鱗狀細(xì)胞癌(SCLC)，和小細(xì)胞肺癌(SCC)]和15種肺癌細(xì)胞系中 CSTF2的表達(dá)。β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)基因的表達(dá)充當(dāng)數(shù)量對(duì)照。B，肺癌細(xì)胞系中CSTF2蛋白的表達(dá)的Western印跡分析。ACTB蛋白的表達(dá)充當(dāng)數(shù)量對(duì)照。IB，免疫印跡。[圖Ic]圖1描繪肺腫瘤中CSTF2的表達(dá)C，通過(guò)共聚焦顯微術(shù)檢查的CSTF2蛋白的亞細(xì)胞定位。[圖2ab]圖2描繪正常組織中CSTF2的表達(dá)，及NSCLC患者的CSTF2過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后的關(guān)聯(lián)A，通過(guò)Northern印跡分析檢測(cè)的正常人組織中CSTF2的表達(dá)。B，通過(guò)使用該家兔多克隆抗CSTF2抗體的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的5種正常人組織以及肺的腺癌細(xì)胞中CSTF2的表達(dá)；用蘇木精復(fù)染色(x200)。[圖2cd]圖2描繪正常組織中CSTF2的表達(dá)，及NSCLC患者的CSTF2過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后的關(guān)聯(lián)C，肺ADC組織和正常肺組織中強(qiáng)、弱、和無(wú)CSTF2表達(dá)的代表例(初始放大倍數(shù)，xlOO)。D，NSCLC患者的存活的Kaplan-Meier分析(P = 0. 0079，時(shí)序檢驗(yàn))。[圖3]圖3描繪針對(duì)CSTF2的siRNA對(duì)NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制A，通過(guò)半定量RT-PCR分析的A549和LC319細(xì)胞中響應(yīng)針對(duì)CSTF2的siRNA處理(si_CSTF2_#l 或si-CSTF2-#2)或?qū)φ誷iRNA[si-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(si_EGFP)或si-螢光素酶 (si-LUC)]的CSTF2的表達(dá)(頂部)。B, C，用si_CFTF2或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的 MTT和集落形成測(cè)定。[圖4]圖4描繪CSTF2導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的增強(qiáng)A，通過(guò)Wfestern印跡分析檢測(cè)的C0S-7細(xì)胞中CSTF2的瞬時(shí)表達(dá)。對(duì)細(xì)胞導(dǎo)入pcDNA3. l-myc-His_CSTF2或模擬載體。B和C，通過(guò)MTT和集落形成測(cè)定評(píng)估細(xì)胞存活力和集落數(shù)目。測(cè)定在三個(gè)重復(fù)孔中進(jìn)行三次。發(fā)明詳述雖然任何與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明的實(shí)施方案，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料。然而，在描述本發(fā)明的材料和方法之前，要理解，本發(fā)明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案、 等，因?yàn)檫@些可依照常規(guī)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化而變化。還要理解，該描述中使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會(huì)由所附權(quán)利要求來(lái)限制。通過(guò)述及明確地將此說(shuō)明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)的公開內(nèi)容完整收入本文。然而，本文中無(wú)一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開。如果有沖突，當(dāng)以本說(shuō)明書，包括定義為準(zhǔn)。另外，該等材料、方法、和實(shí)施例只是例示性的，而非意圖限制。定義如本文中使用的，詞語(yǔ)“一個(gè)/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個(gè)/種”，除非
另有明確說(shuō)明。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、和0-磷酸絲氨酸)。短語(yǔ)“氨基酸類似物”指與天然存在的氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與氫、 羧基、氨基、和R基團(tuán)結(jié)合)但具有經(jīng)過(guò)修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過(guò)修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語(yǔ)“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以通過(guò)它們公知的由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的三字母符號(hào)或單字母符號(hào)來(lái)指稱。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“生物樣品”指完整生物體或其組織、細(xì)胞或組成部分(例如體液，包括但不僅限于血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、臍帶血、尿液、陰道液和精液)的子集?！吧飿悠贰边M(jìn)一步指從完整生物體或其細(xì)胞、組織或組成部分的子集制備的勻漿物、裂解物、提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，或其級(jí)分或部分。最后，“生物樣品”指含有細(xì)胞成分(諸如蛋白質(zhì)或多核苷酸)的培養(yǎng)基，諸如生物體已在其中繁殖的營(yíng)養(yǎng)湯或凝膠。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、和“核酸分子”在本文中可互換使用，指核酸殘基的聚合物，而且除非另有明確說(shuō)明，通過(guò)它們公認(rèn)的單字母代碼來(lái)指稱。該等術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)核酸通過(guò)酯鍵合連接的核酸(核苷酸)聚合物。核酸聚合物可以由 DNA、RNA或其組合構(gòu)成，而且涵蓋天然存在的和非天然存在的核酸聚合物二者。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該等術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是經(jīng)過(guò)修飾的殘基或非天然存在的殘基(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖活性”、“細(xì)胞增殖增強(qiáng)活性”、和“細(xì)胞增殖促進(jìn)活性“在本文中可互換使用，指當(dāng)多肽與細(xì)胞接觸或?qū)⒕幋a多肽的基因?qū)爰?xì)胞中時(shí)，多肽促進(jìn)或增強(qiáng)細(xì)胞增殖的活性。
與物質(zhì)(例如多肽、抗體、多核苷酸、等)聯(lián)用的術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”表示該物質(zhì)基本上不含至少一種可包括于天然來(lái)源中的物質(zhì)。如此，分離的或純化的抗體指基本上不含細(xì)胞材料例如碳水化合物、脂質(zhì)、或其它來(lái)自衍生該蛋白質(zhì)(抗體)的細(xì)胞或組織來(lái)源的污染性蛋白質(zhì)的抗體，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品的抗體。術(shù)語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中多肽與用于分離或重組生產(chǎn)它的細(xì)胞的細(xì)胞成分分開的多肽制備物。如此，基本上不含細(xì)胞材料的多肽包括具有少于約30^^20%、10%、或5% (按干重計(jì))的異源蛋白質(zhì)(在本文中也稱作“污染性蛋白質(zhì)”)的多肽制備物。當(dāng)多肽重組產(chǎn)生時(shí)，在一些實(shí)施方案中，其還基本上不含培養(yǎng)基，包括具有少于約20 %、10 %、或5 %的蛋白質(zhì)制備物體積的培養(yǎng)基的多肽制備物。當(dāng)多肽通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，在一些實(shí)施方案中，其基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品，包括具有少于約30^^20^^10^5% (按干重計(jì))的蛋白質(zhì)制備物體積的與該蛋白質(zhì)合成有關(guān)的化學(xué)前體或其它化學(xué)品的多肽制備物?？衫缤ㄟ^(guò)在蛋白質(zhì)制備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色等等之后單一條帶的出現(xiàn)來(lái)顯示特定蛋白質(zhì)制備物含有分離的或純化的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)(包括本發(fā)明的抗體)是分離的或純化的?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子，例如cDNA分子，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)可基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)可基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的蛋白的核酸分子是分離的或純化的。除非另有定義，術(shù)語(yǔ)“癌癥”指過(guò)表達(dá)CSTF2基因的癌癥，諸如肺癌，包括腺癌 (ADC)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、大細(xì)胞癌(LCC)、和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。CSTF2 基因或 CSTF2 蛋白人CSTF2基因的核酸和多肽序列分別顯示于但不限于SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 2。另外，上述序列數(shù)據(jù)也可經(jīng)GenBank登錄號(hào)NM_001325得到。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，認(rèn)為功能性等同物也是上述“多肽”。在本文中，蛋白的 “功能性等同物”為具有與該蛋白等同的生物學(xué)活性的多肽。也就是，任何保留生物學(xué)能力的多肽可用作本發(fā)明中的此類功能性等同物。例如，已知CSTF2多肽具有細(xì)胞增殖增強(qiáng)活性、RNA結(jié)合活性、RNA切割活性、RNA聚腺苷酸化活性等等。認(rèn)為保留這些活性中至少一種的多肽是本發(fā)明中CSTF2多肽的功能性等同物。此類功能性等同物包括那些對(duì)蛋白的天然存在氨基酸序列替代、刪除、添加、或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的。或者，多肽可包含與相應(yīng)蛋白的序列具有至少約80%同源性(也稱作序列同一性)，更優(yōu)選至少約90%至95%同一性，進(jìn)一步更優(yōu)選96^^97^^98%或99%同一性的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，多肽可以由在嚴(yán)格條件下與基因的天然存在核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。本發(fā)明的多肽可在氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、糖鏈的有無(wú)、或形式方面有變化， 取決于用于產(chǎn)生它的細(xì)胞或宿主，或使用的純化方法。無(wú)論如何，只要它具有與人蛋白的功能等同的功能，它就在本發(fā)明的范圍內(nèi)。短語(yǔ)“嚴(yán)格(雜交)條件”指下述條件，在該條件下，核酸分子會(huì)與其靶序列雜交， 通常在核酸復(fù)雜混合物中，但沒有與其它序列的可檢測(cè)的雜交。嚴(yán)格條件取決于序列，而且在不同情況中會(huì)有所不同。較長(zhǎng)的序列在較高的溫度特異性雜交。對(duì)于核酸雜交詳盡指導(dǎo)可見于 Ti jssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridizationwith Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地，嚴(yán)格條件選擇為在限定的離子強(qiáng)度和pH，比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5-10°C。Tm是如下的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、pH、和核酸濃度下)，其中50%的與靶互補(bǔ)的探針在平衡時(shí)與靶序列雜交(因?yàn)榘行蛄羞^(guò)量存在，所以在 Tm，在平衡時(shí)50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)是背景的至少兩倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。例示性的嚴(yán)格雜交條件包括如下50%甲酰胺、5x SSC、和SDS，在42°C溫育，或切SSCU % SDS、在 65°C溫育，用 0. 2x SSC 和 0. 1% SDS 在 50°C清洗。在本發(fā)明的背景中，用于分離編碼與上述人蛋白在功能上等同的多肽的DNA的雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選擇。例如，可如下進(jìn)行雜交在68攝氏度用“Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)進(jìn)行30分鐘或更長(zhǎng)的預(yù)雜交，添加經(jīng)過(guò)標(biāo)記的探針，并在68攝氏度溫育1小時(shí)或更長(zhǎng)。下面的清洗步驟可在例如低嚴(yán)格度條件中進(jìn)行。一種例示性的低嚴(yán)格度條件可包括42°C、2x SSC、0. SDS，優(yōu)選50°C、2x SSC.0. 1% SDS0常常優(yōu)選使用高嚴(yán)格條件。一種例示性的高嚴(yán)格條件可包括在室溫在h SSC、0. SDS中清洗 3次各20分鐘，然后在Ix SSC、0. SDS中在37攝氏度清洗3次各20分鐘，并在Ix SSC、 0. 1% SDS中在50攝氏度清洗2次各20分鐘。然而，數(shù)種因素，諸如溫度和鹽濃度，可影響雜交的嚴(yán)格度，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的因素以達(dá)到所需的嚴(yán)格度。一般而言，已知蛋白中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不影響蛋白的功能。事實(shí)上， 已知突變的或經(jīng)過(guò)修飾的蛋白(其具有通過(guò)對(duì)某種氨基酸序列替代、刪除、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而修飾的氨基酸序列)保留原始的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6(1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79 6409-13(1982))。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行個(gè)別添加、刪除、插入、或替代，這改變單個(gè)氨基酸或少數(shù)氨基酸，或者被認(rèn)為是“保守修飾”的那些修飾——其中蛋白的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白，這些都是本發(fā)明的背景中可接受的。只要保持蛋白活性，氨基酸突變的數(shù)目不受特別限制。然而，一般優(yōu)選改變氨基酸序列的5%或更少。因而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在此類突變體中要突變的氨基酸數(shù)目一般為30個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選20個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選10個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選6 個(gè)氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選3個(gè)氨基酸或更少。要突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)榘被醾?cè)鏈特性保持的另一種氨基酸(稱為保守性氨基酸替代的過(guò)程)。氨基酸側(cè)鏈特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y， V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S, T)、和具有下列共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含有羥基基團(tuán)的側(cè)鏈(S，T，Y)；含有硫原子的側(cè)鏈(C，M)；含有羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含有堿的側(cè)鏈(R，K，H)；和含有芳香族的側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。 提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本領(lǐng)域是公知的。例如，下列8個(gè)組各種包含彼此構(gòu)成保守性替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守性修飾多肽包括在本發(fā)明的蛋白中。然而，本發(fā)明并不僅限于此，而且蛋白質(zhì)包括非保守性修飾，只要蛋白的至少一種生物學(xué)活性得以保留即可。另外，經(jīng)過(guò)修飾的蛋白并不排除多態(tài)變體、種間同源物、和那些由這些蛋白的等位基因編碼的。此外，CSTF2基因涵蓋編碼蛋白的此類功能性等同物的多核苷酸。除了雜交之外， 可以利用基因擴(kuò)增方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，通過(guò)使用基于上述信息的序列合成的引物來(lái)分離編碼與蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。分別作為人類基因和蛋白的功能性等同物的多核苷酸和多肽通常與其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性?！案咄葱浴蓖ǔＶ?0 %或更高的同源性，優(yōu)選60 %或更高，更優(yōu)選80 %或更高，甚至更優(yōu)選90 %至 95 %或更高，甚至更優(yōu)選96 %、97 %、98 %、99 %或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80 :726-30 (1983) ” 中的算法來(lái)確定?？贵w如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”意圖包括可以與指定的蛋白或其肽特異性反應(yīng)的免疫球蛋白及其片段。抗體可以包括人抗體、靈長(zhǎng)源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標(biāo)記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文中，抗體以最廣義使用，具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性?！翱贵w”指示所有類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。本發(fā)明使用針對(duì)CSTF2的抗體。這些抗體會(huì)通過(guò)已知方法來(lái)生成。描述了用于生成依照本發(fā)明使用的抗體的例示性技術(shù)。⑴多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選地通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動(dòng)物中產(chǎn)生?？赡苡杏玫氖?，使用雙功能或衍生化試劑將相關(guān)抗原與在待免疫的物種中具有免疫原性的蛋白相偶聯(lián)，其中具有免疫原性的蛋白例如鑰孔i威血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑，且其中雙功能或衍生化試劑例如馬來(lái)酰亞胺苯甲酸硫代琥珀酰亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R' N = C = NR, 其中R和R’是不同的烷基。用抗原、免疫原性偶聯(lián)物、或衍生物免疫動(dòng)物，方式是例如組合100或5 μ g蛋白或偶聯(lián)物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑，并在多點(diǎn)皮內(nèi)注射該溶液。一個(gè)月后，用弗氏完全佐劑中1/5-1/10原始量的肽或偶聯(lián)物在多點(diǎn)通過(guò)皮下注射來(lái)對(duì)動(dòng)物加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行采血，并測(cè)定血清的抗體滴度。加強(qiáng)免疫動(dòng)物，直至滴度達(dá)到高平臺(tái)。優(yōu)選地是，用于對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫的是相同抗原的偶聯(lián)物，但與不同的蛋白偶聯(lián)和/或通過(guò)不同的交聯(lián)物質(zhì)偶聯(lián)。偶聯(lián)物亦可在重組細(xì)胞培養(yǎng)中作為蛋白融合物來(lái)制備。聚集劑諸如明礬亦適用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體單克隆抗體自基本上均質(zhì)的抗體的群體獲得，即構(gòu)成該群體的單個(gè)抗體是相同的，只是可能存在少量的可能的天然發(fā)生的突變。如此，修飾語(yǔ)“單克隆”是指抗體的這樣的特征，即其不是離散(discrete)抗體的混合物。例如，單克隆抗體可以使用雜交瘤方法來(lái)制備，該方法首先記載于Kohler G&Milstein C. Nature. 1975 Aug 7 ；256 (5517) :495_7，或者可以通過(guò)重組 DNA 方法來(lái)制備 (美國(guó)專利 No. 4,816, 567)。在雜交瘤方法中，小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物，諸如倉(cāng)鼠，用本文上文所述免疫以引發(fā)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生會(huì)特異性結(jié)合用來(lái)免疫的蛋白的抗體?；蛘?，可在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding, Monoclonal Antibodies principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press，1986))。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種在合適的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果所述親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么所述雜交瘤的培養(yǎng)基通常會(huì)包含次黃嘌呤、氨甲蝶呤、和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合，支持所選抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定高水平產(chǎn)生抗體，且對(duì)某種培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基敏感的。在這些中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些自可以從&ilk研究所細(xì)胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA)獲得的M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤和可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)獲得的SP-2或)(63-Ag8-653細(xì)胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也有記載用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor D，et al.，J Immunol. 1984 Dec ； 133 (6) :3001-5 ；Brodeur et al. ,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.，New York,1987))。對(duì)雜交瘤細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基分析針對(duì)抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選地， 通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定諸如放射性免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定法 (ELISA)來(lái)測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如，單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)Munson PJ&Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1 ；107(1) :220-39 的 3(^catchard 分析來(lái)測(cè)定。在鑒定出產(chǎn)生具有期望的特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過(guò)有限稀釋規(guī)程來(lái)亞克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。適合于此目的的培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPML-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可以在動(dòng)物中作為腹水瘤來(lái)體內(nèi)培養(yǎng)。通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程合適地將由亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水、或血清分開，所述規(guī)程諸如例如蛋白A-kpharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析。
編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程，例如通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針，來(lái)分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞是此類DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，就可將DNA置入表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入本身不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞中，從而在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的 DNA 的綜述論文包括 Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993 Apr ；5 (2) :256-62 和 PlUckthun A.Immunol Rev. 1992 Dec ；130 :151_88。另一種產(chǎn)生可與CSTF2起反應(yīng)的特異性抗體或抗體片段的方法是用CSTF2篩選在細(xì)菌中表達(dá)的、編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達(dá)文庫(kù)。例如，可以使用噬菌體表達(dá)文庫(kù)，在細(xì)菌中表達(dá)完整的Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)。參見例如Ward ES，et al. ,Nature. 1989 Oct 12 ；341 (6242) :544-6；Huse WD, et al.，Science. 1989 Dec 8 ；246 (4935) :1275-81 ； 及 McCafferty J, et al.，Nature. 1990Dec 6 ；348 (6301) :552_4。用 CSTF2 肽篩選此類文庫(kù)能鑒定出可與CSTF2起反應(yīng)的免疫球蛋白片段?；蛘?，SCID-hu-小鼠(可從Genpharm獲得)可用來(lái)產(chǎn)生抗體或其片段。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以從使用McCafferty J, et al. , Nature. 1990 Dec6 ； 348(6301) :552-4 ；Clarkson T, et al. , Nature. 1991 Aug 15 ；352 (6336) :624-8 中記載的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體或抗體片段；Marks JD, et al.，J MoL BioL, 222 581-597(1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5 ；222 (3) :581-97 分別記載了使用噬菌體文庫(kù)分離小鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過(guò)鏈改組產(chǎn)生高親和性(nM范圍)人抗體(Marks JD, et al.，Biotechnology(N Y). 1992Jul ；10(7) :779-83)，以及組合感染(combinatorial infection)和體內(nèi)重組作為構(gòu)建超大噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse P, et al.，Nucleic Acids Res. 1993 Mayll ；21 (9) :2265-6) 0因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。也可以通過(guò)例如用人重鏈和輕鏈恒定域編碼序列替換同源鼠序列(美國(guó)專利 No. 4, 816, 567 ；Morrison SL, et al. , Proc Natl Acad Sci U S Α. 1984Νον ；81 (21) 6851-5)，或者通過(guò)將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列共價(jià)連接來(lái)修飾DNA。通常，用此類非免疫球蛋白多肽替換抗體恒定域，或者用它們替換抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域以創(chuàng)建包括一個(gè)具有某種抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和另一個(gè)具有不同抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合雙價(jià)抗體。(iii)人源化抗體用于將非人抗體人源化的方法在本領(lǐng)域中已有記載。優(yōu)選地，人源化抗體中引入了一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人源氨基酸殘基經(jīng)常稱作“輸入 (import) ”殘基，通常取自某個(gè)“輸入”可變域。人源化可以基本上遵循Winter及其合作者的方法(Jones PT, et al. , Nature. 1986 May29-Jun 4 ；321 (6069) :522-5 ；Riechmann L，et al.，Nature. 1988 Mar24 ；332 (6162) :323-7 ；Verhoeyen Μ, et al.，Science. 1988 Mar25 ； 239(4847) :1534-6)來(lái)實(shí)施，用高變區(qū)序列替換人抗體的相應(yīng)序列。因而，此類“人源化”抗體是其中完整人可變域的一小部分(substantially less than intact)被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列替換的嵌合抗體(美國(guó)專利No. 4，816，567)。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是人抗體中一些高變區(qū)殘基，可能還有一些FR殘基被來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代而得到的抗體。在制備人源化抗體中要使用的人可變域，包括輕鏈和重鏈可變域，的選擇對(duì)于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的“最佳擬合(best-fit)”方法，針對(duì)已知人可變域序列的整個(gè)文庫(kù)來(lái)篩選嚙齒動(dòng)物抗體的可變域的序列。然后，接受與嚙齒動(dòng)物序列最接近的人序列作為用于人源化抗體的人框架區(qū)(FR) (Sims MJ, et al.，J Immunol. 1993 Aug 15 ； 151(4) :2296-308 ；Chothia C&Lesk AM. J Mol Biol. 1987 Aug 20 ； 196 (4) :901-17)。另一種方法使用自輕鏈或重鏈特定亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter P, et al.，Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mayl5 ；89 (10) :4285-9 ；Presta LG,et al.，J Immunol. 1993 Sep 1 ；151 (5) :2623-32))。另外，重要的是，抗體的人源化保留對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。 為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，依照一種優(yōu)選的方法，人源化抗體的制備借助下述過(guò)程使用親本和人源化序列的三維模型來(lái)分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物。三維免疫球蛋白模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍可得且熟悉的。有可用的計(jì)算機(jī)程序來(lái)圖解和顯示選定的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢查這些顯示容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能發(fā)揮中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。這樣，可以選擇 FR殘基，并與受體和輸入序列組合，從而實(shí)現(xiàn)期望的抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的增加的親和力。一般地說(shuō)，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)合。(iv)人抗體作為人源化的替代方式，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，它們當(dāng)被免疫接種時(shí)能夠產(chǎn)生人抗體的完整全集(r印ertoire)，而沒有內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生。例如，已有記載，在嵌合和種系突變小鼠中純合刪除抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因?qū)е聝?nèi)源抗體產(chǎn)生完全被抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此類種系突變小鼠中會(huì)導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體。例如參見Jakobovits A，et al. , Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15 ；90 (6) :2551-5 ；Nature. 1993 Mar 18 ；362 (6417) 255-8 ；Bruggemann M, et al.，Year Immunol. 1993 ；7 :33-40 ；及美國(guó)專利 No. 5，591，669 ； 5，589，369 和 5，545，807?；蛘撸墒褂檬删w展示技術(shù)(McCaffertyJ, et al.，Nature. 1990 Dec6 ； 348(6301) :552-4)在體外從來(lái)自未經(jīng)免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)域基因全集(repertoire)產(chǎn)生人抗體和抗體片段。依照這種技術(shù)，將抗體V域基因符合讀框地 (in-frame)克隆入絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段在噬菌體顆粒的表面上展示。因?yàn)榻z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能特性進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展現(xiàn)那些特性的抗體的基因被選出。 如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以用多種形式實(shí)施，關(guān)于它們的綜述參見例如 Johnson KS&Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3 :564_71。有 V 基因區(qū)段的數(shù)種來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson T, et al. , Nature. 1991 Aug 15 ;352 (6336) :624-8 從自經(jīng)免疫小鼠的脾衍生的V基因小型隨機(jī)組合文庫(kù)分離了一系列多樣的抗噁唑酮抗體。可以構(gòu)建來(lái)自未免疫人供體的V基因全集，并可以基本上遵循下列文獻(xiàn)中記載的技術(shù)分離針對(duì)一系列多樣抗原(包括自身抗原)的抗體Marks JD, et al.，J Mol Biol. 1991 Dec 5 ；222 (3) 581-97，或 Griffiths AD, et al.，EMBO J. 1993Feb ； 12 (2) :725_34。還可參見美國(guó)專利 No. 5，565，332 和 5，573，905。人抗體也可以由體外活化的B細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生(參見美國(guó)專利No. 205，567，610和 5，229，275)。在共有的共同未決申請(qǐng)中記載了使用SCID小鼠產(chǎn)生人抗體的一種優(yōu)選手段。(ν)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段是通過(guò)蛋白水解消化完整抗體而衍生的(參見例如 Morimoto K&Inouye K. J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar ；24 (1-2) :107-17 ；Brennan Μ, et al.，Science. 1985Jul 5 ；229 (4708) :81-3)。然而，現(xiàn)在這些片段也可以由重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生。例如，可以從上文討論的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體片段?；蛘撸梢灾苯訌拇竽c桿菌回收Fab' -SH片段，并化學(xué)偶聯(lián)以形成 F(ab' )2 片段(Carter P，et al. ,Biotechnology (N Y). 1992 Feb ； 10 (2) :163-7)。依照另一種辦法，F(xiàn)(ab' )2片段可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離。其它用于產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)熟練從業(yè)人員會(huì)是顯然的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。 參見WO 93/16185 ；美國(guó)專利No. 5，571，894和5，587，458?？贵w片段亦可為“線性抗體”，例如如例如美國(guó)專利No. 5，641，870中記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。(vi)非抗體結(jié)合蛋白術(shù)語(yǔ)“非抗體結(jié)合蛋白，，或“非抗體配體”或“抗原結(jié)合蛋白，，可互換使用，指使用非免疫球蛋白骨架的抗體模擬物，包括adnectins、avimers、單鏈多肽結(jié)合分子、和抗體樣結(jié)合肽模擬物，如下文中更詳細(xì)討論的。已經(jīng)開發(fā)出了其它以與抗體相似的方式靶定和結(jié)合靶物的物質(zhì)。某些這些“抗體模擬物”使用非免疫球蛋白骨架作為抗體可變區(qū)的替代蛋白框架。例如，Ladner et al.(美國(guó)專利No. 5，260，203)記載了單多肽鏈結(jié)合分子，其具有與抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)——它們聚集在一起但在分子水平上是分開的——相似的結(jié)合特異性。單鏈結(jié)合分子同時(shí)含有抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，它們通過(guò)肽接頭連接，并會(huì)折疊成與雙肽抗體相似的結(jié)構(gòu)。單鏈結(jié)合分子與傳統(tǒng)的抗體相比展示多種優(yōu)勢(shì)，包括尺寸更小、穩(wěn)定性更高和更容易被修飾。Ku 等(Proc Natl Acad Sci USA 92(14) :6552-6556(1995))記載了一種基于細(xì)胞色素1^562的抗體替代物。Ku等(19卯)制成了一個(gè)文庫(kù)，其中細(xì)胞色素1^562的兩個(gè)環(huán)被隨機(jī)化，并從中選擇針對(duì)牛血清清蛋白的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)各突變體以與抗BSA抗體相似的方式選擇性結(jié)合BSA。Lipovsek等(美國(guó)專利No. 6，818，418和7，115，396)記載了一種抗體模擬物，其特征是具有纖連蛋白或纖連蛋白樣蛋白骨架和至少一個(gè)可變環(huán)。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物稱作Adnectins，它們展現(xiàn)出許多與天然或工程化抗體相同的特征，包括對(duì)任何靶配體的高親和力和特異性。任何用于發(fā)展新的或改良的結(jié)合蛋白的技術(shù)均可用于這些抗體模擬物。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)與IgG重鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)相似。因此，這些模擬物展示在性質(zhì)和親和力方面與天然抗體相似的抗原結(jié)合特性。另外，這些基于纖連蛋白的抗體模擬物還展現(xiàn)出勝過(guò)抗體和抗體片段的某些優(yōu)點(diǎn)。例如，這些抗體模擬物的天然折疊穩(wěn)定性不依賴于二硫鍵，因此在通常會(huì)破壞抗體的條件下是穩(wěn)定的。此外，因?yàn)檫@些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)與IgG重鏈的結(jié)構(gòu)相似，所以可以在體外采用類似于抗體的體內(nèi)親和力成熟過(guò)程的環(huán)隨機(jī)化和改組過(guò)程。Beste 等(Proc Natl Acad Sci USA 96(5) :1898-1903(1999))記載了一種基于脂籠蛋白骨架的抗體模擬物(Anticalin(注冊(cè)商標(biāo)))。脂籠蛋白包括蛋白末端具有4個(gè)超變環(huán)的β-桶。BeSte(1999)對(duì)環(huán)進(jìn)行隨機(jī)誘變，并選擇與例如熒光素的結(jié)合。三種變體展現(xiàn)與熒光素的特異性結(jié)合，其中一種變體顯示與抗熒光素抗體相似的結(jié)合。進(jìn)一步的分析揭示，所有隨機(jī)化位置均是可變的，表明Anticalin(注冊(cè)商標(biāo))會(huì)適合于用作抗體的替代物。Anticalin (注冊(cè)商標(biāo))是小型單鏈肽，通常在160和180個(gè)殘基之間，這提供了勝過(guò)抗體的若干優(yōu)勢(shì)，包括降低生成成本，提高儲(chǔ)藏穩(wěn)定性及降低免疫學(xué)反應(yīng)。Hamilton等(美國(guó)專利No. 5，770，380)記載了一種合成抗體模擬物，其使用杯芳烴(calixarene)剛性非肽有機(jī)骨架，骨架上附著有多個(gè)可變肽環(huán)用作結(jié)合位點(diǎn)。肽環(huán)相對(duì)于彼此均從杯芳烴的幾何學(xué)上的同一側(cè)突出。由于這種幾何學(xué)構(gòu)象，所有的環(huán)均可供結(jié)合， 從而提高與配體的結(jié)合親和力。然而，與其它抗體模擬物相比，基于杯芳烴的抗體模擬物不是純粹由肽構(gòu)成的，因此對(duì)蛋白酶攻擊的敏感性降低。骨架也不是純粹由肽、DNA或RNA構(gòu)成，這意味著此抗體模擬物在極端環(huán)境條件中相對(duì)穩(wěn)定，而且壽命較長(zhǎng)。另外，因?yàn)榛诒紵N的抗體模擬物相對(duì)較小，其產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答的可能性降低。Murali 等(Cell Mol Biol. 49 O) :209-216 Q003))記載了一種用于將抗體減小為更小的模擬肽的方法，它們稱為“抗體樣結(jié)合模擬肽(antibody like binding peptidomemetics) ” (ABiP)，也可以用作抗體的替代物。Silverman 等(Nat Biotechnol. 23 1556-1561 (2005))記載了一些融合蛋白，它們是包含多個(gè)域的單鏈多肽，稱作“avimers”。avimers是通過(guò)體外外顯子改組和噬菌體展示從人細(xì)胞外受體域發(fā)展而來(lái)的，是一類在它們對(duì)各種靶分子的親和力和特異性方面與抗體有些相似的結(jié)合蛋白。所得的多域蛋白可以包括多個(gè)獨(dú)立的結(jié)合域，它們能展現(xiàn)與單表位結(jié)合蛋白相比改良的親和性(在某些情況中是亞納摩爾級(jí)的)和特異性。關(guān)于avimers 構(gòu)建和使用方法的更多細(xì)節(jié)披露于例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開No. 20040175756,20050048512, 20050053973,20050089932 和 20050221384。除了非免疫球蛋白蛋白框架之外，還在包括但不限于RNA分子和非天然寡聚物 (例如蛋白酶抑制劑、苯并二氮卓、嘌呤衍生物和β-轉(zhuǎn)角模擬物)的物質(zhì)中模擬抗體特性， 它們都適用于本發(fā)明。(Vii)藥物配制劑:可通過(guò)將具有期望純度的抗體與任選的可藥用的擔(dān)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑 (Remington’ s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))混合，以凍干劑型或水溶液的形式，制備抗體的治療用配制劑供貯存。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10 個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、 海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Si-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。W097/04801中記載了適于皮下施用的凍干配制劑。此類凍干配制劑可用合適的稀釋劑重建至高蛋白質(zhì)濃度且重建的配制劑可皮下施用于本文中待治療的哺乳動(dòng)物。根據(jù)需治療的特定病癥需要，本文所述配制劑亦可包含多于一種活性物質(zhì)，優(yōu)選那些具有互補(bǔ)活性且不會(huì)互相有負(fù)面影響的。舉例而言，可以進(jìn)一步提供化療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑。這樣的其它藥劑的有效量依賴于配制劑中存在的抗體量，病癥或疾病或治療的類型，以及其它上述討論的因素。這些藥劑通常使用與前述所用相同的劑量和給藥途徑，或前述所用的劑量的大約1到99%?；钚猿煞诌€可包埋于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠體藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液 (macroemulsions)中。此類技術(shù)公開于例如Remington，s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)。可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有藥劑的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是成型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利第 3，773，919號(hào))、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可容易的通過(guò)使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。(X)用抗體治療包含本抗體的組合物可以按照符合良好醫(yī)療實(shí)踐的形式配制、確定劑量和施用。 本抗體優(yōu)選為人類、嵌合或人源化抗體scFv，或抗體片段。在此語(yǔ)境中考慮的因素包括所治療的特定肺癌、所治療的特定哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床情況、病癥或疾病的原因、藥劑需投遞的部位、施用方法、施用時(shí)程以及其它醫(yī)療從業(yè)者所知的因素。治療上有效的施用抗體量將由這些考慮因素所決定。作為一般性的建議，非消化道施用的抗體治療上有效的量應(yīng)在每劑大約每日0. 1 到20mg/kg患者體重的范圍內(nèi)，典型的抗體起始用量范圍為大約2到10mg/kg。然而，如上所述，這些建議的抗體量在很大程度上受治療學(xué)上考量的左右。在合適劑量與時(shí)程的選擇中最重要的因素，如上所述，是所得的結(jié)果。例如，對(duì)治療正在進(jìn)行的以及急性的疾病，可能開始需要相對(duì)較高的劑量。為獲取最有效的結(jié)果，根據(jù)疾病或病癥，所述抗體可能應(yīng)盡可能在接近疾病或病癥的初兆、診斷、 出現(xiàn)或發(fā)生時(shí)施用，或在疾病或病癥復(fù)發(fā)的過(guò)程中施用。所述抗體可用任何合適的方法施用，包括非消化道、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、以及鼻內(nèi)施用，還有如果期望局部免疫抑制治療，在病變內(nèi)施用。非消化道輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、 動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)與皮下施用。另外，通過(guò)脈沖輸注(pulse infusion)施用所述抗體可能為合適的，例如，用遞減劑量的抗體。所述給藥優(yōu)選通過(guò)注射，最優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于所述施用是短期的還是長(zhǎng)期的。另外，還可以與本文所述抗體一起施用其它物質(zhì)，例如細(xì)胞毒劑、化療劑、免疫抑制劑和/或細(xì)胞因子。組合施用包括使用不同配制劑或單一藥物配制劑同時(shí)施用，以及任何順序的相繼施用，其中優(yōu)選存在這樣的一段時(shí)間，其中兩種(或所有)活性藥劑同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性。除施用所述抗體于患者外，本發(fā)明還構(gòu)思了用基因療法施用所述抗體。上述施用編碼抗體的核酸的方法涵蓋干“施用治療有效量的抗體”這ー表述中。例如，關(guān)于使用基因療法產(chǎn)生胞內(nèi)抗體，參見公布于1996年3月14日的W096/07321。有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者的細(xì)胞，即體內(nèi)和回體 (ex vivo) 0對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要抗體的部位將核酸直接注射到患者體內(nèi)。對(duì)于回體治療，取出患者的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞或是直接施用于患者，或是例如包埋入多孔膜內(nèi)井植入患者體內(nèi)(參見例如美國(guó)專利第4，892，538號(hào)和第 5，觀3，187號(hào))。有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)細(xì)胞還是目的宿主的體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣沉淀法等。 常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有例如D0TMA、 DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在有些情況中，希望將核酸源與靶向靶細(xì)胞的試劑，諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等一起提供。在采用脂質(zhì)體吋，與胞吞作用相關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝入，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段、針對(duì)在循環(huán)中被內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、 和靶向細(xì)胞內(nèi)定位和増加細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。例如mi et al. , J. Biol. Chem. 262 4429-4432(1987)和 Wagner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :3410-3414(1990)中記載了受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述參見Anderson et al.，Science 256:808-813(1992)。還可參見 WO 93/25673 及其引用的參考文獻(xiàn)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明針對(duì)CSTF2的抗體在制造用于治療表達(dá)CSTF2基因的癌癥的藥物組合物中的用途。或者，本發(fā)明進(jìn)一歩提供供治療表達(dá)CSTF2基因的癌癥用的本發(fā)明針對(duì)CSTF2的抗體?；蛘撸景l(fā)明進(jìn)一歩提供制造用于治療表達(dá)CSTF2基因的癌癥的藥物組合物的方法或エ藝，其中該方法或エ藝包括將藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體與作為活性組分的針對(duì) CSTF2的抗體一起配制的步驟。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供制造用于治療表達(dá)CSTF2基因的癌癥的藥物組合物的方法或ェ藝，其中該方法或ェ藝包括將活性組分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體混合的步驟，其中所述活性組分是針對(duì)CSTF2的抗體。雙鏈分子如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的雙鏈分子”指抑制靶基因表達(dá)的核酸分子，而且包括例如短干擾RNA (siRNA ；例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA (shRNA))和短干擾 DNA/RNA (siD/R-NA ；例如DNA和RNA的雙鏈嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發(fā)夾嵌合物(shD/R-NA))。在本文中，“雙鏈分子”也稱作“雙鏈核酸”、“雙鏈核酸分子”、“雙鏈多核苷酸”、“雙鏈多核苷酸分子”、“雙鏈寡核苷酸”和“雙鏈寡核苷酸分子”。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“靶序列”指靶基因的mRNA或cDNA序列內(nèi)的某段核苷酸序列，如果將靶向該序列的雙鏈分子導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞中的話，會(huì)導(dǎo)致靶基因的整個(gè) mRNA的翻譯受到阻抑。對(duì)于基因的mRNA或cDNA序列內(nèi)的某個(gè)核苷酸序列，若包含與靶序列對(duì)應(yīng)的序列的雙鏈分子抑制表達(dá)該基因的細(xì)胞中該基因的表達(dá)，可確定其為靶序列。阻抑基因表達(dá)的雙鏈多核苷酸可以由靶序列和長(zhǎng)度為2至5個(gè)核苷酸的3’突出端(例如im) 的組成。當(dāng)靶序列通過(guò)cDNA序列來(lái)顯示吋，使用雙鏈cDNA的有義鏈序列(即mRNA序列轉(zhuǎn)變成DNA序列的序列)來(lái)限定靶序列。雙鏈分子包含有義鏈(其具有與靶序列對(duì)應(yīng)的序列)和反義鏈(其具有與靶序列互補(bǔ)的序列)，而且該反義鏈與該有義鏈在互補(bǔ)序列處雜交以形成雙鏈分子。在本文中，短語(yǔ)“與...對(duì)應(yīng)”表示依照構(gòu)成雙鏈分子有義鏈的核酸的種類來(lái)轉(zhuǎn)變靶序列。例如，當(dāng)靶序列以DNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有RNA區(qū)吋，該RNA區(qū)內(nèi)的堿基“t”用堿基“U”替換。另ー方面，當(dāng)靶序列以RNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有 DNA區(qū)吋，該DNA區(qū)內(nèi)的堿基“U”用“t”替換。例如，當(dāng)靶序列以RNA序列SEQ ID NO 10顯示且雙鏈分子的有義鏈具有由DNA構(gòu)成的3’側(cè)半?yún)^(qū)吋，“與靶序列對(duì)應(yīng)的序列”為“5’ -CACUUUACUUTCTGTAACT-3’”。還有，對(duì)于雙鏈分子的反義鏈，與靶序列互補(bǔ)的序列可依照構(gòu)成反義鏈的核酸的種類來(lái)限定。例如，當(dāng)靶序列顯示在RNA序列SEQ ID NO 10中，且雙鏈分子的反義鏈具有由DNA構(gòu)成的5，側(cè)半?yún)^(qū)時(shí)，“與靶序列互補(bǔ)的序列”為“3，-GUGAAAUGAAAGACATTGA-5，”。另ー方面，當(dāng)雙鏈分子由RNA構(gòu)成吋，與SEQ ID NO 10中所示靶序列對(duì)應(yīng)的序列為SEQ ID NO 10的RNA序列，且與SEQ ID NO 10中所示靶序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列為RNA序列 “3，-⑶GAAAUGAAAGACAUUGA-5，”。除了與靶序列對(duì)應(yīng)的序列及其互補(bǔ)序列之外，雙鏈分子可具有ー個(gè)或兩個(gè)長(zhǎng)度為 2至5個(gè)核苷酸的3’突出端(例如im)和/或連接有義鏈和反義鏈的環(huán)序列以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“siRNA “指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA 導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技木，包括其中以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA的那些。所述siRNA包括有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。所述siRNA可如此構(gòu)建使得單個(gè)轉(zhuǎn)錄物具有靶基因的有義核酸序列與其互補(bǔ)的反義核酸序列，例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述siRNA可為dsRNA或shRNA。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“dsRNA”指包含相互互補(bǔ)序列的兩個(gè)RNA分子的構(gòu)建體，所述兩個(gè)RNA分子通過(guò)所述互補(bǔ)序列退火以形成雙鏈RNA分子。所述兩條鏈的核苷酸序列可不僅包含選自靶基因序列中蛋白質(zhì)編碼序列的“有義”或“反義” RNA，亦可包括具有選自所述靶基因非編碼區(qū)域的核苷酸序列的RNA分子。在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“shRNA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA，其包含彼此互補(bǔ)的第一區(qū)和第二區(qū)(即有義鏈和反義鏈)。兩個(gè)區(qū)的互補(bǔ)程度和方向足以使兩個(gè)區(qū)之間發(fā)生堿基配對(duì)，所述第一區(qū)和第二區(qū)通過(guò)環(huán)區(qū)連接在一起，而所述環(huán)是因?yàn)榄h(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對(duì)而形成的。shRNA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈(intervening single-strand)”在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“siD/R-NA”是指包含RNA和DNA 二者的雙鏈多核苷酸分子，包括RNA和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻譯。在本說(shuō)明書中，雜合體表示這樣的分子，其中由DNA組成的多核苷酸和由RNA組成的多核苷酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈分子的鏈中的一條或兩條可以同時(shí)含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導(dǎo)入細(xì)胞的常規(guī)技木。所述siD/R-NA包括CSTF2有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、CSTF2反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。siD/R-NA可以這樣構(gòu)建， 使單個(gè)轉(zhuǎn)錄物同時(shí)具有來(lái)自靶基因的有義核酸序列和互補(bǔ)反義核酸序列，例如發(fā)夾。siD/ R-NA 可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“dsD/R-NA”是指這樣兩個(gè)分子的構(gòu)建體，所述兩個(gè)分子包含彼此互補(bǔ)的序列并且已經(jīng)藉由所述互補(bǔ)序列退火在一起而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編碼序列的“有義”或“反義”多核苷酸序列，還可以包含具有選自靶基因非編碼區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA的兩個(gè)分子中的ー個(gè)或兩個(gè)由RNA和DNA 二者組成(嵌合體分子)，或者ー個(gè)分子由RNA組成而另ー個(gè)由DNA組成(雜合雙鏈)。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“shD/R-NA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siD/R-NA，其包含彼此互補(bǔ)的第一區(qū)和第二區(qū)，即有義鏈和反義鏈。所述區(qū)的互補(bǔ)程度和方向足以使它們之間發(fā)生堿基配對(duì)，第一區(qū)和第二區(qū)通過(guò)環(huán)區(qū)連接，所述環(huán)是因?yàn)樵诃h(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對(duì)而形成的。shD/R-NA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈”。本說(shuō)明書中使用的“分離的核酸”是指從本來(lái)的環(huán)境(例如自然出現(xiàn)時(shí)的自然環(huán)境)中被取出，與其自然狀態(tài)相比發(fā)生了合成性的改變的核酸。在本發(fā)明中，分離的核酸的例子包括DNA、RNA和它們的衍生物。與靶mRNA雜交的針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子通過(guò)與正常情況下為單鏈的基因 mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，干擾其翻譯，抑制蛋白質(zhì)表達(dá)，來(lái)降低或抑制由CSTF2基因編碼的CSTF2 蛋白的產(chǎn)生。肺癌細(xì)胞系中CSTF2基因的表達(dá)可被針對(duì)CSTF2基因的dsRNA所抑制。因此本發(fā)明提供了能夠在導(dǎo)入表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞后抑制該基因表達(dá)的分離雙鏈分子。所述雙鏈分子的靶序列可通過(guò)siRNA設(shè)計(jì)算法來(lái)設(shè)計(jì)，例如下述的。CSTF2靶序列包括例如核苷酸序列SEQ ID NO 9和10。換言之，本發(fā)明還提供其靶序列包含SEQ ID NO 9或10或由其組成的雙鏈分子。具體地，本發(fā)明提供了下列雙鏈分子[1]至[19][1] 一種分離的雙鏈分子，它當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)胞后，抑制CSTF2基因的體內(nèi)表達(dá)和細(xì)胞増殖，其中所述雙鏈分子包括有義鏈以及與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子；[2] [1]中所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子對(duì)mRNA作用，所述mRNA與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列匹配；[3] [1]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈含有對(duì)應(yīng)于選自SEQ ID N0:9和10的靶序列的序列；[4] [1]至[3]任一中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；[5] [4]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約75個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；[6] [5]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；[7] [6]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；[8] [7]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有約19到約25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；[9] [1]至[8]任一中所述的雙鏈分子，其由単一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò)間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[10] [9]中所述的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中，[Α]為包含與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個(gè) 23個(gè)核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與[A]中選擇的靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；[11] [1]至[10]任一中所述的雙鏈分子，其由RNA構(gòu)成；[12] [1]至[10]任一中所述的雙鏈分子，其由DNA和RNA構(gòu)成；[13] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[14] [13]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈與反義鏈分別由DNA與RNA構(gòu)成；[15] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子為DNA與RNA的嵌合體；[16] [15]中所述的雙鏈分子，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域?yàn)镽NA，或者有義鏈5’ 端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均為RNA ；[17] [16]中所述的雙鏈分子，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個(gè)核苷酸組成；和[18] [1]至[17]任一中所述的雙鏈分子，其中所述分子包含ー個(gè)或兩個(gè)3’突出立而；禾ロ[19] [3]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有19到25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度；本發(fā)明所述的雙鏈分子將在下面更詳細(xì)描述。設(shè)計(jì)具有抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)能力的雙鏈分子的方法是已知的(見例如，美國(guó)專利No. 6，506，559，本文通過(guò)提述并入其全部?jī)?nèi)容)。例如，可以從Ambion網(wǎng)站(在萬(wàn)維網(wǎng)上 ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)訪問用于設(shè)計(jì) siRNA 的計(jì)算機(jī)程序。該計(jì)算機(jī)程序可以根據(jù)如下的規(guī)程選擇雙鏈分子的靶核苷酸序列。
