專利名稱：基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國樹鼩分子遺傳標(biāo)識方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國樹駒分子遺傳標(biāo)識方法，屬生物高技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國樹駒(Tupaia belangeri chinensis)，隸屬于樹鼠句目Gcandentia)，樹鼠句科 (Tupaiidae)，樹駒屬(Tupaia)動物。形似松鼠，同時(shí)具有食蟲目Gnsectivora)和靈長類 (Primates)動物的一些特征。樹駒吻部較長，指(趾)端具爪，齒式和食性等特征與食蟲目動物相似，而其發(fā)達(dá)的大腦、頭骨結(jié)構(gòu)、中耳部結(jié)構(gòu)、肌群組成和腸胃道結(jié)構(gòu)等與靈長類動物相似，因此其系統(tǒng)分類地位一直是分類學(xué)上爭論的話題。上世紀(jì)80年代，根據(jù)樹駒眾多形態(tài)系統(tǒng)發(fā)生和分子系統(tǒng)發(fā)生的研究，一些學(xué)者提出建立樹駒目，將其置于食蟲目與靈長目之間?，F(xiàn)有遺傳學(xué)證據(jù)表明樹駒和靈長類動物關(guān)系密切，是其近親。由于樹駒個(gè)體小，飼養(yǎng)繁殖周期短，成本低，且具有多種自發(fā)性疾病，在疾病和正常情況下都表現(xiàn)出諸多與靈長類動物相似的特征，已被大量運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)研究，并有望在某些方面替代數(shù)量日趨減少的瀕危的非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物。目前，樹駒被廣泛運(yùn)用于近視、肝炎、肝癌、抑郁癥、糖尿病和微生物感染等疾病的研究，實(shí)驗(yàn)用樹駒呈現(xiàn)了供不應(yīng)求的狀態(tài)。雖然樹駒的人工飼養(yǎng)繁殖工作早在19世紀(jì)80年初就已開展，但到目前為止，依然沒有建立一個(gè)純的實(shí)驗(yàn)品系，且缺少一種能用于個(gè)體識別和純系評估的分子遺傳標(biāo)識系統(tǒng)。 現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中所用的樹駒大多是野外捕獲的，或者是捕獲后只經(jīng)過短期的室內(nèi)馴養(yǎng)。然而，野外生存的樹駒種群存在豐富的遺傳多樣性，這導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)所采用的樹駒的遺傳背景存在較大差異，往往研究結(jié)果出現(xiàn)巨大差異。為了更好地推進(jìn)新型實(shí)驗(yàn)動物樹駒的模式化和遺傳背景清晰的品系的創(chuàng)制，合理開發(fā)利用樹駒資源，建立一套樹駒個(gè)體識別和純系評定的遺傳標(biāo)識系統(tǒng)尤為迫切。用于遺傳分析的分子標(biāo)記有多種，如限制性長度片段多態(tài)(Restriction FragmentLength Polymorphism, RFLP),隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RandomAmplified PolymorphicDNA，RAPD)，數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)(Variable Number Tandem Repeat, VNTR) 和微衛(wèi)星(microsatellite)。微衛(wèi)星又稱為簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR) 或短片段重復(fù)序列(Short Tandem R印eat，STR)，是由l_6bp的堿基作為核心重復(fù)單元，串聯(lián)重復(fù)形成的一類DNA序列。由于微衛(wèi)星廣泛且較均勻地分布在基因組中(約30-501Λ就存在一個(gè)微衛(wèi)星DNA)，具有豐富的多態(tài)性、信息含量大、呈共顯性、符合孟德爾遺傳規(guī)律等特點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于連鎖圖譜構(gòu)建、種群遺傳多樣性分析、品種品系的選擇和建立、以及不同品系間親緣關(guān)系界定、個(gè)體識別和親權(quán)鑒定等。要評估建立的樹駒品種或品系是否遺傳背景清晰，首先需要檢測一套分子遺傳標(biāo)記。因此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國樹駒分子遺傳標(biāo)識方法。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明樹駒微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記相同的公開文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國樹駒分子遺傳標(biāo)識方法，用于檢測樹駒種群雜合度、群體結(jié)構(gòu)、個(gè)體識別和親權(quán)鑒定。本發(fā)明以Ensembl數(shù)據(jù)庫下載的樹駒基因組序列為模板，搜尋微衛(wèi)星序列，用 Primerpremier 5軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增微衛(wèi)星序列的引物對。經(jīng)PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳，不斷優(yōu)化擴(kuò)增條件，最后得到12對具有等位基因多態(tài)性和特異性擴(kuò)增的樹駒微衛(wèi)星序列的引物。這12個(gè)樹駒微衛(wèi)星座位的擴(kuò)增引物信息、微衛(wèi)星序列的重復(fù)元件、擴(kuò)增片段長度范圍以及擴(kuò)增條件列于表1中?；谌詣訙y序儀的DNA片段分析(GENESCAN)原理， 將每對引物的正向引物用5' -FAM標(biāo)記后，利用優(yōu)化好的擴(kuò)增條件，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物與一定量的分子內(nèi)標(biāo)混合，分別在ABI PRISM3730型或其他型號全自動測序儀 (Applied Biosystems)上掃描檢測。具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物依據(jù)長度的不同，在電泳中顯示出不同的遷移率，其帶有的FAM標(biāo)記熒光信號在電泳過程中被測序儀檢測。依據(jù)分子內(nèi)標(biāo)的條帶數(shù)與片段大小，我們利用相關(guān)軟件即能判讀出目的片段的大表1.中國樹駒12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星座位的引物序列、產(chǎn)物長度、擴(kuò)增條件及重復(fù)元件
權(quán)利要求
1. 一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國樹駒分子遺傳標(biāo)識方法，其特征在于該方法的具體步驟如下A、使用酚/氯仿法或試劑盒提取法從樹駒組織或血液中提取基因組DNA；B、以步驟A提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增各微衛(wèi)星位點(diǎn)的各個(gè)上游引物標(biāo)記 5' -FAM，進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)引物和擴(kuò)增條件如下
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國樹鼩分子遺傳標(biāo)識方法，屬生物高技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將微衛(wèi)星引物標(biāo)記熒光(5′-FAM)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使PCR產(chǎn)物帶有5′-FAM熒光標(biāo)記。將PCR產(chǎn)物與分子內(nèi)標(biāo)混合，經(jīng)DNA全自動測序儀的掃描檢測后，通過不同等位基因擴(kuò)增片段與分子內(nèi)標(biāo)的相對位置而識別出目的片段的長度大小，達(dá)到基因分型的目的。通過計(jì)算雜合度及各項(xiàng)法醫(yī)學(xué)鑒定指數(shù)，能對個(gè)體識別和群體多樣性、品系純度評估。本發(fā)明也能夠通過10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)不同大小的等位基因片段判別不同基因型。本發(fā)明具有簡單、快速、靈敏和適用的特點(diǎn)，對于樹鼩資源遺傳多樣性評估、品種品系的分子標(biāo)記輔助選育和個(gè)體識別具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102424864SQ20121000422
公開日2012年4月25日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉小紅, 姚永剛 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所