專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食品中病原菌的快速檢測(cè)方法，特別是一種以HisJ為靶基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的方法及試劑盒，屬于食品檢測(cè)生物技術(shù)領(lǐng)域，適用于食品中沙門(mén)菌屬的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
沙門(mén)菌是最常見(jiàn)的食源性疾病病原菌，不僅能導(dǎo)致動(dòng)物疾病，還能使人類(lèi)發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙門(mén)菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙門(mén)菌作為致病菌檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在公共衛(wèi)生、食品安全、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中均是必需檢測(cè)的項(xiàng)目，有重要社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的意義。傳統(tǒng)的沙門(mén)菌檢測(cè)常用分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，確診檢驗(yàn)結(jié)果至少需5 7天，檢驗(yàn)方法存在繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、 特異性低等缺陷。因此，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的沙門(mén)菌檢測(cè)方法將是發(fā)展的方向。建立一種能快速檢測(cè)沙門(mén)菌的檢測(cè)方法具有重要的意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是建立于鏈替換自動(dòng)循環(huán)反應(yīng)基礎(chǔ)之上。模板上的六個(gè)位點(diǎn)在恒溫條件下被四條基礎(chǔ)引物所識(shí)別并擴(kuò)增，這賦予了此技術(shù)高度的特異性。與其他方法相比，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增只需要一個(gè)可以保持60-65°C恒溫的簡(jiǎn)單加熱裝置如水浴鍋。而且，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在合成大量DNA的同時(shí)伴有大量的白色硫酸鎂副產(chǎn)物，所以結(jié)果的判定只需肉眼簡(jiǎn)單觀察濁度或通過(guò)加入DNA染料STOR GreenI后觀察顏色變化。HisJ基因被報(bào)道可以成功檢測(cè)沙門(mén)菌分離株并被證明是一個(gè)可靠的靶基因(G. G. Stone, R. D. Oberst, Μ. P. Hays, S. McVey, and Μ. Μ. Chengappa, " Detection of Salmonella serovars from clinicalsamples by enrichment broth cultivation-PCR procedure," Journal ofClinical Microbiology, vol.32，no. 7，pp. 1742-1749，1994 ；C.Gentry-Weeks, H. J. Hutcheson, L. M.Kim, D.Bolte, J. Traub-Dargatz, P. Morley, B. Powers, and M. Jessen, " Identification of twophylogeneticalIy related organisms from feces by PCR for detection ofSalmonella spp," Journal of Clinical Microbiology,vol. 40,no. 4,pp. 1487-1492, 2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的方法，該方法能夠快速、準(zhǔn)確、高靈敏地檢測(cè)食品中的沙門(mén)菌。本發(fā)明通過(guò)以沙門(mén)菌種屬特異性基因HisJ為靶基因，設(shè)計(jì)了一組四條引物特異性擴(kuò)增HisJ基因以達(dá)到檢測(cè)沙門(mén)菌的目的。為了使檢測(cè)具有好的靈敏度與特異性，我們使用了 BPW(蛋白胨水)進(jìn)行預(yù)增菌，使用了孔雀綠培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性增菌。獲得了高特異性高靈敏度的結(jié)果。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的方法，采用GenBank登錄號(hào)為 CP001363. 1的沙門(mén)菌HisJ基因序列，設(shè)計(jì)一組四條引物SALFIP、SALBIP、SALF3和SALB3C， 以常規(guī)水煮裂解法提取的鼠傷寒沙門(mén)菌基因組DNA為模板進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，其步驟如下A、所述的引物序列為SALFIP :ttgcctttcagcgacgcgacttttctgattcccgtctggtggt ； (SEQ ID NO. 1)SALBIP :tgctacaggggacgacgcagttttacgatctcaatccctttcgg ； (SEQ ID NO. 2)SALF3 :aggaaatcgcgtttaccgac ； (SEQ ID NO. 3)SALB3C :gttgtcctgcccctggta. (SEQ ID NO. 4)B、所述的水煮裂解法步驟為取細(xì)菌懸液Iml 8，000Xg離心5分鐘，沉淀使用 PBS懸浮并洗滌；接著再用8，000 Xg離心獲取沉淀并使用100 μ 1超純水重懸細(xì)菌；使用煮沸法裂解細(xì)菌，即細(xì)菌懸浮液在100°C煮沸l(wèi)Omin，12，OOOXg離心3分鐘，吸取上清作為模板；C、反應(yīng)體系設(shè)為25 μ L，體系組成引物SALFIP和SALBIP各1. 