靶點(diǎn)的選擇1.從轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描搜尋AA雙核苷酸序列。記錄每個(gè) AA的出現(xiàn)及其3’側(cè)相鄰的19個(gè)核苷酸作為潛在siRNA靴點(diǎn)。Tuschl等建議避免針對(duì)5’ 和3’非翻譯區(qū)(UTR)以及鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個(gè)堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)檫@些區(qū)域可能更富含調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，而UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能干擾 siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將潛在靶點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較，將任何與其他編碼序列具有顯著同源性的靶序列排除在考慮之外。主要使用BLAST(Altschul SF等， Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17) :3389-402)，其可見于 NCBI 服務(wù)器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著待評(píng)估的基因的長(zhǎng)度選擇幾個(gè)靶序列。使用上述規(guī)程，設(shè)計(jì)本發(fā)明中針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子的靶序列為SEQ ID NO 9 禾ロ 10。分別對(duì)以上述靶序列為目標(biāo)的雙鏈分子檢查其阻抑表達(dá)靶基因細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。 因此，本發(fā)明提供以選自SEQ ID NO 9和10的序列為靶標(biāo)的雙鏈分子。靶向上文所述CSTF2基因靶序列的雙鏈分子的例子包括含有與靶序列對(duì)應(yīng)的核酸序列和/或與靶序列互補(bǔ)的序列的分離的多核苷酸。靶向CSTF2基因的多核苷酸的優(yōu)選例包括含有與SEQ ID NO 9或10對(duì)應(yīng)的序列和/或與這些序列互補(bǔ)的序列的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈分子由兩條多核苷酸構(gòu)成，一條多核苷酸具有與靶序列對(duì)應(yīng)的序列， 即有義鏈，而另一條多核苷酸具有與靶序列互補(bǔ)的序列，即反義鏈。有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。此類雙鏈分子的例子包括dsRNA和dsD/R-NA。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈分子由一條多核苷酸構(gòu)成，其具有與靶序列對(duì)應(yīng)的序列(即有義鏈)和與靶序列互補(bǔ)的序列(即反義鏈)二者。一般地，有義鏈和反義鏈通過(guò)間插鏈連接，且彼此雜交以形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。此類雙鏈分子的例子包括shRNA和shD/R-NA。換言之，本發(fā)明的雙鏈分子包含有義鏈多核苷酸(其具有靶序列的核苷酸序列) 和反義鏈多核苷酸(其具有與靶序列互補(bǔ)的核苷酸序列)，而且這兩種多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。在包含上述多核苷酸的雙鏈分子中，任一條鏈或兩條鏈的多核苷酸的一部分可以是RNA，而且當(dāng)靶序列用DNA序列來(lái)限定時(shí)，靶序列及其互補(bǔ)序列內(nèi)的核苷酸“t” 用“u”替換。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的此類雙鏈分子包含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，所述莖-環(huán)結(jié)構(gòu)由有義鏈和反義鏈構(gòu)成。有義鏈和反義鏈可通過(guò)環(huán)連接。因而，本發(fā)明還提供包含單一多核苷酸的雙鏈分子，該多核苷酸含有有義鏈和反義鏈二者，該有義鏈和反義鏈通過(guò)間插單鏈連接或側(cè)翼為間插單鏈。在本發(fā)明中，靶向CSTF2基因的雙鏈分子可具有選自SEQ ID NO :9和10的序列作為靶序列。因而，本發(fā)明的雙鏈分子的優(yōu)選例包括在與SEQ ID NO :9或10對(duì)應(yīng)的序列及其互補(bǔ)序列處彼此雜交的多核苷酸和具有與SEQ ID NO :9或10對(duì)應(yīng)的序列及其互補(bǔ)序列的
多核苷酸。本發(fā)明的雙鏈分子可以靶向單個(gè)CSTF2基因序列，或可以靶向多個(gè)CSTF2基因序列。
以上述靶序列CSTF2基因?yàn)榘袠?biāo)的本發(fā)明的雙鏈分子包括含有靶序列和/或靶序列之互補(bǔ)序列的任何核酸序列的分離多核苷酸。以CSTF2基因?yàn)榘械亩嗪塑账崂影切┖行蛄蠸EQ ID NO :9或10和/或這些核苷酸的互補(bǔ)序列的多核苷酸。然而，本發(fā)明并不僅限于這些例子，且上述核酸序列中次要修飾是可以接受的，只要所述經(jīng)修飾分子保留阻抑CSTF2基因表達(dá)的能力。本文中，短語(yǔ)“次要修飾”當(dāng)用于和核酸序列相關(guān)時(shí)表示對(duì)所述序列替換、缺失、添加或插入ー個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)核酸。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“數(shù)個(gè)”當(dāng)用于核酸替換、缺失、添加和/或插入時(shí)可意指 3-7個(gè)，優(yōu)選3-5個(gè)，更優(yōu)選3-4個(gè)，進(jìn)ー步更優(yōu)選是3個(gè)核苷酸殘基。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的雙鏈分子可用實(shí)施例中使用的方法檢測(cè)其能力。在本文中下述的實(shí)施例中，在體外對(duì)包含CSTF2基因的mRNA不同部分的有義鏈或其互補(bǔ)的反義鏈的雙鏈分子測(cè)驗(yàn)其在肺癌細(xì)胞系中(例如使用A549和SBC-幻降低CSTF2基因產(chǎn)物產(chǎn)生的能力。進(jìn)一歩，例如，較之在沒有候選分子情況下培養(yǎng)的細(xì)胞，在與候選雙鏈分子接觸的細(xì)胞中CSTF2基因產(chǎn)物的減少可由，例如，使用在實(shí)施例“半定量RT-PCR”項(xiàng)中針對(duì)CSTF2mRNA 的引物的RT-PCR來(lái)加以檢測(cè)。然后，對(duì)在體外基于細(xì)胞的分析中減少CSTF2基因產(chǎn)物的序列，可檢測(cè)其針對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。然后可對(duì)在體外基于細(xì)胞的分析中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的序列使用患癌癥動(dòng)物(例如裸小鼠異種移植模型)檢測(cè)其體內(nèi)的相應(yīng)能力，以證實(shí)CSTF2 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生降低與癌細(xì)胞生長(zhǎng)降低。當(dāng)所述分離多核苷酸是RNA或其衍生物吋，核苷酸序列中的“t”應(yīng)替換為“U”。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指多核苷酸中核苷酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對(duì)，且術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”意指兩個(gè)多核苷酸之間的物理的或化學(xué)的相互作用。當(dāng)所述多核苷酸包含修飾的核苷酸和/或非磷酸ニ酯聯(lián)接吋，這些多核苷酸亦可以同樣地發(fā)生相互結(jié)合。一般而言，互補(bǔ)多核苷酸序列在合適條件下雜交以形成包含很少或沒有錯(cuò)配的穩(wěn)定雙鏈體。進(jìn)一歩，本發(fā)明中所述分離多核苷酸的有義鏈與反義鏈可通過(guò)雜交形成雙鏈分子或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，上述雙鏈體在每10個(gè)匹配中包含不超過(guò)ー個(gè)錯(cuò)配。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈體的鏈完全互補(bǔ)，這樣的雙鏈體不包含錯(cuò)配。對(duì)CSTF2而言，所述多核苷酸長(zhǎng)度優(yōu)選少于1009個(gè)核苷酸。舉例而言，對(duì)所述的基因，多核苷酸長(zhǎng)度小于500、200、100、75、50或25個(gè)核苷酸。本發(fā)明中所述分離多核苷酸對(duì)形成針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子，或制備編碼所述雙鏈分子的模板DNA是有用的。當(dāng)所述多核苷酸用于形成雙鏈分子吋，所述多核苷酸可長(zhǎng)于19個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)于21個(gè)核苷酸， 且更加優(yōu)選長(zhǎng)度在約19與25個(gè)核苷酸之間。因而，本發(fā)明提供了包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈包括與靶序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長(zhǎng)度為19至25個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈分子。當(dāng)將雙鏈分子導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，雙鏈分子為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)充當(dāng)識(shí)別 mRNA中同源序列的向?qū)?。被識(shí)別的靶RNA受到Dicer核酸酶活性的切割和降解，由此所述雙鏈分子最終降低或抑制由該RNA編碼的多肽的生成(表達(dá))。因此，本發(fā)明的雙鏈分子可通過(guò)其生成在嚴(yán)格條件下與CSTF2基因的mRNA特異性雜交單鏈的能力來(lái)限定。在本文中， mRNA中與自雙鏈分子生成的單鏈雜交的部分稱作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本發(fā)明中，“靶序列”的核苷酸序列不僅可使用mRNA的RNA序列來(lái)顯示，而且還可以使用自 mRNA合成的cDNA的DNA序列來(lái)顯示。
本發(fā)明中所述雙鏈分子可包含一個(gè)或更多修飾核苷酸和/或非磷酸ニ酯連接。本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾能夠増加所述雙鏈分子的穩(wěn)定性、可用性和/或細(xì)胞攝入。一般技術(shù)人員明白可引入本發(fā)明分子的其它類型的化學(xué)修飾(W003/070744 ；W02005/045037)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用修飾以提供改善的抗降解性或改善的攝入。上述修飾的例子包括但不僅限干，硫代磷酸酯聯(lián)接、2’-0_甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、 2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、5’ -C-甲基核苷酸以及倒轉(zhuǎn)脫氧脫堿基殘基的摻入(US20060122137)。另ー個(gè)實(shí)施方案中，可以使用修飾來(lái)增強(qiáng)雙鏈分子的穩(wěn)定性或増加尋靶效率。這樣的修飾包括但不限于雙鏈分子兩條互補(bǔ)鏈之間的化學(xué)交聯(lián)、雙鏈分子一條鏈的3’或5’ 末端的化學(xué)修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟代修飾的核糖核苷酸和2’-脫氧核糖核苷酸(W02004/029212)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，可以利用修飾來(lái)増加或減少針對(duì)靶 mRNA中和/或互補(bǔ)雙鏈分子鏈中互補(bǔ)核苷酸的親和カ(W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修飾的嘌呤可以用7-脫氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子吋，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替換成脫氧核糖核苷酸(Elbashir SM 等，Genes Dev 2001 Jan 15,15(2) :188-200)。 關(guān)于進(jìn)一歩的細(xì)節(jié)，可以利用公開文獻(xiàn)如US20060234970。本發(fā)明不限于這些實(shí)例，可以將任何已知化學(xué)修飾應(yīng)用于本發(fā)明的雙鏈分子，只要所得分子保留抑制靶基因表達(dá)的能力。此外，本發(fā)明的雙鏈分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體而言，由DNA鏈與RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA鏈(多核苷酸) 組成的雜合型雙鏈分子、或在任ー單鏈(多核苷酸)或兩條單鏈(多核苷酸)上同時(shí)包含 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，諸如此類，來(lái)增強(qiáng)所述雙鏈分子的穩(wěn)定性。DNA鏈和RNA鏈的雜合體可具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中有義鏈?zhǔn)荄NA而反義鏈?zhǔn)荝NA， 或者相反，只要它在導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞中后能夠抑制該基因表達(dá)。優(yōu)選地，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈分子可具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中有義鏈和反義鏈均由DNA和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要在導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞中吋，所述雙鏈分子具有抑制該基因表達(dá)的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩(wěn)定性，分子中優(yōu)選包含盡可能多的DNA ；而為了誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)抑制，要求分子在一定范圍內(nèi)是RNA，以充分地誘導(dǎo)表達(dá)抑制。作為嵌合型雙鏈分子的ー個(gè)優(yōu)選實(shí)例，雙鏈分子的上游部分區(qū)域(即位于有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補(bǔ)序列之側(cè)翼的區(qū)域)為RNA。優(yōu)選地，所述上游部分區(qū)表示有義鏈的5’側(cè)(5’端)和反義鏈的3’側(cè)(3’端)?；蛘?，將位于有義鏈5’末端側(cè)翼或者反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域稱為上游部分區(qū)域。就是說(shuō)，在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’末端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域均由 RNA組成。例如，本發(fā)明的嵌合型或雜合型雙鏈分子包含以下組合。有義鏈5，_[—DNA—]_3，3，-(RNA)-[DNA]-5，
:反義鏈，有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(RNA)-[DNA]-5，:反義鏈，和有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(—RNA—)_5，:反義鏈。上游部分區(qū)優(yōu)選是由9-13個(gè)核苷酸組成的域，從雙鏈分子的有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補(bǔ)序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實(shí)例包括這樣的實(shí)例鏈長(zhǎng)為19-21個(gè)核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半?yún)^(qū)(對(duì)于有義鏈為5’側(cè)區(qū)域而對(duì)于反義鏈為3’側(cè)區(qū)域)是RNA，而另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達(dá)的效果比反義鏈整體為RNA時(shí)強(qiáng)得多(US20050004064)。在本發(fā)明中，雙鏈分子可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如短發(fā)夾RNA(shRNA)以及由DNA與 RNA組成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列， 其形成緊密的發(fā)夾轉(zhuǎn)彎，可以用來(lái)通過(guò)RNA干擾來(lái)沉默基因表達(dá)。shRNA或shD/R-NA在單 ー鏈上包含有義靶序列和反義靶序列，其中所述各序列被環(huán)序列隔開。通常，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被細(xì)胞機(jī)制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA進(jìn)ー步與RISC結(jié)合。這種復(fù)合物結(jié)合并切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的靶標(biāo)序列匹配的mRNA。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可以在有義序列與反義序列之間設(shè)置由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列。因此，本發(fā)明還提供具有通式5’ -[A]-[B]-[A’ ]-3’的雙鏈分子。式中，[A] 為有義鏈，包含與靶序列對(duì)應(yīng)的序列；[B]為間插單鏈；[A']為反義鏈，包含與靶序列互補(bǔ)的序列。靶序列例如可以選自例如SEQ ID N0:9和10。本發(fā)明不限于這些實(shí)例，在雙鏈分子保持抑制作為靶標(biāo)的CSTF2基因的表達(dá)的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在這些實(shí)例的基礎(chǔ)上修飾而得到的序列。區(qū)域[A]與 [A']雜交而形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。間插單鏈部分[B]、即環(huán)序列，長(zhǎng)度優(yōu)選可以為 3 23個(gè)核苷酸。例如，環(huán)序列可以選自由以下的序列組成的組(http //www. ambion. com/ techlib/tb/tb_506. html)。此外，由23個(gè)核苷酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul25,418(6896) :435-8, Epub 2002 Jun 26)CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8，Epub 2002 Jun 26 ；UUCG :Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5 ；Fruscoloni P et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) 1639-44，Epub 2003 FeblO ；和UUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun,4(6) 457-67。優(yōu)選的具有本發(fā)明的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈分子實(shí)例如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 組成的組； 但本發(fā)明不限于此
GGCUUUA⑶CCCGGGCAGA-[B]-UCUGCCCGGGACUAAAGCC (對(duì)靶序列 SEQ ID NO 9)；CACUUUACUUUCUGUAACU-[B]-A⑶UACAGAAAGUAAA⑶G (對(duì)靶序列 SEQ ID NO 10)；此外，為了增強(qiáng)雙鏈分子的抑制活性，可以將數(shù)個(gè)核苷酸添加到靶序列的有義鏈和/或反義鏈的3’末端，作為3’突出端。添加的核苷酸的數(shù)目為至少2個(gè)，通常為2-10 個(gè)，優(yōu)選為2-5個(gè)。添加的核苷酸在雙鏈分子的反義鏈的3’末端形成單鏈。用于3’突出端的核苷酸優(yōu)選但不限于“U”或“t”。當(dāng)雙鏈分子具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，將3’突出端添加至反義鏈的3’末端。對(duì)于雙鏈分子的制備方法沒有特殊限制，但優(yōu)選采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法。根據(jù)化學(xué)合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ顾鼈兺嘶鸬揭黄?，?lái)獲得雙鏈分子。退火的具體例子包括其中將合成的單鏈多核苷酸以優(yōu)選至少約3 7、更優(yōu)選約4 6、最優(yōu)選基本上等摩爾量(即約5 5的摩爾比)的摩爾比混合。然后，將混合物加熱到雙鏈分子解離的溫度，再逐漸冷卻。經(jīng)退火的雙鏈多核苷酸可以采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的常用方法來(lái)純化。純化方法的例子包括利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，或者其中任選地除去剰余的單鏈多核苷酸(例如利用適當(dāng)?shù)拿高M(jìn)行降解)的方法。所述位于CSTF2序列側(cè)翼的調(diào)控序列可為相同或不同的，以使得它們的表達(dá)能夠獨(dú)立地，或者以時(shí)間性或空間性方式被調(diào)控。所述雙鏈分子可通過(guò)將CSTF2基因模板克隆入載體(例如含有來(lái)自小核RNA(SnRNA)TO的RNA多聚酶III轉(zhuǎn)錄單元或人類HlRNA啟動(dòng)子的載體)以在胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?；蛘?，雙鏈分子可通過(guò)將其編碼序列克隆入含有與編碼區(qū)相鄰的指導(dǎo)雙鏈分子在適當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(例如來(lái)自小核RNA(snRNA)U6的RNApoly III轉(zhuǎn)錄單元或人 HlRNA啟動(dòng)子)的載體中而在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。雙鏈分子的編碼序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列可以相同或不同，使得它們的表達(dá)可獨(dú)立調(diào)控，或者以時(shí)間或空間方式調(diào)控。下面會(huì)描述能夠生成雙鏈分子的載體的詳情。編碼本發(fā)明雙鏈分子的載體本發(fā)明還包括編碼ー種或多種本文所述的雙鏈分子的載體、以及包含該載體的細(xì)胞。具體地，本發(fā)明提供了下列載體[1]至[10]。[1] ー種載體，它編碼當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)胞后，抑制CSTF2基因的體內(nèi)表達(dá)和細(xì)胞增殖的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子包含有義鏈以及與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子。[2] [1]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，所述雙鏈分子對(duì)mRNA作用，所述mRNA與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列匹配；[3] [1]中所述的載體，其中有義鏈包括對(duì)應(yīng)于選自SEQ ID NO 9和10的靶序列的序列；[4] [1]至[3]任一中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長(zhǎng)度小于約100個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈分子；[5] [4]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長(zhǎng)度小于約75個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈分子；[6] [5]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長(zhǎng)度小于約50個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈分子；[7] [6]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長(zhǎng)度小于約25個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈分子；[8] [7]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長(zhǎng)度為約19個(gè)至約25個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈分子；[9] [1]至[8]任一中所述的載體，其中所述雙鏈分子由単一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò)間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[10] [9]中所述的載體，它編碼具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'的雙鏈分子，其中，[A]為包含與選自SEQ ID NO :9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個(gè)至 23個(gè)核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與[A]中選擇的靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；本發(fā)明的載體優(yōu)選編碼處于可表達(dá)的形式的本發(fā)明的雙鏈分子。在本說(shuō)明書中， 術(shù)語(yǔ)“處于可表達(dá)的形式”，是指該載體當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，將表達(dá)該分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包含雙鏈分子表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體編碼本發(fā)明的核酸序列且適合表達(dá)所述核酸序列。本發(fā)明的這種載體可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的雙鏈分子，也可以直接用作癌癥治療的活性成分。本發(fā)明的載體可通過(guò)下述方法生成例如，將編碼針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子的有義鏈和反義鏈的序列克隆入表達(dá)載體中，使調(diào)控序列可操作性地連接于編碼所述鏈的序列，以允許兩條鏈的表達(dá)(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄)(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，與mRNA反義的RNA分子由第一啟動(dòng)子(例如位于克隆DNA的3， 末端側(cè)翼的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄，對(duì)mRNA而言為有義鏈RNA分子由第二啟動(dòng)子(例如位于克隆DNA的5’末端側(cè)翼的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄。有義鏈和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默該基因的雙鏈分子構(gòu)建體?；蛘?，使用分別編碼雙鏈分子之有義鏈和反義鏈的兩個(gè)載體構(gòu)建體來(lái)分別表達(dá)有義鏈和反義鏈，隨后形成雙鏈分子構(gòu)建體。而且，克隆的序列可編碼具有ニ 級(jí)結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體，即，載體的単一轉(zhuǎn)錄物同時(shí)包含靶基因的有義序列和互補(bǔ)反義序列二者。也可以配置本發(fā)明的載體使得其實(shí)現(xiàn)在靶細(xì)胞的基因組中的穩(wěn)定插入(關(guān)于同源重組盒載體的說(shuō)明，參見Thomas KR&Capecchi MR, Cell 1987，51 :503-12)?？梢詤⒖祭?Wolff 等，Science 1990,247 :1465-8 ；美國(guó)專利第 5，580，859 號(hào)、第 5，589，466 號(hào)、第 5，804，566 號(hào)、第 5，739，118 號(hào)、第 5，736，524 號(hào)、第 5，679，647 號(hào)和 WO 98/04720?；?DNA的輸送技術(shù)的例子包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導(dǎo)型) 輸送、陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合體、和粒子介導(dǎo)型投遞(“基因槍”)或壓カ介導(dǎo)型輸送(例如參照美國(guó)專利第5，922，687號(hào))。本發(fā)明的載體包括，例如，病毒載體或細(xì)菌載體。表達(dá)載體的例子包括牛痘或雞痘等減毒病毒宿主(參照美國(guó)專利第4，722，848號(hào))。該策略涉及例如使用牛痘病毒作為載體來(lái)表達(dá)編碼雙鏈分子的核苷酸序列。重組牛痘病毒在被導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞時(shí)即表達(dá)該分子并由此抑制細(xì)胞的増殖。可使用的載體的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG載體在 Mover等，Nature 1991，351 :456-60中有記載。其它多種多樣的載體可用于雙鏈分子的治療性施用與生產(chǎn)，例子包括腺病毒載體和腺隨伴病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等。參照例如Shata等，Mol Med Today2000，6 :66-71 ;Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000，68 :793-806 ；以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571-85。使用本發(fā)明雙鏈分子抑制或降低癌細(xì)胞生長(zhǎng)或治療癌癥的方法本發(fā)明提供了抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，例如肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法通過(guò)抑制 CSTF2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)CSTF2基因的功能障礙。CSTF2基因表達(dá)可通過(guò)任何上文所述的特異性靶向CSTF2基因的本發(fā)明雙鏈分子或可表達(dá)至少ー種所述雙鏈分子的本發(fā)明載體來(lái)抑制。上述本發(fā)明雙鏈分子及載體抑制癌性細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)的能力提示其可用于治療癌癥的方法。因此，發(fā)明提供通過(guò)施用針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子或表達(dá)所述分子的載體來(lái)治療罹患肺癌患者而無(wú)不良作用的方法，因?yàn)檎Ｆ鞴僦袔缀鯔z測(cè)不到該基因。具體而言，本發(fā)明提供下列[1]至[36]的方法[1] 一種在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法，包括對(duì)受試者施用藥學(xué)有效量的針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子在導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)抑制 CSTF2基因的表達(dá)；[2] [1]的方法，其中所述雙鏈分子對(duì)mRNA作用，所述mRNA與選自SEQ ID NO :9和 10的靶序列匹配；[3] [1]的方法，其中有義鏈包含與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列；[4] [1]至[3]任一的方法，其中施用多種雙鏈分子；[5] [1]至[4]任一的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約100個(gè)核苷酸對(duì)；[6] [5]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約75個(gè)核苷酸對(duì)；[7] [6]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約50個(gè)核苷酸對(duì)；[8] [7]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約25個(gè)核苷酸對(duì)；[9] [9]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度為大約19個(gè)至大約25個(gè)核苷酸對(duì)；[10] [1]至[9]任一的方法，其中所述雙鏈分子由単一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò)間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[11] [10]的方法，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID NO :9和10中的靶序列對(duì)應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個(gè) 23 個(gè)核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與[A]中選擇的靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；[12] [1]至[11]任一的方法，其中所述雙鏈分子是RNA ；[13] [1]至[11]任一的方法，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA ；[14] [13]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[15] [14]的方法，其中所述有義與反義鏈多核苷酸分別由DNA與RNA構(gòu)成；[16] [13]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[17] [16]的方法，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA構(gòu)成，或者有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA構(gòu)成；
[18] [17]的方法，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個(gè)核苷酸組成；[19] [1]至[18]任一的方法，其中所述雙鏈分子包含ー個(gè)或多個(gè)3’突出端；[20] [1]至[19]任一的方法，其中所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組合物除所述分子外還包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和藥學(xué)上可接受的載體。[21] [1]至[20]任一的方法，其中所述雙鏈分子由載體編碼；[22] [21]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子對(duì)mRNA作用，所述mRNA與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列匹配；[23] [22]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列；[24] [23]的方法，其中施用多種雙鏈分子；[25] [21]至[24]任一的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈長(zhǎng)度小于大約100個(gè)核苷酸對(duì)；[26] [25]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約75個(gè)核苷酸對(duì)；[27] [26]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約50個(gè)核苷酸對(duì)；[28] [27]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約25個(gè)核苷酸對(duì)；[29] [28]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度在大約19個(gè)與大約25個(gè)核苷酸對(duì)之間；[30] [21]至[29]任一的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由単一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò)間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[31] [30]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子具有通式 5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中，[A]為包含與選自SEQ ID NO :9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個(gè)至23個(gè)核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與[A]中選擇的靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；[34] [21]至[31]任一的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組合物除所述分子外還包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和藥學(xué)上可接受的載體；[35] [1]至[34]任一的方法，其中所述癌癥為肺癌；和[36] [35]的方法，其中所述肺癌為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌或小細(xì)胞肺癌。本發(fā)明方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述。可通過(guò)將細(xì)胞與針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子、表達(dá)該分子的載體或包含同樣分子的組合物接觸來(lái)抑制表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞的生長(zhǎng)。可進(jìn)ー步將所述細(xì)胞與轉(zhuǎn)染劑接觸。 合適的轉(zhuǎn)染劑在本領(lǐng)域是已知的。短語(yǔ)“抑制細(xì)胞生長(zhǎng)”表示所述細(xì)胞較之未暴露于所述分子的細(xì)胞以較低的速率増殖或具有降低的存活力。細(xì)胞生長(zhǎng)可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)測(cè)定， 例如使用MTT細(xì)胞増殖測(cè)定。任何種類的細(xì)胞的生長(zhǎng)均可根據(jù)本方法進(jìn)行阻抑，只要所述細(xì)胞表達(dá)或過(guò)表達(dá)本發(fā)明所述雙鏈分子的靶基因?？勺鳛槔拥募?xì)胞包括肺癌細(xì)胞，諸如NSCLC和SCLC。因此，對(duì)于正罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生與CSTF2有關(guān)的疾病，例如癌癥的患者，可通過(guò)施用至少ー種本發(fā)明雙鏈分子、表達(dá)至少一種所述分子的至少ー種載體或包含至少ー種所述分子的至少ー種組合物進(jìn)行治療。舉例而言，肺癌患者可根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。癌癥類型可通過(guò)根據(jù)所診斷的特定類型腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行鑒定。肺癌可通過(guò)，例如，癌胚抗原(CEA)、CYFRA、pro-GRP等等作為肺癌標(biāo)志，或通過(guò)胸部X光和/或痰細(xì)胞學(xué)進(jìn)行診斷。 更優(yōu)選地，用本發(fā)明所述方法治療的患者是用這樣的方法選出的在自患者獲得的活檢標(biāo)本中通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，例如RT-PCR或免疫測(cè)定法檢測(cè)CSTF2基因的表達(dá)。優(yōu)選地， 在本發(fā)明的治療之前，對(duì)于來(lái)自受試者的所述活檢標(biāo)本通過(guò)本領(lǐng)域所知的方法，例如，免疫組織化學(xué)分析或RT-PCR，證實(shí)CSTF2基因的過(guò)表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的方法，為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并藉此治療癌癥，當(dāng)施用多種所述雙鏈分子 (或表達(dá)同樣分子的載體或含有同樣分子的組合物)時(shí)，每個(gè)所述分子可具有不同結(jié)構(gòu)，但作用干與相同靶序列匹配的mRNA?；蛘?，多種雙鏈分子可作用干與相同基因的不同靶序列匹配的mRNA，或作用干與不同基因的不同靶序列匹配的mRNA。舉例而言，所述方法可使用針對(duì)CSTF2基因不同靶序列的雙鏈分子?；蛘?，例如，本方法可利用針對(duì)CSTF2基因和其它基因的ー種、兩種或更多種靶序列的雙鏈分子。為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，本發(fā)明的雙鏈分子可直接以可實(shí)現(xiàn)該分子與對(duì)應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式導(dǎo)入細(xì)胞。另外，如上所述，編碼雙鏈分子的DNA可作為載體導(dǎo)入細(xì)胞。為將雙鏈分子和載體導(dǎo)入細(xì)胞，可使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，例如FuGENE(Roche diagnostics)、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen; > Oligofectamine (Invitrogen; % Nucleofector (ffako pure Chemical)。當(dāng)治療導(dǎo)致臨床效益，諸如CSTF2基因表達(dá)的減少、受試者中癌癥的尺寸、患病率 (prevalence)、或轉(zhuǎn)移潛力的降低吋，可以認(rèn)為該治療是“有效”的。當(dāng)預(yù)防性地適用治療吋，“有效”是指其延遲或防止癌癥形成，或者預(yù)防或緩解癌癥的臨床癥狀。有效性結(jié)合特定腫瘤類型的任何公知的診斷或治療方法來(lái)加以確定。就本發(fā)明的方法和組合物用于“預(yù)防”和“防范”的語(yǔ)境而言，此類術(shù)語(yǔ)在本文中可互換使用，指降低源自疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動(dòng)。預(yù)防和防范可發(fā)生干“一級(jí)、ニ級(jí)和三級(jí)預(yù)防水平”。一級(jí)預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而ニ級(jí)和三級(jí)預(yù)防和防范水平涵蓋_在預(yù)防和防范疾病的進(jìn)展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過(guò)恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來(lái)降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動(dòng)?；蛘撸A(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的増殖和轉(zhuǎn)移等)的廣泛的預(yù)防性療法。治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個(gè)體死亡率及改善其預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測(cè)癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10%、20%、30%或更多降低，或病情穩(wěn)定。應(yīng)理解，本發(fā)明的所述雙鏈分子降解亞化學(xué)計(jì)量的CSTF2mRNA。雖不愿拘于任何理論，認(rèn)為本發(fā)明的所述雙鏈分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，與常規(guī)的癌癥療法相比，為實(shí)施治療效應(yīng)而需要輸送到癌癥的位置或其附近的雙鏈分子要少得多。本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了受試者的體重、年齢、性別、疾病類型、癥狀及其它條件、 施用途徑、以及是局部施用還是全身施用等因素的基礎(chǔ)上，能夠容易地確定本發(fā)明的雙鏈分子的有效量。一般而言，本發(fā)明雙鏈分子的有效量是在癌癥部位或其附近胞間濃度為大約1納摩爾(nM)到約IOOnM,優(yōu)選大約2nM到大約50nM,更優(yōu)選大約2. 5nM到大約IOnM0 考慮可使用更多或更少量的雙鏈分子。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可方便地及常規(guī)地確定特定情況下所需的確切劑量。本發(fā)明的方法可用于抑制表達(dá)CSTF2基因的癌癥，例如肺癌，包括NSCLC和SCLC， 的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。具體而言，含有靶序列SEQ ID NO :9或10的雙鏈分子特別優(yōu)選用來(lái)治療肺為了治療癌癥，還可以將本發(fā)明的雙鏈分子與不同于所述雙鏈分子的藥劑組合來(lái)施用于受試者。或者，本發(fā)明的雙鏈分子還可以與其它旨在用于癌癥治療的治療方法組合來(lái)施用于受試者。舉例而言，本發(fā)明所述雙鏈分子可與現(xiàn)在用于治療癌癥或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的治療方法(例如，放射療法，外科手木，以及使用化療劑，如順鉬、卡鉬、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔紅霉素(daimorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治療)組合施用。在本發(fā)明的方法中，雙鏈分子可以裸雙鏈分子的形式、以與投遞物質(zhì)相組合的形式，或者以表達(dá)雙鏈分子的重組質(zhì)?；蛘卟《据d體的形式施用于受試者。用干與本發(fā)明的雙鏈分子組合施用的合適的投遞物質(zhì)包括Mirus Transit TKO親脂性物質(zhì)、LipofectiruLipofectamine.Cellfectin、或聚陽(yáng)離子(例如聚賴氨酸)、或脂質(zhì)體。ー種優(yōu)選的投遞物質(zhì)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體能夠幫助將雙鏈分子投遞至特定的組織如肺腫瘤組織中，還能夠増加雙鏈分子的血中半衰期。適合在本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體是由常規(guī)的囊泡形成性脂質(zhì) (vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂質(zhì)通常包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂，以及甾醇，諸如膽固醇。對(duì)ー些因素的考慮通?？梢詾橹|(zhì)的選擇提供指導(dǎo)，如期望的脂質(zhì)體大小以及在血流中的脂質(zhì)體的半衰期等。有多種制備脂質(zhì)體的方法是公知的，例如Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioengl980，9 :467 ；美國(guó)專利第 4，235，871 號(hào)；第 4，501，728 號(hào)；第 4，837，028號(hào)；和第5，019，369號(hào)；將上述文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容援引并入本說(shuō)明書。優(yōu)選地，封裝本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體包含能夠?qū)⒅|(zhì)體輸送至癌癥部位的配體分子。優(yōu)選的配體是與腫瘤或血管內(nèi)皮細(xì)胞中常見的受體結(jié)合的配體，例如與腫瘤抗原或內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原結(jié)合的單克隆抗體。特別優(yōu)選地，封裝本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)了修飾以免被單核巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，例如，由于其結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合有調(diào)理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時(shí)包括調(diào)理作用抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大型親水性聚合物。如在本說(shuō)明書中所使用的，例如，當(dāng)調(diào)理作用抑制部分化學(xué)地或物理地搭接在脂質(zhì)體膜上吋，例如通過(guò)脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過(guò)與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合時(shí)，則稱調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護(hù)性表層，該表層顯著地減少巨噬-單核細(xì)胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) ("RES")對(duì)脂質(zhì)體的攝入；在例如美國(guó)專利第4，920，016號(hào)中對(duì)此有記載，后者的全部公開內(nèi)容援引并入本說(shuō)明書。因此，與未修飾的脂質(zhì)體相比，被調(diào)理作用抑制部分修飾過(guò)的脂質(zhì)體能夠保留在血液循環(huán)中的時(shí)間顯著更長(zhǎng)。出于以上理由，這樣的脂質(zhì)體有時(shí)也被稱為“隱形”(stealth)脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統(tǒng)供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統(tǒng)缺損為特征的靶組織，例如實(shí)體瘤中，這些脂質(zhì)體會(huì)高效率地蓄積。 參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此夕卜，RES 的攝入的減少阻止隱形脂質(zhì)體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠?qū)⒈景l(fā)明的雙鏈分子輸送至腫瘤細(xì)胞。適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選為分子量約500 約40，000道爾頓、更優(yōu)選約2，000 約20，000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙ニ 醇(PEG)或聚丙ニ醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酷； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，諸如化學(xué)結(jié)合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過(guò)與碳酸的衍生物反應(yīng)而生成了羧基結(jié)合的羧基化多糖類或寡糖。優(yōu)選地，調(diào)理作用抑制部分為PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“PEG化脂質(zhì)體”。調(diào)理作用抑制部分可以通過(guò)許多公知技術(shù)中的任何一種結(jié)合到脂質(zhì)體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結(jié)合，然后再結(jié)合到膜上。相似地，可以通過(guò)還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來(lái)將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶剤，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。上文討論了表達(dá)本發(fā)明的雙鏈分子的載體。這樣的表達(dá)至少一種本發(fā)明的雙鏈分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞物質(zhì)組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Mirus Transit LTl 親脂性物質(zhì)、Lipofectin、Lipofectamine、cellfectin、聚陽(yáng)離子(例如聚賴氨酸)或脂質(zhì)體。將表達(dá)本發(fā)明的雙鏈分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區(qū)域的方法在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的雙鏈分子可以通過(guò)適于將雙鏈分子遞送到癌癥部位的任何手段來(lái)施用給受試者。例如，雙鏈分子可以通過(guò)基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化道或腸內(nèi)施用途徑來(lái)施用。合適的腸內(nèi)施用途徑包括口腔、直腸、或鼻內(nèi)遞送。合適的非消化道施用途徑包括血管內(nèi)施用(例如靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)推注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和針對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)的導(dǎo)管滴注)，組織周圍和組織內(nèi)注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥部位或其附近的區(qū)域，例如借助導(dǎo)管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的栓劑或植入物)，和吸入。優(yōu)選通過(guò)注射或輸注將雙鏈分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發(fā)明的雙鏈分子可以以單ー劑量或分多個(gè)劑量來(lái)施用。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈分子的施用為輸注方式時(shí)，輸注可以是單個(gè)持續(xù)劑量，或者通過(guò)多次輸注來(lái)施用。優(yōu)選的是將藥劑直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優(yōu)選的是將藥劑多次注射到癌癥部位或其附近的組織中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用于對(duì)給定受試者施用本發(fā)明雙鏈分子的合適劑量方案。例如，雙鏈分子可以一次性施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式施用到癌癥部位或其附近。或者，雙鏈分子可以在約3 約28日、更優(yōu)選約7 約10日的期間內(nèi)毎日一次或二次地施用給受試者。在優(yōu)選的劑量方案中，雙鏈分子可以在7日期間內(nèi)ー 日一次地注射到癌癥部位或其附近。當(dāng)劑量方案包括多次施用吋，應(yīng)該理解的是，給受試者施用的雙鏈分子的有效量，可以包含在整個(gè)劑量方案中施用的該雙鏈分子的總量。在本發(fā)明中，可以用至少ー種選自下組的活性成分來(lái)治療過(guò)表達(dá)CSTF2的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。所述癌癥包括但不限于肺癌。因而，在施用本發(fā)明的雙鏈分子作為活性成分之前， 優(yōu)選確認(rèn)要治療的癌細(xì)胞或組織中CSTF2的表達(dá)水平與相同器官的正常細(xì)胞相比是否升高。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療(過(guò))表達(dá)CSTF2的癌癥的方法，該方法可包括下列步驟i)檢測(cè)自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中CSTF2的表達(dá)水平；ii)將所述CSTF2表達(dá)水平與正常對(duì)照比較；并iii)對(duì)具有與正常對(duì)照相比過(guò)表達(dá)CSTF2的癌癥的受試者施用至少ー種選自下組的成分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體?；蛘撸景l(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含至少ー種選自下組的成分，用于施用于具有過(guò)表達(dá)CSTF2的癌癥的受試者(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。換言之，本發(fā)明進(jìn)一歩提供了ー種用于鑒定要用下述各項(xiàng)治療的受試者的方法(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(c)編碼它們的載體，該方法可包括測(cè)定源自受試者的癌細(xì)胞或組織中CSTF2的表達(dá)水平的步驟，其中所述水平與該基因正常對(duì)照相比的升高指示該受試者具有可用下述各項(xiàng)治療的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或
(c)編碼它們的載體。下面會(huì)更加詳細(xì)地描述本發(fā)明治療癌癥的方法。要用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。例示性的哺乳動(dòng)物包括但不僅限于例如人類、非人靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。根據(jù)本發(fā)明，測(cè)定在自受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中CSTF2的表達(dá)水平。使用本領(lǐng)域已知方法，可在轉(zhuǎn)錄(核酸)產(chǎn)物水平上確定表達(dá)水平。舉例而言，可通過(guò)雜交方法 (例如，Northern雜交)使用探針定量CSTF2的mRNA。所述檢測(cè)可在芯片或陣列上實(shí)施。 對(duì)檢測(cè)CSTF2的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用CSTF2的序列信息制備上述探針。舉例而言，CSTF2的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達(dá)水平可以作為發(fā)生了雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度檢測(cè)。進(jìn)一歩，可通過(guò)基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法(例如，RT-PCR)使用引物定量CSTF2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如SEQ ID NO :1)。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制備。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與CSTF2的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語(yǔ)“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境下會(huì)不同。較長(zhǎng)序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^(guò)量存在，因此在Tm，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件會(huì)是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約 0.01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對(duì)于較短的探針或引物(例如10-50個(gè)核苷酸)是至少大約30°C，對(duì)于較長(zhǎng)的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來(lái)實(shí)現(xiàn)。或者，可以檢測(cè)翻譯產(chǎn)物以進(jìn)行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定CSTF2蛋白(SEQ ID NO 2)的量。測(cè)定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測(cè)定法，其使用特異識(shí)別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab' )2、Fv等)均可用于檢測(cè)，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對(duì)CSTF2蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些種類的用于檢測(cè)蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另ー種基于CSTF2的翻譯產(chǎn)物檢測(cè)CSTF2基因表達(dá)水平的方法，可利用針對(duì) CSTF2蛋白的抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)分析測(cè)量染色的強(qiáng)度。意即，在此測(cè)量中，強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)的存在/水平増加，且同時(shí)表明CSTF2基因的高表達(dá)水平。對(duì)于靶基因(例如CSTF2基因)在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平而言，如果該水平較之靶基因的對(duì)照水平(例如在正常細(xì)胞中的水平)増加了例如10^,25%或50%，或増加到超過(guò)1. 1倍、超過(guò)1. 5倍、超過(guò)2. 0倍、超過(guò)5. 0倍、超過(guò)10. 0倍或者更多的話，可以確定該水平是增加的。對(duì)照水平可以與癌細(xì)胞同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細(xì)胞可用作正常對(duì)照。或者，對(duì)照水平可以借助統(tǒng)計(jì)方法，基于通過(guò)分析先前測(cè)定的來(lái)自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的CSTF2基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一歩，對(duì)照水平可以是來(lái)自先前測(cè)試過(guò)的細(xì)胞的表達(dá)樣式數(shù)據(jù)庫(kù)。而且，根據(jù)本發(fā)明的ー個(gè)方面，可以將生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平與從多個(gè)參考樣品確定的多個(gè)對(duì)照水平比較。優(yōu)選地使用從來(lái)自與源自受試者的生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對(duì)照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中CSTF2基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值士2S.D.或平均值士3S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的背景中，從已知非癌性的生物樣品確定的對(duì)照水平稱作“正常對(duì)照水平”。另ー方面，若對(duì)照水平從癌性生物樣品確定，則它稱作“癌性對(duì)照水平”。若CSTF2基因的表達(dá)水平相比于正常對(duì)照水平提高了或與癌性對(duì)照水平相似/等同，則可診斷受試者為具有要治療的癌癥。包含本發(fā)明雙鏈分子的組合物除上述外，本發(fā)明亦提供了包含至少ー種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼該分子的載體的藥物組合物。具體而言，本發(fā)明提供下述[1]至[34]的組合物[1] 一種用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或治療或預(yù)防癌癥的組合物，其中所述組合物包括至少ー種分離的針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子在導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)抑制CSTF2的表達(dá)和細(xì)胞増殖，其中該雙鏈分子包括有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈分子，所述組合物還包括可藥用擔(dān)載體；[2] [1]中的組合物，其中所述雙鏈分子作用于mRNA，所述mRNA與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列匹配；[3] [1]的組合物，其中所述雙鏈分子，其中有義鏈包含與選自SEQ ID NO 9和10 的靶序列相應(yīng)的序列。[4] [1]的組合物，其中所述組合物包含多種所述雙鏈分子；[5] [1]至[3]任一的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約100個(gè)核苷酸對(duì)；[6] [5]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約75個(gè)核苷酸對(duì)；[7] [6]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約50個(gè)核苷酸對(duì)；[8] [7]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約25個(gè)核苷酸對(duì)；[9] [8]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度為大約19個(gè)到大約25個(gè)核苷酸對(duì)；[10] [1]至[9]任一的組合物，其中所述雙鏈分子由単一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò)間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[11] [10]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列的有義鏈序列，[B]為由3個(gè) 23個(gè)核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與[A]中選擇的靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；