6 μ Μ，引物SALF3 和SALB3C各0. 4 μ M，dNTPs為1. 6mM,硫酸鎂為6mM，甜菜堿為1M，8U的Bst DNA聚合酶大片段，1 X thermopol緩沖液，和2 μ 1的樣品基因組DNA ；D、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)榛旌弦涸?3°C孵育60分鐘后，反應(yīng)液在80°C加熱3分鐘終止；可通過(guò)在PCR管中加入1. 0 μ 1 1/10稀釋的STOR green I (綠色熒光核酸染料)原液(黃色)后溶液的顏色變化來(lái)確定是否含有沙門(mén)菌。當(dāng)含有沙門(mén)菌擴(kuò)增DNA產(chǎn)物時(shí)，溶液呈現(xiàn)綠色；當(dāng)無(wú)沙門(mén)菌擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，顏色仍為黃色。也可用肉眼觀察PCR管中是否存在白色沉淀來(lái)判斷樣品中是否含有沙門(mén)菌。有白色沉淀，樣品為沙門(mén)菌陽(yáng)性；無(wú)白色沉淀，樣品為沙門(mén)菌陰性。本發(fā)明還公開(kāi)了一種沙門(mén)菌檢測(cè)試劑盒，包括試劑A :2X預(yù)混反應(yīng)緩沖液 12. 5X20 μ L ；試劑B 反應(yīng)酶液IX 20 μ L ；試劑C 預(yù)混引物干粉，在使用前加入40 μ L超純水，2 X 20 μ L ；試劑D為陰性對(duì)照ImL ；試劑E為陽(yáng)性對(duì)照ImL ；試劑F為SYBER Green I 1Χ20μ L?；蛘咴噭〢:10XThermoPol 緩沖液(New England Biolabs, USA) 50 μ L, IOmM dNTPs (Promega, USA) 80 μ L, IM硫酸鎂(Promega，USA) 3 μ L，5Μ 甜菜堿(Sigma，USA) 100 μ L， 超純水17μ L ；試劑B :8U Bst DNA 聚合酶大片段(New England Biolabs, USA) 20 μ L ；試劑C 引物SALFIP和SALBIP干粉各0. 8nmol，弓丨物SALF3和SALB3C干粉各 0. 2nmol ；試劑D 超純水ImL ；試劑E 高純鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC 14028s基因組模板lmL(10ng/ μ L)；試劑F 10000 X SYBER Green I (invitrogen) 2 μ L, DMSO 18 μ L。試劑貯藏條件-20°C。本發(fā)明中總反應(yīng)體系設(shè)為25 μ L，體系組成引物SALFIP和SALBIP各1. 6 μ Μ，引物 SALF3 和 SALB3C 各 0. 4 μ Μ，dNTPs 為 1. 6mM,硫酸鎂為 6mM，甜菜堿為 1M，8U 的 Bst DNA 聚合酶大片段，lXHiermoPol緩沖液，和2μ 1的樣品基因組DNA。
本發(fā)明所述的樣品，待檢時(shí)，采用水煮裂解法提取基因組DNA，具體步驟如下吸取搖勻的培養(yǎng)細(xì)菌懸液Iml于1. 5ml微量離心管中8，OOOXg離心5分鐘，沉淀使用PBS懸浮并洗滌。接著再用8，000 Xg離心獲取沉淀并使用ΙΟΟμΙ超純水重懸細(xì)菌。使用煮沸法裂解細(xì)菌，即細(xì)菌懸浮液在100°C煮沸10min，12，000Xg離心3分鐘，吸取上清作為模板。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，從樣品DNA的提取到檢測(cè)出結(jié)果僅需約1. 5小時(shí)(不包括樣品處理與預(yù)增菌)；2、特異性強(qiáng)，靈敏度高；3、適用范圍廣，可用于食品樣品如雞肉、豬肉、蔬菜等中沙門(mén)菌的檢測(cè)，其最低檢測(cè)限為增菌液中含沙門(mén)菌8X 102CFU/ml ；4、本方法可替代傳統(tǒng)的食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)方法。


圖1. LAMP引物設(shè)計(jì)箭頭和方框表示引物在靶基因上的延伸方向。限制性酶切位點(diǎn)HinfI用加粗字體顯不。圖2.限制性酶切分析沙門(mén)菌ATCC 14028s株LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物泳道1.未酶切LAMP產(chǎn)物；泳道2. HinfI酶切后的LAMP產(chǎn)物；泳道3.陰性對(duì)照； 泳道M. DL2000 (寶生物)圖3-6是LAMP方法與PCR方法間的靈敏度比較泳道M. DL2000 ；泳道1_8.分別對(duì)應(yīng)于10倍稀釋沙門(mén)菌ATCC14028s菌液即 8. OX IO6-S. OX Kr1CFUAil ；泳道9.模板為大腸桿菌的陰性對(duì)照；泳道10.模板為水的陰性對(duì)照。圖3.瓊脂糖(1. 5% w/v)電泳使用EB染色顯示LAMP反應(yīng)靈敏度。圖4瓊脂糖(1. 5% w/v)電泳使用EB染色顯示PCR反應(yīng)靈敏度。圖5肉眼檢測(cè)LAMP產(chǎn)物的濁度。