[12] [1]至[11]任一的組合物，其中所述雙鏈分子是RNA ；[13] [1]至[11]任一的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA和/或RNA ；[14] [13]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[15] [14]的組合物，其中所述有義鏈多核苷酸與反義鏈多核苷酸分別由DNA與 RNA組成；[16] [13]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[17] [16]的組合物，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA組成；[18] [17]的組合物，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個(gè)核苷酸組成；[19] [1]至[18]任一的組合物，其中所述雙鏈分子包含ー個(gè)或兩個(gè)3’突出端；[20] [1]至[19]任一的組合物，其中所述組合物進(jìn)ー步包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。[21] [1]至[20]任一的組合物，其中所述雙鏈分子由載體編碼并包含于組合物中；[22] [21]中的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子作用于mRNA，所述 mRNA與選自SEQ ID NO 9禾ロ 10的靶序列匹配；[23] [21]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與選自 SEQ ID NO 9和10的靶序列相應(yīng)的序列；[24] [21]至[23]任一的組合物，其中施用多種所述雙鏈分子；[25] [21]至[24]任一的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約100個(gè)核苷酸對(duì)；[26] [25]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約75個(gè)核苷酸對(duì)；[27] [26]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約50個(gè)核苷酸對(duì)；[28] [27]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度小于大約25個(gè)核苷酸對(duì)；[29] [28]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長(zhǎng)度為大約19個(gè)至大約25個(gè)核苷酸對(duì)；[30] [21]至[29]任一的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由単一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò)間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈二者；[31] [30]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID NO :9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個(gè) 23個(gè)核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與[A]中選擇的靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；[32] [21]至[31]任一的組合物，其中所述組合物進(jìn)ー步包含轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑；[33] [1]至[32]任一的組合物，其中所述癌癥為肺癌。和[34] [33]的組合物，其中所述肺癌為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌或小細(xì)胞肺癌。本發(fā)明合適的組合物將在下面更加詳述地加以描述。本發(fā)明的所述雙鏈分子優(yōu)選在施用于受試者之前根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)配制為藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物特征為至少是無(wú)菌且不含熱原的。本文中所使用的“藥物配制劑”包括適用于人類與獸醫(yī)用的配制劑。制備本發(fā)明藥物組合物的方法屬于本領(lǐng)域一般技術(shù)，例如，描述于 Remington’ s Pharmaceutical Science, 17th ed. ，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)，其全部公開內(nèi)容通過(guò)引用包含于本文中。本發(fā)明的藥物配制劑包含至少ー種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它們的載體(例如， 以重量計(jì)為0. 到90% )，或所述分子的生理學(xué)上可接受的鹽，與生理上可接受的載體介質(zhì)混合。生理學(xué)上可接受的載體介質(zhì)優(yōu)選水、緩沖水、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、 透明質(zhì)酸及類似物。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物可包含多種雙鏈分子，其中每ー個(gè)可針對(duì)相同基因的不同靶序列或不同基因的不同靶序列。舉例而言，所述組合物可包含針對(duì)CSTF2基因靶序列的雙鏈分子?；蛘?，例如，所述組合物可包含針對(duì)CSTF2基因和其它基因的ー種、兩種或更多種靶序列的雙鏈分子。而且，本組合物可以包含編碼1個(gè)或多個(gè)雙鏈分子的載體。例如，所述載體可以編碼1種、2種或數(shù)種本雙鏈分子?；蛘撸窘M合物可以包含多種載體，而各載體編碼不同的雙鏈分子。而且，本雙鏈分子可以作為脂質(zhì)體的形式包含在本組合物中。脂質(zhì)體的詳細(xì)內(nèi)容可以參照“使用本發(fā)明的雙鏈分子抑制或降低癌細(xì)胞生長(zhǎng)或治療癌癥的方法”項(xiàng)。本發(fā)明的組合物可以是藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物中還可以包含傳統(tǒng)的藥用賦形劑和/或添加剤。合適的藥用賦形劑包括穩(wěn)定化劑、抗氧化劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括生理學(xué)生物相容性的緩沖劑(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補(bǔ)加螯合劑(例如DTPA或DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復(fù)合物(例如、鈣DTPA、 CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選地，補(bǔ)加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。對(duì)于固體組合物，可以使用常規(guī)的無(wú)毒固態(tài)載體；例如，藥物級(jí)的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于ロ服施用的固體藥物組合物中可以包含上述列舉的任意載體和賦形劑，以及10-95%，優(yōu)選25-75%的本發(fā)明的一種或多種雙鏈分子。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可以包含0.01-20重量％、優(yōu)選1-10重量％的包被于上述脂質(zhì)體中的ー種或多種本發(fā)明的雙鏈分子，以及推進(jìn)劑。還可以根據(jù)需要包含載體，例如用于鼻內(nèi)投遞的卵
磷脂等。除上述之外，本組合物中還可以包含其它藥學(xué)活性成分，只要它們不抑制本雙鏈分子的體內(nèi)功能。例如，上述組合物中可以包含常規(guī)用于癌癥治療的化療藥物。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的雙鏈核酸分子在制備用于治療以表達(dá)CSTF2為特征的肺癌的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明涉及下述雙鏈核酸分子在制備用于治療表達(dá)CSTF2的肺癌的藥物組合物中的用途該分子在細(xì)胞內(nèi)抑制CSTF2基因的表達(dá)，且該分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以選自SEQ ID NO 9和10的序列為靶標(biāo)?；蛘?，本發(fā)明進(jìn)一歩提供在治療表達(dá)CSTF2基因的肺癌中使用的本發(fā)明雙鏈核酸分子。此外，本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療部分以表達(dá)CSTF2為特征的肺癌的藥物組合物的方法或エ藝。該方法或エ藝包括將藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的載體與作為活性成分的下述雙鏈核酸分子一起制劑化的步驟，其中所述雙鏈核酸分子抑制細(xì)胞內(nèi)CSTF2的表達(dá)，且該分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以選自SEQ ID NO 9和10的序列為靶標(biāo)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療以表達(dá)CSTF2為特征的肺癌的藥物組合物的方法或エ藝，其中所述方法或エ藝包括將活性成分與藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體混合的步驟，其中所述活性成分是這樣的雙鏈核酸分子，其在過(guò)表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞中抑制CSTF2的表達(dá)，該分子包含有義鏈與與其互補(bǔ)的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈核酸分子，并以選自SEQ ID NO 9和10的序列為靶標(biāo)。檢測(cè)或診斷肺癌的方法發(fā)現(xiàn)CSTF2基因的表達(dá)在肺癌細(xì)胞中特異性的提高(圖1A-1C)。因此，本文鑒定出的基因及其轉(zhuǎn)錄與翻譯產(chǎn)物可以作為肺癌標(biāo)志用于診斷，且通過(guò)測(cè)量細(xì)胞樣品中CSTF2 基因的表達(dá)可診斷肺癌。具體而言，本發(fā)明提供了通過(guò)確定受試者中CSTF2表達(dá)水平診斷肺癌的方法?？捎帽痉椒ㄔ\斷的肺癌包括NSCLC與SCLC。進(jìn)ー步地，NSCLC，包括肺腺癌 (ADC)、肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和大細(xì)胞癌(LCC)，亦可通過(guò)本發(fā)明診斷或檢測(cè)出來(lái)。根據(jù)本發(fā)明，可提供用于檢查受試者狀況的中間結(jié)果。所述中間結(jié)果可與其它信息結(jié)合起來(lái)以協(xié)助醫(yī)生、護(hù)士或其它從業(yè)人員診斷患者罹患所述疾病。就是說(shuō)，本發(fā)明提供用于檢查癌癥的診斷標(biāo)志物CSTF2?；蛘撸景l(fā)明提供了一種用于檢測(cè)或鑒定源自受試者的肺組織樣品中癌細(xì)胞的方法，所述方法包括測(cè)定源自受試者的生物樣品中CSTF2基因表達(dá)水平的步驟，其中所述表達(dá)水平與所述基因的正常對(duì)照水平相比的升高指示組織中存在或懷疑存在癌細(xì)胞。此類結(jié)果可以與別的信息組合來(lái)幫助醫(yī)生、護(hù)士、或其它保健從業(yè)人員診斷受試者患有疾病。換言之，本發(fā)明可以給醫(yī)生提供有用信息來(lái)診斷受試者患有疾病。 例如，依照本發(fā)明，當(dāng)關(guān)于自受試者獲得的組織中癌細(xì)胞的存在有疑問時(shí)，通過(guò)考慮CSTF2 基因的表達(dá)水平，加上疾病的其他不同方面，包括組織病理學(xué)、血液中的已知腫瘤標(biāo)志物的水平、和受試者的臨床過(guò)程等，能做出臨床決策。例如，ー些公知的血液中的診斷性肺腫瘤標(biāo)志物為 IAP，ACT, BFP, CA19-9, CA50, CA72-4，CA130, CEA, KMO-1, NSE, SCC, SPl，Span-I， TPA, CSLEX，SLX, STN和CYFRA。就是說(shuō)，在本發(fā)明的這個(gè)具體實(shí)施方案中，基因表達(dá)分析的結(jié)果作為中間結(jié)果，用于進(jìn)ー步診斷受試者的疾病狀態(tài)。具體而言，本發(fā)明提供了下述[1]到[11]的方法[1] ー種在受試者中診斷肺癌或肺癌發(fā)生傾向性的方法，所述方法包括下述步驟(a)檢測(cè)源自受試者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平；(b)將檢測(cè)出的表達(dá)水平較之該基因的正常對(duì)照水平的提高與該受試者中疾病的存在相關(guān)聯(lián)；[2] [1]的方法，其中所述表達(dá)水平比正常對(duì)照水平高至少10% ；[3] [1]或[2]的方法，其中所述表達(dá)水平通過(guò)選自下組的方法檢測(cè)(a)檢測(cè)由CSTF2基因編碼的mRNA ；
(b)檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)；(c)檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性；[4] [3]的方法，其中所述表達(dá)水平是通過(guò)檢測(cè)探針與由CSTF2基因編碼的mRNA的雜交來(lái)確定的；[5] [3]的方法，其中所述表達(dá)水平是通過(guò)檢測(cè)針對(duì)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體與由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)合來(lái)確定的；[6] [1]至[5]任一的方法，其中所述生物樣品包括活檢樣品、痰或血液。[7] [1]至[6]任一的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含上皮細(xì)胞。[8] [1]至[7]任一的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含癌性細(xì)胞。[9] [8]的方法，其中所述源自受試者的生物樣品包含癌性上皮細(xì)胞。[10] [1]至[9]任一的方法，其中所述源自受試者的生物樣品包含肺組織或肺細(xì)胞。[11] [1]至[10]任一的方法，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC。診斷肺癌的方法將在下面更加詳細(xì)的加以敘述。用本方法診斷的受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括但不僅限干，例如， 人類，非人靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬以及牛。為實(shí)施診斷，優(yōu)選從要診斷的受試者采集生物樣品。任何生物學(xué)材料均可作為生物樣品用于測(cè)定，只要其包括目標(biāo)的CSTF2基因轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。所述生物樣品包括，但不僅限干，想要診斷或懷疑患有癌癥的身體組織與體液，例如血液，痰，胸腔積液與尿液。生物樣品優(yōu)選含有這樣的細(xì)胞群體，該群體包括上皮細(xì)胞，更優(yōu)選癌性上皮細(xì)胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細(xì)胞。進(jìn)一歩，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細(xì)胞， 并將其用為生物樣品。在ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品含有肺組織或肺細(xì)胞。此類生物樣品可通過(guò)自受試者的肺中懷疑癌性的區(qū)域收集肺組織或肺細(xì)胞來(lái)獲得，例如通過(guò)活檢。根據(jù)本發(fā)明，測(cè)定在所述源自患者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平。表達(dá)水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)水平確定，使用本領(lǐng)域熟知的方法。舉例而言，CSTF2基因的mRNA 可通過(guò)雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量。可在芯片或陣列上實(shí)施所述檢測(cè)。 對(duì)檢測(cè)多個(gè)基因(例如，多種癌癥特異性基因)，包括CSTF2基因，的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用CSTF2基因(SEQ ID NO 1 ;GenBank登錄號(hào)NM_001325) 的序列信息制備上述探針。舉例而言，CSTF2基因的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物例如染料、熒光或同位素來(lái)標(biāo)記，且所述基因的表達(dá)水平可以作為發(fā)生雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度來(lái)加以檢測(cè)。進(jìn)一歩，CSTF2基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過(guò)基于擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制備。舉例而言，用于實(shí)施例的引物或探針(SEQ ID NO :3、4、7和8)可用于通過(guò)RT-PCR或Northern印跡的檢測(cè)，但本發(fā)明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件與低嚴(yán)格條件下與CSTF2基因的mRNA雜交。如上文定義的，短語(yǔ)“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，在不同的環(huán)境下會(huì)不同。較長(zhǎng)序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇為比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約 5°C。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^(guò)量存在，因此在Tm下，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約0. 01-1. OM 鈉離子(或其它鹽)，PH7. 0-8. 3，溫度對(duì)于較短的探針或引物(例如10-50個(gè)核苷酸)是至少大約30°C，用于較長(zhǎng)的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?，本發(fā)明的診斷可以通過(guò)檢測(cè)翻譯產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行。例如，可以確定CSTF2蛋白的量。測(cè)定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測(cè)定法，此類方法使用特異識(shí)別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、 SCFV、Fab、F(ab’)2、FV等)均可用于檢測(cè)，只要該片段保留對(duì)CSTF2蛋白的結(jié)合能力即可。 制備這些類型的用于檢測(cè)蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另ー種基于CSTF2的翻譯產(chǎn)物檢測(cè)其基因的方法，可利用針對(duì)CSTF2蛋白的抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)分析觀察其染色的強(qiáng)度。即，觀察到強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)的存在増加，且同時(shí)表明CSTF2的高表達(dá)水平。另外，除CSTF2基因的表達(dá)水平外，亦可確定其它癌癥相關(guān)基因，例如已知在肺癌中有差異表達(dá)的基因的表達(dá)水平，以提高所述診斷的準(zhǔn)確性。對(duì)于包括CSTF2基因在內(nèi)的癌癥標(biāo)志基因而言，如果其較之相應(yīng)的癌癥標(biāo)志基因的對(duì)照水平増加了例如10 %，25 %或50 %的話，或増加到超過(guò)1. 1倍，超過(guò)1. 5倍，超過(guò)2. 0 倍，超過(guò)5. 0倍，超過(guò)10倍或者更多，則可認(rèn)為其在生物樣品中的表達(dá)水平是增加的。對(duì)照水平可以與測(cè)試生物樣品同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性) 已知的受試者收集和保存的樣品?；蛘?，對(duì)照水平可以借助統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)通過(guò)分析先前測(cè)定的來(lái)自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的CSTF2基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)ー 步，對(duì)照水平可以是來(lái)自先前測(cè)試過(guò)的細(xì)胞的表達(dá)模式數(shù)據(jù)庫(kù)。而且，根據(jù)本發(fā)明的ー個(gè)方面，可以將生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平與從多個(gè)參考樣品確定的多個(gè)對(duì)照水平比較。優(yōu)選地使用從來(lái)自與源自患者的樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對(duì)照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中CSTF2基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的背景中，從已知非癌性的生物樣品確定的對(duì)照水平稱作“正常對(duì)照水平”。另ー方面，如果對(duì)照水平從癌性生物樣品確定，則稱作“癌性對(duì)照水平”。當(dāng)CSTF2基因的表達(dá)水平相比正常表達(dá)水平有所提高或與癌性對(duì)照水平相似，則受試者可診斷為正罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥。進(jìn)一歩，當(dāng)比較多種癌癥相關(guān)基因的表達(dá)水平時(shí)，樣品與癌性參照之間基因表達(dá)模式的相似性表明受試者正罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥。測(cè)試生物樣品的表達(dá)水平與對(duì)照水平間的差異，可以相對(duì)已知表達(dá)水平不會(huì)隨著細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對(duì)照核酸(例如管家基因)的表達(dá)水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例對(duì)照基因包括，但不僅限干，β -肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl?；蛘?，本發(fā)明提供試劑制備用于診斷癌癥的診斷試劑的用途。在一些實(shí)施方案中，該試劑可選自下組(a)用于檢測(cè)CSTF2基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測(cè)CSTF2蛋白的試劑；和(c)用于檢測(cè)CSTF2蛋白的生物學(xué)活性的試劑。具體地，此類試劑是與CSTF2多核苷酸雜交的寡核苷酸或與CSTF2多肽結(jié)合的抗體。在本發(fā)明中，掲示了 CSTF2不僅是有用的診斷標(biāo)志物，而且還是癌癥療法的合適靶物。因此，靶向CSTF2的癌癥治療可通過(guò)本發(fā)明來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，靶向CSTF2的癌癥治療指阻抑或抑制癌細(xì)胞中的CSTF2活性和/或表達(dá)。任何抗CSTF2劑均可用于靶向CSTF2 的癌癥治療。在本發(fā)明中，抗CSTF2劑包括下述物質(zhì)作為活性組分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它的DNA，和(c)編碼它的載體。因而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供下述方法(i)診斷受試者是否具有要用抗CSTF2劑治療的癌癥，和/或(ii)為靶向CSTF2的癌癥治療選擇受試者，該方法包括下述步驟(a)測(cè)定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中CSTF2基因的表達(dá)水平；(b)將CSTF2基因的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平比較；(c)如果CSTF2的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平相比升高的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并(d)如果在步驟(C)中將該受試者診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進(jìn)行癌癥治療?；蛘?，此類方法包括下述步驟(a)測(cè)定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中CSTF2基因的表達(dá)水平；(b)將CSTF2基因的表達(dá)水平與癌性對(duì)照水平比較；(c)如果CSTF2基因的表達(dá)水平與癌性對(duì)照水平相似或等同的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并(d)如果在步驟(C)中將該受試者診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進(jìn)行癌癥治療。評(píng)價(jià)癌癥預(yù)后的方法本發(fā)明部分涉及下列新發(fā)現(xiàn)，即CSTF2表達(dá)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。因此，本發(fā)明提供確定或評(píng)價(jià)罹患癌癥，尤其是肺癌患者預(yù)后的方法，所述方法檢測(cè)患者生物樣品中的CSTF2表達(dá)水平；將測(cè)得的表達(dá)水平與對(duì)照水平比較；并確定與對(duì)照水平相比升高的表達(dá)水平為不良預(yù)后(不良的存活)的指示。具體地，本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)或確定具有肺癌的受試者的預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟(a)檢測(cè)源自受試者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平；(b)將檢測(cè)到的表達(dá)水平與對(duì)照水平比較；并
(c)基于(b)的比較確定該受試者的預(yù)后。在此，術(shù)語(yǔ)“預(yù)后“指由病例的性質(zhì)與癥狀表明的關(guān)于所述疾病的可能結(jié)果以及從疾病中恢復(fù)的前景。相應(yīng)地，不利的、負(fù)面的、不良的預(yù)后定義為較低的治療后存活期間與存活率。相反，正面的、有利的、或良好的預(yù)后定義為治療后存活期間或存活率提高。術(shù)語(yǔ)“評(píng)價(jià)預(yù)后”指預(yù)測(cè)、預(yù)告與患者癌癥的將來(lái)結(jié)果(例如，惡性，治愈癌癥的可能性、存活率等)，或?qū)⒁欢ǖ臋z測(cè)或測(cè)量與患者癌癥的將來(lái)結(jié)果相聯(lián)系的能力。舉例而言， 確定CSTF2基因經(jīng)時(shí)的表達(dá)水平使預(yù)測(cè)患者結(jié)果(例如，惡性的増加或減少，癌癥等級(jí)的增加或減少，治愈癌癥的可能性、存活率等)成為可能。在本發(fā)明的背景中，短語(yǔ)“評(píng)價(jià)(或確定)預(yù)后”意欲涵蓋癌癥、進(jìn)展、特別是癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散與疾病復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)與可能性分析。這里的評(píng)價(jià)預(yù)后的方法意欲用于臨床以對(duì)關(guān)于治療模式作出決定，所說(shuō)的治療模式包括治療介入、診斷標(biāo)準(zhǔn)例如疾病的分期，以及針對(duì)腫瘤疾病的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的疾病監(jiān)視和監(jiān)測(cè)。本方法所用的源自患者的生物樣品可為任何源自要評(píng)價(jià)的受試者的樣品，只要 CSTF2基因可在樣品中檢測(cè)出來(lái)。所述生物樣品優(yōu)選肺細(xì)胞(從肺獲得的細(xì)胞)。進(jìn)一歩， 所述生物樣品可包括體液例如痰、血液、血清或血漿。另外，所述樣品可為從組織純化的細(xì)胞。生物樣品可在不同的時(shí)點(diǎn)自患者獲取，包括治療前，治療中和/或治療后。例如，自要評(píng)估的受試者獲得的肺癌細(xì)胞是優(yōu)選的生物樣品。根據(jù)本發(fā)明，顯示在源自患者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平越高，治療后病情緩和、恢復(fù)和/或存活的預(yù)后就越為不良，且不良臨床后果的可能性就越高。因此，根據(jù)本方法，用作比較的“對(duì)照水平”可為，例如，在治療后顯示良好或積極的癌癥預(yù)后的個(gè)體或個(gè)體組成的群體中的任何CSTF2基因的表達(dá)水平，在此稱之為“良好預(yù)后對(duì)照水平”。此外，所述“對(duì)照水平”可為，例如，在治療后顯示不良或消極的癌癥預(yù)后的個(gè)體或個(gè)體組成的群體中的任何CSTF2基因的表達(dá)水平，在此稱之為“不良預(yù)后對(duì)照水平”。所述“對(duì)照水平” 是源自自單ー參照群體的単一表達(dá)模式，或者是多種表達(dá)模式。因此，所述對(duì)照水平可基于在其疾病狀態(tài)(良好或不良預(yù)后)已知的癌癥患者或癌癥患者的群體中，在進(jìn)行任何種類治療之前的CSTF2基因的表達(dá)水平來(lái)確定。在本發(fā)明的背景中，癌癥為肺癌。優(yōu)選使用在疾病狀態(tài)已知的患者集合中的CSTF2基因的表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。所述標(biāo)準(zhǔn)值可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法獲得。舉例而言，平均值+/-2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差或平均值+/-3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的范圍可用作標(biāo)準(zhǔn)值。所述對(duì)照水平可以與所測(cè)試的生物樣品同時(shí)確定，這通過(guò)使用先前從已知其疾病狀態(tài)(良好或不良預(yù)后)的患者(對(duì)照或?qū)φ战M)在接受任何種類的治療之前采集并儲(chǔ)藏的樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?，所述對(duì)照水平可通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法基于通過(guò)分析先前從對(duì)照組收集或儲(chǔ)藏的樣品中的CSTF2基因表達(dá)水平來(lái)確定。進(jìn)一歩，所述對(duì)照水平可為來(lái)自先前測(cè)試的細(xì)胞的表達(dá)模式的數(shù)據(jù)庫(kù)。另外，根據(jù)本發(fā)明的ー個(gè)方面，可將生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平與多種對(duì)照水平進(jìn)行比較，所述對(duì)照水平是從多種參照樣品確定的。優(yōu)選使用從與源自患者的生物樣品類似的組織類型所得的參照樣品確定的對(duì)照水平。根據(jù)本發(fā)明，CSTF2基因的表達(dá)水平與良好預(yù)后對(duì)照水平的相似性顯示所述患者較理想的預(yù)后，而相對(duì)良好預(yù)后對(duì)照水平表達(dá)水平的增加顯示較不理想的、較不良的治療后病情緩和、恢復(fù)、存活和/或臨床后果的預(yù)后。另ー方面，相比于不良預(yù)后對(duì)照水平CSTF2 表達(dá)水平的減少顯示患者較理想的預(yù)后，而與不良預(yù)后對(duì)照水平相似的表達(dá)水平顯示較不較理想的、較不良的治療后病情緩和、恢復(fù)、存活和/或臨床后果的預(yù)后。例如，自在治療后顯示較好或較差癌癥預(yù)后的受試者獲得的肺癌細(xì)胞分別是較好或不良預(yù)后對(duì)照水平的優(yōu)選生物樣品。當(dāng)相對(duì)對(duì)照水平表達(dá)水平變化超過(guò)1. 0,1. 5,2. 0,5. 0,10. 0或更多倍吋，生物樣品中的CSTF2基因表達(dá)水平可認(rèn)為是改變了。所試生物樣品與對(duì)照水平間表達(dá)水平的差異可相對(duì)于對(duì)照，例如持家基因，加以標(biāo)準(zhǔn)化。舉例而言，已知其表達(dá)水平在癌性與非癌性細(xì)胞中不變的多核苷酸，包括那些編碼 β -肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶與核糖體蛋白Pl的基因，可用于標(biāo)準(zhǔn)化CSTF2基因表達(dá)水平。表達(dá)水平可通過(guò)利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)在源自患者的生物樣品中檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄物來(lái)確定。所述通過(guò)本方法檢測(cè)的基因轉(zhuǎn)錄物既包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也包括翻譯產(chǎn)物，例如 mRNA與蛋白質(zhì)。舉例而言，CSTF2基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過(guò)使用針對(duì)基因轉(zhuǎn)錄物的CSTF2基因探針進(jìn)行雜交，例如Northern印跡雜交分析來(lái)加以檢測(cè)。所述檢測(cè)可在芯片或陣列上進(jìn)行。對(duì)檢測(cè)CSTF2基因的表達(dá)水平，優(yōu)選使用陣列。作為另ー個(gè)示例，基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法，例如使用CSTF2基因特異性的引物基于逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可用于檢測(cè)(參見實(shí)施例)。 CSTF2基因特異性探針或引物可使用常規(guī)技術(shù)參照CSTF2基因的全序列(SEQ ID NO=D設(shè)計(jì)和制備。舉例而言，在實(shí)施例中使用的引物(SEQ ID NO :3和4)可用于通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，但本方面并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與CSTF2的mRNA雜交?；蛘撸景l(fā)明的評(píng)價(jià)亦可通過(guò)檢測(cè)翻譯產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行。舉例而言，可確定CSTF2蛋白的量。確定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的量的方法包括使用特異性識(shí)別CSTF2蛋白的抗體的免疫測(cè)定方法。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一歩，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、SCFV、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用于檢測(cè)，只要所述片段保留與CSTF2蛋白的結(jié)合能力。制備此類用于檢測(cè)蛋白的抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，本發(fā)明中可以使用任何方法制備這樣的抗體及其等價(jià)物。作為另ー種基于CSTF2基因翻譯產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)該基因的表達(dá)水平的方法，可通過(guò)免疫組織化學(xué)分析利用針對(duì)CSTF2蛋白質(zhì)的抗體觀察其染色的強(qiáng)度。即，觀察到強(qiáng)染色表明 CSTF2的存在量増加，且同時(shí)表明CSTF2基因的高表達(dá)水平。進(jìn)一歩，已知CSTF2蛋白具有細(xì)胞増殖活性。因此，CSTF2基因的表達(dá)水平可使用上述細(xì)胞増殖活性作為指標(biāo)來(lái)確定。舉例而言，在生物樣品存在下制備并培養(yǎng)表達(dá)CSTF2 的細(xì)胞，隨后通過(guò)檢測(cè)増殖速度或測(cè)定細(xì)胞周期或集落形成能力，可確定所述生物樣品的細(xì)胞増殖活性。另外，除CSTF2基因的表達(dá)水平外，亦可確定其它肺癌相關(guān)基因，例如已知在肺癌中有差異表達(dá)的基因，的表達(dá)水平，以提高所述評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。上述其它的肺細(xì)胞相關(guān)基因的實(shí)例包括那些于W02004/031413和W02005/090603中描述的基因。將它們的內(nèi)容以引用方式納入于本文中?；蛘撸鶕?jù)本發(fā)明，除其它測(cè)試結(jié)果外，還可提供用于評(píng)價(jià)受試者預(yù)后的中間結(jié)果。所述中間結(jié)果可協(xié)助醫(yī)生、護(hù)士或其它從業(yè)人員評(píng)價(jià)、確定或估計(jì)受試者的預(yù)后?？膳c本發(fā)明所得中間結(jié)果結(jié)合考慮的其它信息包括受試者的臨床癥狀和身體狀況。換言之，CSTF2基因的表達(dá)水平是用于為罹患肺癌(例如NSCLC)的受試者評(píng)價(jià)、 預(yù)測(cè)或確定預(yù)后的有用預(yù)后標(biāo)志物。因此，本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)預(yù)后標(biāo)志物，為罹患肺癌(包括NSCLC)的受試者評(píng)價(jià)、預(yù)測(cè)或確定預(yù)后的方法，其包括下述步驟a)檢測(cè)或測(cè)定源自受試者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平，并b)將步驟a)中檢測(cè)或測(cè)定到的表達(dá)水平與該受試者的預(yù)后關(guān)聯(lián)起來(lái)。特別地，依照本發(fā)明，與對(duì)照水平相比升高的表達(dá)水平指示不良預(yù)后(較差存活) 的可能性或懷疑。要根據(jù)本方法評(píng)價(jià)癌癥預(yù)后的患者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，包括人、非人靈長(zhǎng)類、小鼠、 大鼠、犬、貓、馬和牛。或者，本發(fā)明提供試劑制備用于評(píng)價(jià)癌癥預(yù)后的試劑的用途。在一些實(shí)施方案中， 該試劑選自下組(a)用于檢測(cè)CSTF2基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測(cè)CSTF2的試劑；和(c)用于檢測(cè)CSTF2蛋白的生物學(xué)活性的試劑。具體地，此類試劑是與CSTF2多核苷酸雜交的寡核苷酸或與CSTF2多肽結(jié)合的抗體。診斷癌癥或評(píng)價(jià)癌癥預(yù)后的試劑盒本發(fā)明提供了診斷癌癥或評(píng)價(jià)癌癥預(yù)后的試劑盒?；蛘?，本發(fā)明還提供用于確定罹患可用本發(fā)明雙鏈分子或編碼它的載體來(lái)治療的癌癥的受試者的試劑盒，其也可用于評(píng)估和/或監(jiān)測(cè)癌癥治療的效果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是肺癌。具體而言，所述試劑盒包含至少ー種在源自患者的生物樣品中檢測(cè)CSTF2基因表達(dá)的物質(zhì)或試劑，所述物質(zhì)可選自下組(a)檢測(cè)CSTF2基因的mRNA的物質(zhì)或試劑；(b)檢測(cè)CSTF2的蛋白質(zhì)的物質(zhì)或試劑；(c)檢測(cè)CSTF2的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的物質(zhì)或試劑。 適于檢測(cè)CSTF2基因的mRNA的物質(zhì)或試劑包括特異性結(jié)合或鑒定CSTF2mRNA的核酸，諸如具有與CSTF2mRNA的一部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對(duì) CSTF2mRNA為特異性的引物與探針?？苫诒绢I(lǐng)域眾所周知的方法制備這類寡核苷酸。如果需要，可將用于檢測(cè)CSTF2mRNA的物質(zhì)或試劑固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于ー種檢測(cè)CSTF2mRNA的物質(zhì)或試劑。 探針或引物可以是特定大小。該大小選自下組至少10個(gè)核苷酸、至少12個(gè)核苷酸、至少15個(gè)核苷酸、至少20個(gè)核苷酸、至少25個(gè)核苷酸、至少30個(gè)核苷酸，而且探針和引物的大小范圍可以為5-10個(gè)核苷酸、10-15個(gè)核苷酸、15-20個(gè)核苷酸、20-25個(gè)核苷酸和 25-30個(gè)核苷酸。
另ー方面，適于檢測(cè)CSTF2蛋白質(zhì)的物質(zhì)或試劑包括針對(duì)CSTF2蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一歩，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、 scFv,Fab,F(ab' )2、Fv等等)均可用作所述物質(zhì)或試劑，只要所述片段保留與CSTF2蛋白的結(jié)合能力。為檢測(cè)蛋白制備此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且在本發(fā)明中可使用任何方法制備上述抗體及其等價(jià)物。進(jìn)一歩，所述抗體可用能產(chǎn)生信號(hào)的分子通過(guò)直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測(cè)抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測(cè)CSTF2蛋白質(zhì)的物質(zhì)或試劑。進(jìn)一歩，所述生物學(xué)活性可通過(guò)，例如，測(cè)量所述生物樣品中由于CSTF2蛋白質(zhì)表達(dá)而導(dǎo)致的細(xì)胞増殖活性來(lái)確定。舉例而言，在源自患者的生物樣品的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后通過(guò)檢測(cè)増殖的速度，或測(cè)量細(xì)胞周期或集落形成能力，可確定所述生物樣品的細(xì)胞增殖活性。如需要，可將用于檢測(cè)CSTF2mRNA的物質(zhì)或試劑固定化在固體基質(zhì)上。另夕卜， 在所述試劑盒中可包括多于ー種檢測(cè)CSTF2蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的物質(zhì)。所述試劑盒可包含多于ー種前述的物質(zhì)或試劑。進(jìn)一歩，所述試劑盒可包括固體基質(zhì)以及用于結(jié)合針對(duì)CSTF2基因的探針或針對(duì)CSTF2蛋白質(zhì)的抗體的物質(zhì)，用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基與容器，陽(yáng)性與陰性對(duì)照物質(zhì)或試劑，以及用于檢測(cè)針對(duì)CSTF2蛋白質(zhì)的抗體的第二抗體。舉例而言，從具有良好預(yù)后或不良預(yù)后的患者獲取的組織樣品可用作有用的對(duì)照物質(zhì)或試劑。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)ー步包括其它從商業(yè)和用戶角度而言期望的材料， 包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使用說(shuō)明的裝箱單(例如，書面的、磁帶、 CD-ROM等等)。這些物質(zhì)或試劑之類的包含在帶有標(biāo)簽的容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)所述物質(zhì)或試劑是針對(duì)CSTF2mRNA的探針時(shí)，所述物質(zhì)或試劑可固定化于固體基質(zhì)諸如多孔條上，以形成至少ー個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)。所述多孔條的測(cè)量或檢測(cè)區(qū)域可包含多個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)都包含核酸(探針)。測(cè)試條亦可包含陰性和/或陽(yáng)性對(duì)照的位點(diǎn)。或者，對(duì)照位點(diǎn)可位干與測(cè)試條不同的條上。任選地，不同的檢測(cè)位點(diǎn)可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)上量較大而在接下來(lái)的位點(diǎn)上量較小。在加入測(cè)試樣品之后，顯示可檢測(cè)信號(hào)的位點(diǎn)的數(shù)量提供了在樣品中存在的CSTF2mRNA量的定量指征。所述檢測(cè)位點(diǎn)可配置為具有任何合適地可檢測(cè)的形狀，通常是橫跨測(cè)試條寬度的條狀或點(diǎn)狀。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)ー步包括陽(yáng)性對(duì)照或CSTF2標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的陽(yáng)性對(duì)照樣品可通過(guò)收集CSTF2陽(yáng)性血液樣品，隨后測(cè)定其CSTF2水平來(lái)制備?；蛘?，可將純化的CSTF2 蛋白或多核苷酸添加到不含CSTF2的血清中以形成所述陽(yáng)性樣品或CSTF2標(biāo)準(zhǔn)品?？狗伟┪镔|(zhì)的篩選在本發(fā)明的背景中，待通過(guò)本篩選方法鑒定的物質(zhì)可以是任何物質(zhì)或包含數(shù)種物質(zhì)的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明篩選方法暴露于細(xì)胞或蛋白的測(cè)試物質(zhì)可以是單種物質(zhì)或多種物質(zhì)的組合。當(dāng)在方法中使用物質(zhì)組合吋，各物質(zhì)可以順次或同時(shí)加以接觸。任何測(cè)試物質(zhì)，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽物質(zhì)、合成微分子物質(zhì)(包括核酸構(gòu)建體，例如反義RNA、siRNA、核酶以及適體等等)以及天然物質(zhì)，均可用于本發(fā)明的篩選方法中。也可使用本領(lǐng)域熟知的很多組合文庫(kù)方法中的任何途徑來(lái)獲得本發(fā)明的測(cè)試物質(zhì)，包括(1)生物文庫(kù)，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(kù)(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3) WSM^P^ (deconvolution)白勺を^；_夕去， (4) “ー珠一物質(zhì)”(“one-bead one-substance")文庫(kù)法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫(kù)法。使用親和色譜選擇的生物文庫(kù)法限于肽文庫(kù)，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或物質(zhì)小分子文庫(kù)(Lam(1997) Anticancer Drug Des. 12 :145-67)。合成分子文庫(kù)方法的例子可在現(xiàn)有技術(shù)中找到(Deffitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 6909-13 ；Erb et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al.， J Med Chem 37 :2678-85,1994 ；Cho et al.，Science 1993,261:1303-5 ；Carell et al.， Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ；Care 11 et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33 2061 ；Gallop et al.，J Med Chem 1994,37 :1233-51)。物質(zhì)文庫(kù)可提供于溶液中(參見 Houghten，Bio/Techniques 1992,13 :412-21)或珠子上(Lam,Nature 1991,354 :82-4)、 芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、細(xì)菌上(美國(guó)專利5，223，409)、孢子上(美國(guó)專利 5，571，698 ;5，403，484 與 5，223，409)、質(zhì)粒上(Cull et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1992,89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Sciencel990, 249 :386-90 ；Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ； Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ；美國(guó)專利申請(qǐng) 2002103360)。通過(guò)本發(fā)明任何篩選方法篩選到的物質(zhì)的一部分結(jié)構(gòu)通過(guò)添加、刪除、和/或置換方式被轉(zhuǎn)換而得到的物質(zhì)，包括在通過(guò)本發(fā)明篩選方法鑒定的物質(zhì)之內(nèi)。此外，當(dāng)所篩選的測(cè)試物質(zhì)是蛋白質(zhì)時(shí)，為了獲得編碼該蛋白的DNA，可以確定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定該編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根據(jù)該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫(kù)，以獲得編碼該蛋白的DNA。對(duì)所得的DNA確認(rèn)其在制備治療或預(yù)防癌癥的候選物測(cè)試物質(zhì)中的有用性。對(duì)本文描述篩選為有用的測(cè)試樣品亦可為特異性結(jié)合CSTF2蛋白或其缺乏原蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性的部分肽的抗體。盡管測(cè)試劑文庫(kù)的構(gòu)建是本領(lǐng)域眾所周知的，在下文中還是進(jìn)一歩提供了鑒定測(cè)試物質(zhì)和構(gòu)建用于本篩選方法的這些測(cè)試物質(zhì)的文庫(kù)的指導(dǎo)。在本發(fā)明中，掲示了阻抑CSTF2的表達(dá)水平和/或生物學(xué)活性導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)的阻抑。因此，當(dāng)某種物質(zhì)阻抑CSTF2的表達(dá)和/或活性時(shí)，該阻抑指示受試者中的潛在治療效果。在本發(fā)明中，潛在治療效果指具有合理預(yù)期的臨床好處。在本發(fā)明中，此類臨床好處包括(a)CSTF2基因表達(dá)的減少，(b)受試者中癌癥的尺寸、患病率(prevalence)、或轉(zhuǎn)移潛力的降低，(c)預(yù)防癌癥發(fā)生，或(d)預(yù)防或緩解癌癥的臨床癥狀。⑴分子建模對(duì)具有目標(biāo)性質(zhì)的物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和/或?qū)STF2的分子結(jié)構(gòu)的知識(shí)為人們構(gòu)建測(cè)試劑文庫(kù)提供了便利。預(yù)篩選適于進(jìn)一步評(píng)估的受試藥劑的方法之一是對(duì)受試藥劑與其靶標(biāo)的相互作用進(jìn)行計(jì)算機(jī)建摸。
計(jì)算機(jī)建模技術(shù)為選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及會(huì)與該分子相互作用的新物質(zhì)的合理設(shè)計(jì)提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于來(lái)源于選定分子的χ-射線晶體分析或NMR成像的數(shù)據(jù)。分子動(dòng)力學(xué)需要カ場(chǎng)數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)圖形系統(tǒng)為預(yù)測(cè)新物質(zhì)如何連接靶分子，以及實(shí)驗(yàn)操作物質(zhì)和靶分子的結(jié)構(gòu)以完善結(jié)合特異性提供了可能。為了預(yù)測(cè)當(dāng)分子和物質(zhì)之ー或二者都發(fā)生細(xì)小改變時(shí)分子-物質(zhì)相互作用是什么樣的，需要分子力學(xué)軟件和計(jì)算密集型計(jì)算機(jī)，它們通常耦聯(lián)著分子設(shè)計(jì)程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅(qū)動(dòng)的界面。上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, ffaltham, Mass。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。利用QUANTA可進(jìn)行分子相互行為的互動(dòng)性構(gòu)建、修飾、可視化和分析。有多篇文獻(xiàn)綜述了與特異蛋白相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)建摸，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ；Ripka, New Scientist 1988,54—8; McKinlay&Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxicioll989, 29 :111-22 ；Perry&Davies,Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ；Lewis&Dean, Proc R Soc Lond 1989,236 :125-40, 141-62 ；以及關(guān)于核酸組分模型受體的 Askew et al.，JAm Chem Soc 1989，111 :1082_90。其它可篩選并圖形描述化學(xué)物質(zhì)的計(jì)算機(jī)程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 白勺 BioDesign, Inc. , Pasadena,しalii· , Allelix, Inc 公ロ]、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司獲取。見例如 DesJarlais et al.，J Med Cheml988，31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993，259 1445—50。一旦鑒定出推定的抑制劑，可使用組合化學(xué)技術(shù)基于鑒定出的推定抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)建任何數(shù)量的變體，如下所述。所得的推定抑制劑，或“測(cè)試物質(zhì)”文庫(kù)，可使用本發(fā)明的方法篩選，以鑒定治療或預(yù)防肺癌的測(cè)試劑。(ii)組合化學(xué)合成測(cè)試物質(zhì)的組合文庫(kù)可以作為合理藥物設(shè)計(jì)程序的一部分來(lái)制備，合理藥物設(shè)計(jì)程序涉及有關(guān)已知抑制劑中存在的核心結(jié)構(gòu)的知識(shí)。這種策略使得文庫(kù)可以保持合理的規(guī)摸，便于進(jìn)行高通量篩選?；蛘?，可通過(guò)簡(jiǎn)單地合成構(gòu)成文庫(kù)的分子家族的所有排列，來(lái)構(gòu)建簡(jiǎn)單的，特別是短的、聚合物性的分子文庫(kù)。后ー種方法的ー個(gè)實(shí)例是由所有長(zhǎng)度為6個(gè)氨基酸組成的肽文庫(kù)。這種肽文庫(kù)包含所有6氨基酸序列排列。這種類型的文庫(kù)稱作線性組合化學(xué)文庫(kù)。組合化學(xué)文庫(kù)的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以通過(guò)化學(xué)或生物合成來(lái)產(chǎn)生。組合化學(xué)文庫(kù)包括，但不僅限干，肽文庫(kù)(見例如美國(guó)專利5，010, 175 ；Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al.，Naturel991，354 :84_6)。也可以使用其它用于產(chǎn)生化學(xué)多祥性文庫(kù)的化學(xué)。這些化學(xué)包括，但不僅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被編碼的肽(例如W093/20242)，隨機(jī)生物寡聚體(例如WO 92/00091)， 苯并ニ氮卓(benzodiaz印ines)(例如美國(guó)專利5，288，514)，diversomer如乙內(nèi)酰脲、苯并ニ氮卓和ニ肽(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多月太(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽類肽模擬物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992, 114 :9217-8)，小化合物文庫(kù)的模擬物有機(jī)合成(analogous organic synthese) (Chen et al. ,J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氨基甲酸鹽(Cho et al. , Sciencel993,261 1303)，和/或月太酰膦酸酯(ρ印tidylphosphonates) (Campbell et al. ,J Org Chem 1994， 59 :658),核酸文庫(kù)(見 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 ± 曾干 Ij ； Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory, New ^rk，USA)，肽核酸文庫(kù)(見例如美國(guó)專利5，539，08 ，抗體文庫(kù)(見例如 Vaughan et al. ,Nature Biotechnology 1996,14(3) :309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文庫(kù)(見例如 Liang et al.，Sciencel996，274 1520-22 ；美國(guó)專利 5，593，853)，和有機(jī)小分子文庫(kù)(見例如苯并ニ氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1 ；6(6) 624-31 ；類異戊ニ烯(isoprenoids)，美國(guó)專利 5，569，588 ；噻唑烷酮(thiazolidinones) 和偏硫雜氮雜環(huán)己烷(metathiazanone)，美國(guó)專利5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)， 美國(guó)專利5，525，735和5，519，134 ；嗎啉代化合物，美國(guó)專利5，506，337 ；苯并ニ氮卓， 5，288，514 ；等)。用于制備組合文庫(kù)的設(shè)備是可商購(gòu)的(見例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多種組合文庫(kù)本身也是商業(yè)可得的(見例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, )。(iii)其它候選物另ー種手段是使用重組細(xì)菌噬菌體來(lái)產(chǎn)生文庫(kù)。使用“噬菌體方夕去” (Scott&Smith，Science 1990,249 :386-90 ；Cwirla et al. ，Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ；Devlin et al.，Science 1990，249 :404-6)，可以構(gòu)建非常大的文庫(kù) (例如106-108個(gè)化學(xué)實(shí)體)。再ー種手段主要使用化學(xué)方法，其實(shí)例包括Geysen方法 (Geysen et al.,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987,102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251:767-73)。Furka 等 (14th International Congress of Biochemistry 1988, Vo丄ume#5, Aostract FR :013 ； Furka, Int J P 印 tide Protein Resl991，37 :487-93) ,Houghten(美國(guó)專利 4，631，211)和 Rutter等(美國(guó)專利5，010，175)記載了產(chǎn)生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動(dòng)劑或拮抗劑加以測(cè)試。適體是由可緊密結(jié)合特定分子靶的核酸構(gòu)成的大分子。Tuerk和 Gold (Science. 249 :505-510(1990))披露了 SELEX (通過(guò)指數(shù)式富集進(jìn)行的配體系統(tǒng)性進(jìn)化)方法來(lái)選擇適體。在SELEX方法中，核酸分子的大型文庫(kù)(例如IO15種不同分子)可用于ジ帝選。CSTF2結(jié)合物質(zhì)的篩選在本發(fā)明中，在肺癌中檢測(cè)出CSTF2基因的過(guò)表達(dá)，而在正常器官中沒有表達(dá)(圖 1與2)。另外，針對(duì)CSTF2基因的siRNA對(duì)CSTF2基因表達(dá)的阻抑誘導(dǎo)對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的阻抑(圖3)。這些結(jié)果指示CSTF2基因在癌細(xì)胞中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此，本發(fā)明提供了使用CSTF2基因、該基因編碼的蛋白，來(lái)篩選結(jié)合CSTF2多肽的物質(zhì)的方法。由于肺癌中CSTF2基因的表達(dá)，與CSTF2多肽結(jié)合的物質(zhì)可望阻抑肺癌細(xì)胞的増殖，并因此對(duì)治療或預(yù)防肺癌有用。因此，本發(fā)明亦提供了使用CSTF2多肽篩選阻抑肺癌細(xì)胞増殖的候選物質(zhì)的方法，以及篩選治療或預(yù)防肺癌的候選物質(zhì)的方法。具體而言，在篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的候選物質(zhì)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟(a)將測(cè)試物質(zhì)與CSTF2多肽或其片段接觸；(b)檢測(cè)所述多肽或其片段與所述測(cè)試物質(zhì)之間的結(jié)合活性；和(c)選擇結(jié)合所述多肽或其片段的測(cè)試物質(zhì)作為用于治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明亦提供了使用CSTF2多肽或其片段來(lái)篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的候選物質(zhì)的方法，其包括以下步驟(a)將測(cè)試物質(zhì)與CSTF2多肽或其功能性片段接觸；(b)檢測(cè)步驟(a)中所述多肽或其片段與所述測(cè)試物質(zhì)之間的結(jié)合活性；并(c)將(b)的結(jié)合活性與所述測(cè)試物質(zhì)的治療效果關(guān)聯(lián)起來(lái)?；蛘撸勒毡景l(fā)明，也可評(píng)估或估計(jì)測(cè)試物質(zhì)或化合物對(duì)治療或預(yù)防癌癥的潛在治療效果。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于評(píng)估或評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)對(duì)治療或預(yù)防癌癥或抑制與CSTF2過(guò)表達(dá)有關(guān)的癌癥的治療效果的方法，該方法包括下述步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與由CSTF2多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測(cè)所述多肽和所述測(cè)試物質(zhì)之間的結(jié)合活性；并(c)將潛在治療效果與測(cè)試物質(zhì)關(guān)聯(lián)起來(lái)，其中當(dāng)該物質(zhì)結(jié)合所述多肽時(shí)顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，可以將治療效果與CSTF2多肽或其功能性片段的結(jié)合活性關(guān)聯(lián)起來(lái)。例如，當(dāng)某種測(cè)試物質(zhì)結(jié)合CSTF2多肽或其功能性片段時(shí)，可將所述測(cè)試物質(zhì)鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質(zhì)?；蛘?，當(dāng)某種測(cè)試物質(zhì)不結(jié)合CSTF2多肽或其功能性片段吋，可將所述測(cè)試藥劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的物質(zhì)。本發(fā)明的方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述。需用于篩選的CSTF2多肽可為重組多肽，或者是源自自然界的蛋白質(zhì)，或其部分肽。與測(cè)試物質(zhì)接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。作為使用CSTF2多肽來(lái)篩選蛋白質(zhì)，例如與CSTF2多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法。此類篩選可通過(guò)，例如，免疫沉淀方法，具體說(shuō)是如下述的方式進(jìn)行。通過(guò)將編碼CSTF2多肽的基因插入外源基因表達(dá)載體，例如pSV2ne0、 pcDNAI、pcDNA3. l、pCAGGS與ρ⑶8，在宿主(例如，動(dòng)物)細(xì)胞等中表達(dá)該基因。為此表達(dá)所用的啟動(dòng)子可為任何通?？墒褂玫膯?dòng)子，包括，例如，SV40早期啟動(dòng)子(Rigby in Williamson(ed. ), Genetic Engineering, vol.3. Academic Press, London, 83-141 (1982))、EF-alpha啟動(dòng)子(Kim et al. ,Gene 91 :217-23 (1990))、CAG啟動(dòng)子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991)), RSV LTR 啟動(dòng)子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))、SR alpha 啟動(dòng)子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 8 :466 (1988))、CMV 立即早期啟動(dòng)子(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987))、SV40 晚期啟動(dòng)子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385-94(1982))、腺病毒晚期啟動(dòng)子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 :946 (1989) )、HSV TK 啟動(dòng)子等等。將所述導(dǎo)入宿主細(xì)胞以表達(dá)外源基因可根據(jù)任何方法實(shí)施，例如電穿孔方法 ((Chu et al. ,Nucleic Acids Res 15 1311- (1987))、磷酸鈣方法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745-52 (1987))、DEAE葡聚糖方法(Lopata et al. ,Nucleic Acids Res 12 :5707-17(1984) ；Sussman and MiIman，Mol Cell Biol4 :1641-3 (1984))、Lipofectin Tj 法(Derijard B. , Cell 76 :1025-37(1994) ；Lamb et al. , Nature Genetics 5 22-30(1993) =Rabindran et al.，Science 259 :230-4(1993))等等。對(duì)于由CSTF2基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)(表位)導(dǎo)入該多肽的N或C端，從而將該多肽表達(dá)為包含該表位的融合蛋白?？梢允褂蒙唐坊谋砦?抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13 :85-90 (1995))。能夠利用其多克隆位點(diǎn)表達(dá)與例如半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光蛋白(GFP)形成的融合蛋白的載體是可商購(gòu)的。另外，還報(bào)道了如下的融合蛋白，其通過(guò)導(dǎo)入僅由數(shù)個(gè)到十二個(gè)(a dozen)氨基酸構(gòu)成的小型表位加以制備，使融合不會(huì)改變CSTF2多肽的性質(zhì)?？梢允褂美缍嘟M氨酸(His-標(biāo)簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標(biāo)簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)簽)、E-標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等表位，和識(shí)別它們的單克隆抗體作為篩選與CSTF2多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13 :85-90(1995))在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細(xì)胞裂解物中而形成免疫復(fù)合體。免疫復(fù)合體由CSTF2多肽、包含與該多肽結(jié)合的能力的多肽、和抗體組成。除了使用針對(duì)上述表位的抗體之外，還可以使用針對(duì)CSTF2多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀，這樣的抗體可以如上文所述制備。免疫復(fù)合體可以被沉淀，例如當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體吋，可以通過(guò)蛋白A s印harose或蛋白Gs印harose將其沉淀。如果將由CSTF2基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結(jié)合這些表位的物質(zhì)，例如谷胱甘肽-sepharosMB，按照與使用針對(duì)CSTF2多肽的抗體的相同的方式來(lái)形成免疫復(fù)合體?？勺裱蚋鶕?jù)，例如，文獻(xiàn)中的方法來(lái)實(shí)施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New YorK(1988))。普遍使用SDS-PAGE分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠，可以利用結(jié)合的蛋白的分子量來(lái)分析該蛋白。由干與CSTF2多肽結(jié)合的蛋白難以通過(guò)考馬斯蘭染色或銀染色等普通染色方法檢測(cè)到，可以通過(guò)如下的方法提高蛋白的檢測(cè)靈敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白，并檢測(cè)該蛋白。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r(shí)，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并測(cè)定其序列。作為利用CSTF2多肽來(lái)篩選結(jié)合該多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印跡分析法(Skolnik et al.，Cell 65:83-90(1991))。具體地，與 CSTF2 多肽結(jié)合的蛋白可以通過(guò)如下方法獲得，從預(yù)期表達(dá)結(jié)合CSTF2多肽的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)細(xì)胞 (例如 LC176、LC319、A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H522、PC3、PC9、PC14、SK-LU-1、EBC-1、 RERF-LC-AI, SK-MES-U SW900與SW1573)利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA文庫(kù)，在 LB瓊脂糖上表達(dá)蛋白，將表達(dá)出的蛋白固定在濾膜上，使純化并且標(biāo)記的CSTF2多肽與上述濾膜反應(yīng)，并依照標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)表達(dá)與CSTF2多肽結(jié)合的蛋白的噬菌斑。本發(fā)明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結(jié)合，或者利用特異結(jié)合CSTF2多肽或與CSTF2多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗體，來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法。或者，在本發(fā)明篩選方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻(xiàn)見“Dalton and Treisman，Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統(tǒng)中，使本發(fā)明的多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。從預(yù)期表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，使該文庫(kù)在被表達(dá)時(shí)與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后，將cDNA文庫(kù)導(dǎo)入到上述酵母細(xì)胞中，并從檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆(當(dāng)酵母細(xì)胞中表達(dá)出可與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白時(shí)，兩者的結(jié)合激活報(bào)告基因，使陽(yáng)性克隆可檢測(cè))分離源自該文庫(kù)的cDNA。通過(guò)將上面分離的cDNA導(dǎo)入到大腸桿菌中并表達(dá)該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報(bào)告基因，除了 HIS3基因之外，還可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可以用親和色譜來(lái)篩選與CSTF2基因編碼的多肽結(jié)合的物質(zhì)。例如，可以把本發(fā)明多肽固定在親和柱的載體上，而將含有能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的蛋白的測(cè)試物質(zhì)施加到該柱上。這里的測(cè)試物質(zhì)可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。在加載測(cè)試物質(zhì)之后，沖洗柱子，從而可以制備得到結(jié)合于本發(fā)明多肽的物質(zhì)。當(dāng)測(cè)試物質(zhì)是蛋白質(zhì)時(shí)，對(duì)所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行分析，根據(jù)該序列合成寡DNA，并用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫(kù)， 從而獲得編碼該蛋白的DNA。利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以在本發(fā)明中用作檢測(cè)或定量結(jié)合物質(zhì)的裝置。當(dāng)使用這種生物傳感器吋，可以僅使用微量并且沒有標(biāo)記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等離子體共振信號(hào)的形式對(duì)本發(fā)明多肽與測(cè)試物質(zhì)間的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的觀察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，人們就有可能對(duì)本發(fā)明多肽與測(cè)試物質(zhì)間的結(jié)合進(jìn)行評(píng)估。用于篩選當(dāng)固定的CSTF2多肽暴露于合成化學(xué)物質(zhì)或天然物質(zhì)文庫(kù)或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫(kù)時(shí)發(fā)生結(jié)合的分子的方法，以及使用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量篩選方法 (ffrighton et al. , Science 273 :458-64(1996) ；Verdine, Nature 384 :11-13(1996)； Hogan, Nature 384 :17-9 (1996))，以不僅分離與CSTF2蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，而且分離與 CSTF2蛋白結(jié)合的物質(zhì)(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。除了 CSTF2多肽之外，該多肽的片段也可用于本發(fā)明的篩選，只要其保留天然存在CSTF2多肽的至少ー種生物學(xué)活性即可。所述多肽或其片段可進(jìn)ー步連接其他物質(zhì)，只要該多肽及片段保留其至少ー種生物學(xué)活性即可?？衫玫奈镔|(zhì)包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙酰基、天然和合成聚合物等?？蛇M(jìn)行這些類型的修飾以賦予該多肽及片段別的功能或使其穩(wěn)定。用于本發(fā)明方法的多肽或片段可作為天然存在的蛋白質(zhì)通過(guò)常規(guī)純化方法從自然界獲得，或基于所選擇的氨基酸序列通過(guò)化學(xué)合成獲得。例如，可用于合成的常規(guī)肽合成法包括
1)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；3)Peptide Synthesis ( H ), Maruzen Co. ，1975 ；4)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( Hip·), Maruzen Co. , 1985 ；5) Development of Pharmaceuticals (果 ニ 卷)(日語(yǔ))，Vol. 14 (peptide synthesis;, hirokawa,1991 ；6)W099/67288 ；和7) Barany G. &Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2,"Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York，1980，100—118。或者，可通過(guò)用于產(chǎn)生多肽的任何已知的基因工程方法來(lái)獲得該蛋白質(zhì)(例如 Morrison J.，J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark—Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology (編輯Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，首先制備以可表達(dá)形式(例如位于包含啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列的下游)包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸的適合的載體，然后轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞，接著培養(yǎng)宿主細(xì)胞以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。更具體的說(shuō)，通過(guò)將編碼CSTF2 多肽的基因插入用于表達(dá)外來(lái)基因的載體諸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3. 1、pCAGGS或 PCD8，在宿主(例如動(dòng)物)細(xì)胞等中表達(dá)該基因。啟動(dòng)子可用于表達(dá)。可使用任何常用的啟動(dòng)子，包括例如 SV40 早期啟動(dòng)子(Rigby in Williamson(編)，Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982，83-141)、EF_ α 啟動(dòng)子(Kim et al. ,Gene 1990,91 217-23)、CAG啟動(dòng)子(Niwa et al. ,Gene 1991，108 :193)、RSV LTR啟動(dòng)子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 :684-704)、SRα 啟動(dòng)子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 1988， 8 :466)、CMV 立即早期啟動(dòng)子(Seed et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1987,84:3365-9)、 SV40 晚期啟動(dòng)子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982，1 :385-94)、腺病毒晚期啟動(dòng)子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 1989，9 :946)、HSV TK 啟動(dòng)子等?？筛鶕?jù)任何方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以表達(dá)CSTF2基因，例如電穿孔法(Chu et al.，NucleicAcids Res 1987，15 :1311-26)、磷酸鈣法(Chen et al.，Mol Cell Biol 1987，7 :2745-52)、DEAE 右 Mlliffe (Lopata et al. ， Nucleic Acids Res 1984,12 :5707-17 ；Sussman et al. ， Mol Cell Biol 1985，4 1641-3)、脂轉(zhuǎn)染法(Deri jard B,Cell 1994,7 :1025-37 ；Lamb et al.， Nature Genetics 1993,5 :22-30 ；Rabindran et al.，Science 1993，259 :230-4)等。還可采用體外翻譯系統(tǒng)在體外產(chǎn)生CSTF2蛋白。要與測(cè)試物質(zhì)接觸的CSTF2多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)或與其他多肽融合的融合蛋白。在本發(fā)明中，掲示了阻抑CSTF2基因表達(dá)降低細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，通過(guò)篩選結(jié)合 CSTF2多肽的候選物質(zhì)，可鑒定出可用于治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。這些候選物質(zhì)或藥劑可通過(guò)二次和/或更進(jìn)ー步篩選來(lái)評(píng)估治療或預(yù)防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療性物質(zhì)。阻抑CSTF2生物學(xué)活性的物質(zhì)的篩選本發(fā)明提供了篩選可阻抑癌細(xì)胞増殖的物質(zhì)的方法，以及篩選用于治療或預(yù)防癌癥，包括肺癌的物質(zhì)的方法。因此，本發(fā)明提供了使用由CSTF2基因編碼的多肽來(lái)篩選治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)的方法，其包括下列步驟
(a)將測(cè)試物質(zhì)與CSTF2多肽接觸；(b)檢測(cè)步驟(a)所述多肽的生物學(xué)活性；并(c)選擇較之測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)CSTF2多肽的生物學(xué)活性，阻抑該多肽的生物學(xué)活性的測(cè)試物質(zhì)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明亦提供了使用由CSTF2基因編碼的多肽篩選用于治療或預(yù)防癌癥或者用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)的方法，其包括以下步驟(a)將測(cè)試物質(zhì)與CSTF2多肽接觸；并(b)檢測(cè)步驟(a)的所述多肽的生物學(xué)活性；并(c)將(b)的生物學(xué)活性與所述測(cè)試物質(zhì)的治療效果關(guān)聯(lián)起來(lái)?；蛘撸谝恍?shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于評(píng)估或評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)治療或預(yù)防癌癥或抑制與CSTF2過(guò)表達(dá)有關(guān)的癌癥的治療效果的方法，該方法包括以下步驟(a)將測(cè)試物質(zhì)與由CSTF2基因的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測(cè)步驟(a)所述多肽的生物學(xué)活性；并(c)將潛在治療效果與測(cè)試物質(zhì)關(guān)聯(lián)起來(lái)，其中當(dāng)較之測(cè)試物質(zhì)不存在下檢測(cè)到的由CSTF2基因的多核苷酸編碼的多肽的生物學(xué)活性，該物質(zhì)阻抑所述多肽的生物學(xué)活性時(shí)顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，可以將治療效果與CSTF2多肽的生物學(xué)活性關(guān)聯(lián)起來(lái)。例如，當(dāng)與某種物質(zhì)不存在下檢測(cè)到的水平相比該測(cè)試物質(zhì)阻抑或抑制CSTF2多肽的生物學(xué)活性吋，可將所述測(cè)試物質(zhì)鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質(zhì)。或者，當(dāng)與某種測(cè)試物質(zhì)不存在下檢測(cè)到的水平相比該測(cè)試藥劑或化合物不阻抑或抑制CSTF2多肽的生物學(xué)活性吋，可將所述測(cè)試物質(zhì)鑒定為沒有顯著治療效果的物質(zhì)。本發(fā)明所述方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述。任何CSTF2多肽均可用于篩選，只要它們包含CSTF2蛋白的生物學(xué)活性即可。這樣的生物學(xué)活性包括CSTF2蛋白的細(xì)胞増殖活性、RNA結(jié)合活性、mRNA切割活性和mRNA聚腺苷酸化活性。舉例而言，可使用CSTF2蛋白，亦可使用與CSTF2蛋白功能上等價(jià)的多肽。 上述多肽可由細(xì)胞內(nèi)源或外源地表達(dá)。通過(guò)本篩選分離的物質(zhì)是CSTF2基因編碼的多肽的拮抗劑的候選者。術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指通過(guò)結(jié)合多肽而抑制多肽功能的分子。該術(shù)語(yǔ)還指可降低或抑制編碼CSTF2的基因的表達(dá)的分子。而且，通過(guò)本篩選分離的物質(zhì)是如下物質(zhì)的候選物，所述物質(zhì)抑制CSTF2 多肽與分子(包括DNA、RNA和蛋白)的體內(nèi)相互作用。當(dāng)本方法中要檢測(cè)的生物學(xué)活性是細(xì)胞増殖吋，可以通過(guò)例如如下方法進(jìn)行檢測(cè)制備表達(dá)CSTF2多肽的細(xì)胞，在測(cè)試物質(zhì)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，確定細(xì)胞增殖速度，測(cè)量細(xì)胞周期等，以及通過(guò)測(cè)量存活細(xì)胞或集落形成能力，例如圖3或4所示。選擇降低表達(dá) CSTF2的細(xì)胞的増殖速度的物質(zhì)作為治療或預(yù)防癌癥，包括肺癌的候選物質(zhì)。在本發(fā)明中，掲示了阻抑CSTF2基因表達(dá)降低細(xì)胞生長(zhǎng)。如此，通過(guò)篩選降低 CSTF2多肽生物學(xué)活性的候選物質(zhì)，可鑒定出可用于治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。這些候選物質(zhì)治療或預(yù)防癌癥的潛力可通過(guò)二次和/或更進(jìn)ー步篩選來(lái)評(píng)估以鑒定用于癌癥的治療性物質(zhì)。更具體而言，該方法包括以下步驟
(a)使測(cè)試物質(zhì)與過(guò)表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞接觸；(b)測(cè)量細(xì)胞增殖活性；并(c)選擇與測(cè)試物質(zhì)不存在下的細(xì)胞增殖活性相比降低細(xì)胞增殖活性的測(cè)試物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括以下步驟(d)選擇對(duì)很少或不表達(dá)CSTF2的細(xì)胞沒有影響的測(cè)試物質(zhì)。“阻抑生物學(xué)活性”在此定義為較之不存在所述物質(zhì)時(shí)，對(duì)CSTF2生物學(xué)活性的優(yōu)選至少10 %的阻抑，更優(yōu)選至少25 %、50 %或75 %的阻抑，最優(yōu)選至少90 %的阻抑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用不表達(dá)CSTF2多肽的對(duì)照細(xì)胞。因而，本發(fā)明還提供了使用CSTF2多肽或其片段來(lái)篩選用于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的候選物質(zhì)或用于治療或預(yù)防CSTF2相關(guān)疾病的候選物質(zhì)的方法，包括下列步驟(a)在測(cè)試物質(zhì)存在下培養(yǎng)表達(dá)CSTF2多肽或其功能性片段的細(xì)胞和不表達(dá)CSTF2多肽或其功能性片段的對(duì)照細(xì)胞；(b)檢測(cè)表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的生物學(xué)活性；并(c)選擇與對(duì)照細(xì)胞中及所述測(cè)試物質(zhì)不存在下檢出的增殖相比抑制表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞中的生物學(xué)活性的測(cè)試物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可使用RNA結(jié)合活性、mRNA切割活性或mRNA聚腺苷酸化活性作為要在本發(fā)明的篩選方法中檢測(cè)的CSTF2多肽生物學(xué)活性。用于檢測(cè)這些活性的方法是本領(lǐng)域公知的。當(dāng)在篩選中檢測(cè)這些活性中的任一種時(shí)，可優(yōu)選使用含有CSTF2多肽之RNA識(shí)別基序的多肽作為CSTF2多肽的功能等同物。例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO :2的CSTF2多肽的RNA識(shí)別基序是由SEQ ID NO 2的氨基酸17至90組成的區(qū)域。改變CSTF2表達(dá)的物質(zhì)的篩選本發(fā)明提供了篩選抑制CSTF2基因表達(dá)的物質(zhì)的方法。抑制CSTF2基因表達(dá)的物質(zhì)可望能夠阻抑肺癌細(xì)胞增殖，并因此對(duì)治療或預(yù)防肺癌有用。因此，本發(fā)明亦提供了篩選阻抑肺癌細(xì)胞增殖的候選物質(zhì)的方法，以及篩選治療或預(yù)防肺癌的候選物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的背景中，上述篩選可包括，例如，下列步驟(a)將測(cè)試物質(zhì)與表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞接觸；(b)檢測(cè)CSTF2基因的表達(dá)水平；并(c)選擇與在測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)檢測(cè)到的表達(dá)水平相比降低CSTF2基因表達(dá)水平的測(cè)試物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明亦提供了篩選阻抑癌細(xì)胞增殖的候選物質(zhì)的方法和篩選用于治療或預(yù)防CSTF2相關(guān)疾病的候選物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的背景中，此類篩選可包括例如以下步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞接觸；(b)檢測(cè)CSTF2基因表達(dá)水平；并(c)將(b)的表達(dá)水平與所述測(cè)試物質(zhì)的治療效果關(guān)聯(lián)起來(lái)。或者，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種用于評(píng)估或評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)治療或預(yù)防癌癥或抑制與CSTF2過(guò)表達(dá)有關(guān)的癌癥的治療效果的方法，該方法包括以下步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與表達(dá)CSTF2的細(xì)胞接觸；
(b)將潛在治療效果與測(cè)試物質(zhì)關(guān)聯(lián)起來(lái)，其中當(dāng)測(cè)試物質(zhì)與對(duì)照相比降低CSTF2的表達(dá)水平時(shí)顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，治療效果可以與CSTF2基因表達(dá)水平關(guān)聯(lián)起來(lái)。例如，當(dāng)與某種測(cè)試物質(zhì)不存在下檢測(cè)到的水平相比該測(cè)試物質(zhì)降低CSTF2基因的表達(dá)水平時(shí)，可將所述測(cè)試物質(zhì)鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質(zhì)。或者，當(dāng)與某種測(cè)試物質(zhì)不存在下檢測(cè)到的水平相比該測(cè)試物質(zhì)不降低CSTF2基因表達(dá)水平時(shí)，可將所述測(cè)試物質(zhì)鑒定為沒有顯著治療效果的物質(zhì)。下面將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的方法。表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞包括，例如，自肺癌建立的細(xì)胞系；這樣的細(xì)胞可用于上述本發(fā)明的篩選(例如 A427，A549, LC319, PC14, PC3, PC9, NCI-H1373，NCI-H1781，NCI-H358，NCI-H226, NCI-H520, NCI-H1703，NCI-H2170，EBC-I, RERF-LC-AI, LXl，DMSl14，DMS273,SBC-3, SBC-5, NCI-H196, NCI-H446，SK-MES-I, LU61)?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如，RT-PCR, Northern印跡分析、Western印跡分析、免疫染色與流式細(xì)胞分析來(lái)估計(jì)表達(dá)水平。在此定義的“降低表達(dá)水平”優(yōu)選為較之在所述物質(zhì)不存在時(shí)的表達(dá)水平，至少使CSTF2基因表達(dá)水平降低至少10%，更優(yōu)選降低至少25%、50%或75%，最優(yōu)選降低95%的水平。本文中的物質(zhì)包括化學(xué)物質(zhì)、雙鏈核苷酸等等。在前面描述了雙鏈核苷酸的制備。在篩選方法中，可選擇降低CSTF2基因表達(dá)水平的物質(zhì)作為用來(lái)治療或預(yù)防肺癌的候選物質(zhì)。在本發(fā)明中，揭示了阻抑CSTF2基因表達(dá)降低細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，通過(guò)篩選降低CSTF2基因表達(dá)水平的物質(zhì)，可鑒定出可用于治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。這些候選物質(zhì)可通過(guò)二次和/或更進(jìn)一步篩選來(lái)評(píng)估治療或預(yù)防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療性物質(zhì)?；蛘撸景l(fā)明的所述篩選方法可包括下列步驟(a)將測(cè)試物質(zhì)與導(dǎo)入了包含CSTF2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域控制下表達(dá)的報(bào)道基因的載體的細(xì)胞接觸；(b)測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性；并(c)選擇降低報(bào)道基因表達(dá)水平或活性的測(cè)試物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明亦提供了篩選用于阻抑癌細(xì)胞增殖的候選物質(zhì)的方法和篩選用于治療或預(yù)防CSTF2相關(guān)疾病的候選物質(zhì)的方法。依照另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括以下步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含CSTF2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)道基因；(b)檢測(cè)所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性；并(c)將(b)的表達(dá)水平與測(cè)試物質(zhì)的治療效果關(guān)聯(lián)起來(lái)?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種用于評(píng)估或評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)治療或預(yù)防癌癥或抑制與CSTF2過(guò)表達(dá)有關(guān)的癌癥的治療效果的方法，該方法包括以下步驟a)使測(cè)試物質(zhì)與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含CSTF2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)道基因b)測(cè)量所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性；并
c)將潛在治療效果與測(cè)試物質(zhì)關(guān)聯(lián)起來(lái)，其中當(dāng)測(cè)試物質(zhì)降低所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性時(shí)顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，治療效果可以與所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性關(guān)聯(lián)起來(lái)。例如，當(dāng)與某種測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)檢測(cè)到的水平相比該物質(zhì)降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性時(shí)，可將所述測(cè)試物質(zhì)鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質(zhì)。或者，當(dāng)與某種測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)檢測(cè)到的水平相比該物質(zhì)不降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性時(shí)，可將所述測(cè)試物質(zhì)鑒定為沒有顯著治療效果的物質(zhì)。合適的報(bào)道基因和宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域是眾所周知的。舉例而言，報(bào)道基因?yàn)槲灩馑孛浮⒕G色熒光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)紅色熒光蛋白(DsRed)、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、Laz與β -葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶幻，而宿主細(xì)胞為C0S7、HEK293、HeLa等。所述篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體可通過(guò)將報(bào)道基因序列與CSTF2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來(lái)制備。本文所述的CSTF2轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域是從起始密碼子至至少500bp上游的區(qū)域，優(yōu)選1，OOObp,更優(yōu)選5000或10，OOObp上游。含有所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的核苷酸片段可從基因組文庫(kù)中分離出來(lái)，或可通過(guò)PCR擴(kuò)增。所述篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體可通過(guò)將報(bào)道基因序列與這些基因中任一的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來(lái)制備。鑒別轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的方法，以及其測(cè)定法規(guī)程都是眾所周知的(Molecular Cloning，第三版，第 17 章，2001，Cold Springs HarborLaboratory Press)。用含有報(bào)道構(gòu)建體的載體感染宿主細(xì)胞，并用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)或活性(例如，使用照度計(jì)(luminometer)、吸收光譜儀、流式細(xì)胞儀等等)。在此定義的“降低表達(dá)或活性”為較之在所述物質(zhì)不存在時(shí)，報(bào)道基因的表達(dá)或活性優(yōu)選地被降低至少10 %，更優(yōu)選地，降低25 %、50 %或75 %，最優(yōu)選地，降低至少95 %。在本發(fā)明中，揭示了阻抑CSTF2基因表達(dá)降低細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，通過(guò)篩選降低報(bào)道基因表達(dá)或活性的候選物質(zhì)，可鑒定出有潛力治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。這些候選物質(zhì)可通過(guò)二次和/或更進(jìn)一步篩選來(lái)評(píng)估治療或預(yù)防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療性物質(zhì)。本發(fā)明的各方面在下述實(shí)施例中加以描述，它們并無(wú)意對(duì)權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍進(jìn)行限定。除非另行定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的意義相同。下面描述了合適的方法和材料，雖然與在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明。本發(fā)明將于下列實(shí)施例中進(jìn)一步加以描述，其并不對(duì)權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍進(jìn)行限定。
實(shí)施例材料和方法細(xì)胞系和組織樣品。此項(xiàng)研究中使用的15種人肺癌細(xì)胞系包括5種腺癌(NCI-H1781、NCI-H1373、LC319、A549、禾口 PC_14)、5 種鱗狀細(xì)胞癌(SK—MES—1、NCI—H520、NCI—H1703、NCI—H2170、和LU61)、1種大細(xì)胞癌(LXl)、和4種小細(xì)胞肺癌(SBC-3、SBC-5、DMS114、和DMS273)。所有細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FCS的適宜培養(yǎng)基中以單層培養(yǎng)并在含5% C02的增濕空氣中于37°C維持。用作正常對(duì)照的人小氣道上皮細(xì)胞(SAEC)在經(jīng)過(guò)優(yōu)化的培養(yǎng)基(CambrexBioscience, Inc)中培養(yǎng)。早前在知情同意下，從在腫瘤切除之前未經(jīng)過(guò)抗癌治療的患者獲得原發(fā)性NSCLC組織樣品及其臨近切除邊緣的對(duì)應(yīng)正常組織(Kikuchi T, Daigo Y，Katagiri T, et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, etal.Int J Oncol 2006；29 :567-75, Kato T, Daigo Y,Hayama S, et al.Cancer Res 2005 ；65 =5638-46)。對(duì)所有腫瘤基于國(guó)際癌癥聯(lián)合會(huì)的病理性腫瘤_淋巴結(jié)_轉(zhuǎn)移分類(表1 ；Sobin L, Wittekind CH. TNM classification of malignant tumors. 6th ed. New York Wiley-Liss ；2002)來(lái)分期。用于組織微陣列上免疫染色的福爾馬林固定的原發(fā)性肺腫瘤和臨近正常肺組織樣品是從在Mitama癌癥中心接受手術(shù)的327名患者(196例腺癌、98例鱗狀細(xì)胞癌、23例大細(xì)胞癌、和10例腺鱗狀癌；99名女性和2 名男性患者；年齡中值64. 7歲，范圍四-85歲)獲得的。這些接受其原發(fā)性癌癥切除的患者沒有接受任何術(shù)前治療，而且他們中只有具有陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者在其手術(shù)后接受了基于鉬的輔助化療治療。此項(xiàng)研究和所有所述臨床材料的使用均得到了各個(gè)科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。[表 1]NSCLC組織中的CSTF2陽(yáng)性與患者的特征之間的關(guān)聯(lián)(n = 327)ADC，腺癌非ADC，鱗狀細(xì)胞癌加大細(xì)胞癌及腺鱗狀細(xì)胞癌*Ρ < 0. 05 (Fisher 氏確然檢驗(yàn))半定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR。使用隨機(jī)弓I 物(Roche Diagnostics)禾口 Superscript II (Invitrogen) 來(lái)自每份樣品的總共3微克mRNA等份試樣逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。半定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)用下述各組對(duì)人CSTF2(基因登錄號(hào)NM_001325)特異性的合成引物或用作為內(nèi)部對(duì)照的 β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)特異性引物進(jìn)行CSTF2，5，-GTCATGCAGGGAACAGGAAT-3，(SEQID NO 3)禾口 5 ‘ -TGAGTCATTCAAGGGTTAGGATG-3‘ (SEQ ID NO 4) ；ACTB,5，-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ ID NO 5)和 5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQID NO :6)。優(yōu)化PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)以確保產(chǎn)物強(qiáng)度在擴(kuò)增的線性期內(nèi)。Northern 印跡分析。將涵蓋23種組織的人多組織印跡(BD Bioscience)與CSTF2的32P標(biāo)記的 521-bp PCR 產(chǎn)物(其使用引物 5，-CGAGGCTTGTTAGGAGATGC-3，(SEQ ID NO 7)和5，-CCCCCATGTTAAGGACTG-3’ (SEQ ID NO 8)制備成探針)雜交。預(yù)雜交、雜交、和清洗遵循制造商的推薦進(jìn)行。將印跡于_80°C用增強(qiáng)屏放射自顯影14天。Western 印跡。將腫瘤細(xì)胞在裂解緩沖液中裂解；50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0), 150mmol/LNaCl，0. 5% NP40，0. 5%脫氧膽酸鈉，和蛋白酶抑制劑混合物組III(Calbiochem)。通過(guò)Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒來(lái)測(cè)定每份裂解物的蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。每份裂解物取10微克在7. 5%至12%變性聚丙烯酰胺凝膠(帶3%聚丙烯酰胺積層凝膠)上解析并電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(GE Healthcare Biosciences)上。用TBST(含Tween20的Tris緩沖鹽水)中的5%無(wú)脂奶粉封閉后，將膜與家兔多克隆抗體一起于室溫溫育1小時(shí)。商品化家兔多克隆抗CSTF2抗體購(gòu)自ATLAS公司，而且通過(guò)使用肺癌細(xì)胞系的裂解物的Western印跡分析，探查為對(duì)人CSTF2特異性的。免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)與綴合有辣根過(guò)氧化物酶的二抗(GE Healthcare Bio-sciences) 一起于室溫溫育1小時(shí)。用TBST清洗后，反應(yīng)物使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(GE Healthcare Bio-sciences)顯色。免疫熒光分析。培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS (_)清洗兩次，在4%甲醛溶液中于4°C固定60分鐘，并通過(guò)用含有0. 1% Triton X-100的PBS (-)處理5分鐘使得可透。細(xì)胞用CASBlock(Zymed)覆蓋10分鐘以封閉非特異性結(jié)合，之后進(jìn)行一抗反應(yīng)。然后，將細(xì)胞與針對(duì)人CSTF2的抗體或帶c-myc標(biāo)簽的蛋白質(zhì)一起溫育。免疫組織化學(xué)和組織微陣列。為了在福爾馬林固定的且石蠟塊中包埋的臨床肺癌樣品中調(diào)查CSTF2蛋白的臨床病理學(xué)意義，對(duì)切片使用Envision+試劑盒/辣根過(guò)氧化物酶(DakoCytomation)以下述方式染色。為了抗原修復(fù)，將載玻片在靶物修復(fù)溶液PH Q(DakoCytomation)中浸泡并在高壓滅菌鍋中于108°C煮沸15分鐘。封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶和蛋白質(zhì)之后，每張載玻片添加家兔多克隆抗人CSTF2抗體(0. 06微克/ml ；ATLAS)，并將切片與作為二抗的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗家兔 IgG[Histofine Simple Stain MAX PO(G)，Nichirei] 一起溫育。添加底物-色原體，并將標(biāo)本用蘇木精復(fù)染色。用327份福爾馬林固定的原發(fā)性NSCLC構(gòu)建腫瘤組織微陣列；這些原發(fā)性NSCLC由單一機(jī)構(gòu)(請(qǐng)見上文)按照相同的切除后收集、固定、和保存組織的規(guī)程獲取(Chin S F，Daigo Y, Huang HE, et al. Mol Pathol 2003 ；56 :275-9, Callagy G, Cattaneo Ε, DaigoY, et al. Diagn Mol Pathol 2003 ；12 :27-34, Callagy G, Pharoah P, Chin SF, et al. JPathol 2005 ；205 :388-96)。考慮到各個(gè)腫瘤的組織學(xué)異質(zhì)性，基于與載玻片上對(duì)應(yīng)H&E染色切片的目測(cè)比對(duì)來(lái)選擇采樣的組織區(qū)域。用組織微陣列儀(Beecher Instruments)將取自一個(gè)供體腫瘤塊的3個(gè)、4個(gè)、或5個(gè)組織核心(直徑，0. 6mm ；深度，3_4mm)放置入受體石蠟塊中。自每個(gè)病例沖孔取1個(gè)正常組織核心，并將所得微陣列塊的5微米切片用于免疫組織化學(xué)分析。由3名獨(dú)立的調(diào)查人員在事先不知道臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)的條件下半定量地評(píng)估CSTF2陽(yáng)性。因?yàn)槊總€(gè)腫瘤組織核心內(nèi)的染色強(qiáng)度大多是均勻的，所以使用下述標(biāo)準(zhǔn)半定量評(píng)估CSTF2染色強(qiáng)度強(qiáng)陽(yáng)性(得分2+)，在> 50%的腫瘤細(xì)胞中深褐色染色，使得細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)完全模糊；弱陽(yáng)性(1+)，腫瘤細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中可察覺任何較低程度的褐色染色；無(wú)(得分0)，腫瘤細(xì)胞中沒有可察覺的染色。只有在調(diào)查人員獨(dú)立地將它們定義為強(qiáng)陽(yáng)性的情況下，才接受病例為強(qiáng)陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析使用MatView統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行。使用Fisher確然檢驗(yàn)評(píng)估強(qiáng)CSTF2免疫反應(yīng)性與臨床病理學(xué)變量諸如年齡、性別、病理性腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移階段、和組織學(xué)類型的關(guān)聯(lián)。計(jì)算自手術(shù)之日起至NSCLC相關(guān)死亡時(shí)或至最后一次隨訪觀察時(shí)止的數(shù)據(jù)腫瘤特異性存活曲線。為每個(gè)有關(guān)變量和為CSTF2表達(dá)計(jì)算Kaplan-Meier曲線；使用時(shí)序檢驗(yàn)分析患者亞組間存活時(shí)間的差異。用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單變量和多變量分析以確定臨床病理變量和癌癥相關(guān)死亡之間的關(guān)聯(lián)。首先，分析死亡和可能的預(yù)后因素包括年齡、性別、組織學(xué)、PT分類、和pN分類之間的關(guān)聯(lián)，一次考慮一個(gè)因素。其次，以反向(逐步)程序應(yīng)用多變量分析，其總是迫使強(qiáng)CSTF2表達(dá)以及任何滿足進(jìn)入水平P < 0. 05的變量一起進(jìn)入模型。隨著該模型繼續(xù)添加因素，獨(dú)立因素沒有超過(guò)退出水平P < 0. 05。RNA干擾測(cè)定法。為了評(píng)價(jià)CSTF2在肺和食管癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，使用針對(duì)靶基因的小干擾RNA (siRNA)雙鏈體(SIGMA)。用于RNA干擾的合成寡核苷酸的靶序列如下si-CSTF2-#l，5'-GGCUUUAGUCCCGGGCAGA-3' (SEQ ID NO :9) ;si_CSTF2_#2，5，-CACUUUACUUUCUGUAACU-3，(SEQ ID NO :10)，對(duì)照 1 : (EGFP，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白[GFP]基因，維多利亞水母(Aequorea gictoria)GFP的一種突變體)，5，-GAAGCAGCACGACUUCUUC-3，(SEQ ID NO 11)；對(duì)照 2 (LUC,來(lái)自螢火蟲(Photinuspyralis)的螢光素酶基因)，5，-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3，(SEQ ID 而1幻。將肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和LC319涂布到ΙΟ-cm盤上(每個(gè)盤8. 0x105)，并使用30微升Lipofectamine2000 (Invitrogen)依照制造商的指令用每種siRNA寡核苷酸(100nmol/L)轉(zhuǎn)染。溫育7天后，通過(guò)Giemsa溶液染色這些細(xì)胞以評(píng)估集落形成，并通過(guò)溴化3_ (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑(MTT)測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞存活力。結(jié)果肺癌和正常組織中CSTF2的表達(dá)。為了鑒定用于開發(fā)肺癌的治療劑和/或生物標(biāo)志物的新穎靶分子，首先，對(duì)101份肺癌使用由27，648種基因或EST組成的cDNA微陣列進(jìn)行了基因組范圍基因表達(dá)譜分析(Kikuchi T,Daigo Y,Katagiri T,et al. 0ncogene2003 ；22 :2192-205,Kakiuchi S,DaigoY, Tsunoda Τ, Yano S, Sone S, Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99, KakiuchiS, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Hum Mol Genet 2004 ；13 :3029-43, Kikuchi Τ, Daigo Y,Ishikawa N, et al. Int J 0ncol2006 ；28 :799-805, Taniwaki Μ, Daigo Y, Ishikawa N, etal. Int J 0ncO12006 ；四567-75)。鑒定出CSTF2轉(zhuǎn)錄物在大多數(shù)檢查的肺癌樣品中過(guò)表達(dá)(3倍或更高)，而CSTF2所有四種正常組織中很少表達(dá)(除睪丸外)。結(jié)果，認(rèn)為CSTF2是新分子靶的較好候選基因。通過(guò)半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了 CSTF2在所檢查的12/15個(gè)肺癌組織中和15/15個(gè)肺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)(圖1A)。另外，通過(guò)使用抗CSTF2抗體進(jìn)行Western印跡分析確認(rèn)了 9個(gè)肺癌細(xì)胞系中CSTF2蛋白的表達(dá)(圖1B)。為了確定肺癌細(xì)胞中內(nèi)源CSTF2的亞細(xì)胞定位，使用抗CSTF2抗體進(jìn)行了免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)了它在SBC5細(xì)胞的細(xì)胞核中的染色(圖1C)。用CSTF2cDNA作為探針進(jìn)行Northern印跡分析，在所檢查的16種正常人組織中僅在睪丸中鑒定出2. 6-kb轉(zhuǎn)錄物(圖2A)。另外，使用抗CSTF2抗體檢查了 5種正常組織(心、肺、肝、腎、和睪丸)以及肺癌中的CSTF2蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在睪丸細(xì)胞的細(xì)胞核中觀察到CSTF2陽(yáng)性染色，但是在其它正常組織中沒有觀察到(圖2B)。CSTF2過(guò)表達(dá)與NSCLC患者的不良預(yù)后的關(guān)聯(lián)。為了驗(yàn)證CSTF2在肺癌發(fā)生中的生物學(xué)和臨床病理學(xué)意義，在含有來(lái)自327名接受治愈性手術(shù)切除的患者的原發(fā)性NSCLC組織的組織微陣列上進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。在肺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中觀察到抗CSTF2多克隆抗體的CSTF2陽(yáng)性染色，但是在任何其鄰近正常肺細(xì)胞或圍繞腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞中染色是陰性的。將組織陣列上的CSTF2表達(dá)水平分類，范圍從無(wú)(得分0)至弱/強(qiáng)陽(yáng)性(得分1+至2+)(圖2C)。在327例NSCLC中，CSTF2在77例中強(qiáng)染色( %;得分2+)，在165例中弱染色(50%;得分1+)，而在85例中無(wú)染色
得分0;詳情顯示于表1)。接著，檢查了 CSTF2表達(dá)水平(強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)弱陽(yáng)性/無(wú))與各種臨床病理變量的關(guān)聯(lián)，而且發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)CSTF2表達(dá)與原發(fā)性腫瘤切除后NSCLC患者的不良預(yù)后有關(guān)(P = 0.0079，時(shí)序檢驗(yàn)；圖2D)，但是與任何其它臨床病理變量無(wú)關(guān)。另外，檢查了單變量分析以評(píng)價(jià)患者預(yù)后和數(shù)個(gè)臨床病理因素(包括年齡(>=65對(duì)<65歲)、性別(男性對(duì)女性)、組織學(xué)(非腺癌對(duì)腺癌)、吸煙史(吸煙者對(duì)不吸煙者)、pT階段(腫瘤大??；Τ2-Τ3對(duì)Tl)、ρΝ階段(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；m_N2對(duì)NO)、和CSTF2表達(dá)(得分2+對(duì)0、1+))之間的關(guān)聯(lián)。所有這些參數(shù)除吸煙史外均與不良預(yù)后顯著相關(guān)(表幻。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行的多變量分析指示PT階段、ρΝ階段、年齡、和強(qiáng)CSTF2陽(yáng)性是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素(表2)。[表 2]NSCLC患者中預(yù)后因素的Cox氏比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析
權(quán)利要求
1.一種用于在受試者中診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法，其中該方法包括下述步驟(a)通過(guò)選自下組的任何一種方法測(cè)定源自受試者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平⑴檢測(cè)CSTF2基因的mRNA，( )檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)，和(iii)檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性；并(b)將步驟(a)中測(cè)定到的表達(dá)水平與CSTF2基因的正常對(duì)照水平相比的升高與該受試者中癌癥的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)中測(cè)定到的表達(dá)水平比該正常對(duì)照水平高至少 10%。
3.權(quán)利要求1的方法，其中該源自受試者的生物樣品包括活檢樣品、痰、血液、胸腔積液或尿。
4.一種用于評(píng)估或確定患有癌癥的受試者的預(yù)后的方法，其中該方法包括下述步驟(a)檢測(cè)源自受試者的生物樣品中CSTF2基因的表達(dá)水平；(b)將檢測(cè)到的表達(dá)水平與對(duì)照水平比較；并(c)基于(b)的比較確定該受試者的預(yù)后。
5.權(quán)利要求4的方法，其中該對(duì)照水平為良好預(yù)后對(duì)照水平，且該表達(dá)水平與該對(duì)照水平相比的升高指示不良預(yù)后。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述升高是比該對(duì)照水平高至少10%。
7.權(quán)利要求4的方法，其中該表達(dá)水平是通過(guò)任何一種選自下組的方法測(cè)定的(a)檢測(cè)CSTF2基因的mRNA；(b)檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)；和(c)檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。
8.權(quán)利要求4的方法，其中該源自受試者的生物樣品包括活檢樣品、痰或血液、胸腔積液或尿。
9.一種用于對(duì)患有癌癥的受試者診斷癌癥或評(píng)估或測(cè)定預(yù)后的試劑盒，其包含選自下組的試劑(a)用于檢測(cè)CSTF2基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)的試劑；和(c)用于檢測(cè)由CSTF2基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的試劑。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中該試劑包含針對(duì)CSTF2基因的基因轉(zhuǎn)錄物的探針或引物或針對(duì)CSTF2基因的翻譯產(chǎn)物的抗體。
11.一種分離的雙鏈分子，其在導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)抑制CSTF2基因的體內(nèi)表達(dá)以及細(xì)胞增殖，其中該分子包括有義鏈及其互補(bǔ)反義鏈，其中這些鏈彼此雜交以形成該雙鏈分子。
12.權(quán)利要求11的雙鏈分子，其中該有義鏈包含與選自SEQID NO :9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列。
13.權(quán)利要求11或12的雙鏈分子，其中該有義鏈與反義鏈在該靶序列處雜交以形成該雙鏈分子，該雙鏈分子的長(zhǎng)度為19 25個(gè)堿基對(duì)。
14.權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)的雙鏈分子，其由單一多核苷酸組成，該單一多核苷酸包括通過(guò)間插單鏈連接的該有義和反義鏈二者。
15.權(quán)利要求14的雙鏈分子，其具有通式5’-[幻-[8]-仏’]-3’，其中[A]為有義鏈， 其包含與選自SEQ ID NO 9和10的靶序列對(duì)應(yīng)的序列，[B]為間插單鏈，其由3至23個(gè)核苷酸組成，而[A’ ]為反義鏈，其包括[A]中所選的靶序列的互補(bǔ)序列。
16.一種載體，其編碼權(quán)利要求11至15任一項(xiàng)的雙鏈分子。
17.一種在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法，其中該方法包括對(duì)受試者施用藥學(xué)有效量的針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子在導(dǎo)入表達(dá) CSTF2基因的細(xì)胞中時(shí)抑制CSTF2基因的表達(dá)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中該雙鏈分子為權(quán)利要求11至15任一項(xiàng)的雙鏈分子。
19.權(quán)利要求17的方法，其中該載體為權(quán)利要求16的載體。
20.一種用于治療表達(dá)CSTF2基因的癌癥的組合物，其中該組合物包含至少一種分離的針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子在導(dǎo)入表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞中時(shí)抑制CSTF2基因的表達(dá)；以及可藥用的擔(dān)載體。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中該雙鏈分子為權(quán)利要求11至15任一項(xiàng)的雙鏈分子。
22.權(quán)利要求20的組合物，其中該載體為權(quán)利要求16的載體。
23.—種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的候選物質(zhì)的方法，其中該方法包括下述步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與CSTF2多肽或其片段接觸；(b)檢測(cè)該多肽或片段和該測(cè)試物質(zhì)之間的結(jié)合活性；并(c)選擇結(jié)合該多肽或片段的測(cè)試物質(zhì)作為用于治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。
24.一種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的候選物質(zhì)的方法，其中該方法包括下述步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與CSTF2多肽或其片段接觸；(b)檢測(cè)該多肽或片段的生物學(xué)活性；(c)將該多肽或片段的生物學(xué)活性與在該測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)檢測(cè)到的生物學(xué)活性相比較；并(d)選擇阻抑該多肽的生物學(xué)活性的測(cè)試物質(zhì)作為用于治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。
25.權(quán)利要求M的方法，其中該生物學(xué)活性為細(xì)胞增殖活性、RNA結(jié)合活性、mRNA切割活性或mRNA聚腺苷酸化活性。
26.—種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的候選物質(zhì)的方法，其中該方法包括下述步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞接觸；并(b)選擇與在該測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)檢測(cè)到的表達(dá)水平相比降低CSTF2基因的表達(dá)水平的測(cè)試物質(zhì)。
27.—種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的候選物質(zhì)的方法，其中該方法包括下述步驟(a)使測(cè)試物質(zhì)與其中導(dǎo)入有載體的細(xì)胞接觸，該載體包括CSTF2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)告基因；(b)測(cè)量該報(bào)告基因的表達(dá)或活性；并(C)選擇與在該測(cè)試物質(zhì)不存在時(shí)檢測(cè)到的表達(dá)或活性水平相比降低該報(bào)告基因的表達(dá)或活性水平的測(cè)試物質(zhì)。
28.一種用于在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法，包括對(duì)該受試者施用抗CSTF2抗體或其免疫學(xué)活性片段。
29.權(quán)利要求1至8、17至19和23至28任一項(xiàng)的方法，權(quán)利要求9或10的試劑盒、或權(quán)利要求20至22任一項(xiàng)的組合物，其中該癌癥為肺癌。
30.載體，它們包含包括有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸組合中之任一，其中所述有義鏈核酸包含與SEQ ID NO :9或10對(duì)應(yīng)的核苷酸序列且所述反義鏈核酸由與該有義鏈互補(bǔ)的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄物彼此雜交以形成雙鏈分子，且其中所述載體在導(dǎo)入表達(dá)CSTF2基因的細(xì)胞中時(shí)抑制細(xì)胞增殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及CSTF2基因在癌癥癌發(fā)生中發(fā)揮的作用，而且特征在于一種通過(guò)施用針對(duì)CSTF2基因的雙鏈分子或含有此類雙鏈分子的組合物、載體或細(xì)胞來(lái)治療或預(yù)防癌癥的方法。本發(fā)明的特征還在于利用過(guò)表達(dá)的CSTF2基因?qū)哂蟹伟┑氖茉囌咴\斷癌癥或評(píng)估/測(cè)定預(yù)后的方法。為此，CSTF2可充當(dāng)癌癥，特別是肺癌的新穎預(yù)后生物標(biāo)志物。還有，公開了使用它們對(duì)CSTF2的表達(dá)或生物學(xué)活性的影響作為指標(biāo)篩選用于治療和預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102575300SQ20108004777
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者中村佑輔, 角田卓也, 醍醐彌太郎 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司