圖6肉眼檢測(cè)STOER Green I染色后的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、設(shè)計(jì)、合成引物在GenBank中搜索沙門(mén)菌屬的HisJ基因序列，對(duì)其同源性進(jìn)行比較，其同源性在 99%以上。參照GenBank中鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC 14028s (accession CP001363. 1)設(shè)計(jì)引物。 使用日本榮研化學(xué)有限公司的I^rimerExplorer V4軟件按照默認(rèn)設(shè)定進(jìn)行設(shè)計(jì)(http:// primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index. html)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物設(shè)計(jì)區(qū)域位于沙門(mén)菌基因組 HisJ 基因 2，516，325-2，516，524nt 內(nèi)(圖 1)。一組四條引物 SALFIP、SALBIP、 SALF3和SALB3C在大連寶生物公司按照PAGE純度級(jí)別合成。2、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序和反應(yīng)體系建立通過(guò)對(duì)引物濃度、硫酸鎂濃度、甜菜堿濃度等的選擇，確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程
5序。優(yōu)化后的引物SALFIP和SALBIP最佳濃度為1. 6 μ Μ，引物SALF3和SALB3C最佳濃度為 0. 4 μ Μ，硫酸鎂最佳濃度為6mM，甜菜堿最佳濃度為1M。3、方法特異性和酶切鑒定將甘油低溫保存的鼠傷寒沙門(mén)標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 14028s置于冰上解凍，接種到BPW內(nèi)培養(yǎng)復(fù)蘇M小時(shí)，細(xì)菌懸液按10倍遞增稀釋至8. OX IO6-S. OX Kr1CFUAil，分別提取核酸 DNA，用本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，考察檢測(cè)下限，同時(shí)以HisJ基因?yàn)槟０宓某Ｒ?guī)PCR做參照，對(duì)靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。應(yīng)用103株已知沙門(mén)菌或非沙門(mén)菌(表1和表 2)測(cè)試基于HisJ為靶基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)菌的特異性。表1實(shí)驗(yàn)中使用的沙門(mén)菌
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于以沙門(mén)菌HiSj基因?yàn)榘谢颍褂盟臈l環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增特異性引物檢測(cè)沙門(mén)菌，所述四條環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增特異性引物序列如SEQ ID N01-4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，其步驟如下A、以水煮裂解法提取鼠傷寒沙門(mén)菌基因組DNA:取細(xì)菌懸液Iml8,000 X g離心5分鐘，沉淀使用PBS懸浮并洗滌；接著再用8，000 X g離心獲取沉淀并使用100 μ 超純水重懸細(xì)菌；使用煮沸法裂解細(xì)菌，即細(xì)菌懸浮液在100 0C煮沸10 min,12,000 X g離心3 分鐘，吸取上清作為模板；B、將序列分別如SEQID N01-4所示的一組4條引物SALFIP、SALBIP、SALF3和 SALB3C與反應(yīng)試劑組合，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)；其反應(yīng)體系為25 μ ，體系組成引物SALFIP和SALBIP各1. 6 μΜ，引物SALF3和 SALB3C各0. 4 μΜ, dNTPs為1. 6 mM，硫酸鎂為6 mM，甜菜堿為1 M，8 U的Bst DNA聚合酶大片段，lXHiermoPol緩沖液，和2 μ 的樣品基因組DNA ；其反應(yīng)程序混合液在63 0C孵育60分鐘后，反應(yīng)液在80 °C加熱3分鐘終止，觀察。
3.一種沙門(mén)菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括 試劑A: 2X預(yù)混反應(yīng)緩沖液12. 5X20 μ ； 試劑B:反應(yīng)酶液1X20 μ ；試劑C:預(yù)混引物干粉，在使用前加入40 PL超純水，2X20 μ ； 試劑D為陰性對(duì)照1 mL ； 試劑E為陽(yáng)性對(duì)照1 mL ； 試劑 F 為 SYBER Green I 1X20 μ 。
4.一種沙門(mén)菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括試劑 A 10 X ThermoPol 緩沖液 50 μ , 10 mM dNTPs 80 μ , 1 M 硫酸鎂 3 μ ,5 M甜菜堿100 μ ，超純水17 μ ；試劑B :8 U Bst DNA聚合酶大片段20μ ；試劑C:引物SALFIP和SALBIP干粉各0. 8 nmol，引物SALF3和SALB3C干粉各0. 2 nmol ；試劑D 超純水1 mL ；試劑E 高純鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC 14028s基因組模板1 mL (10 ng/^L)； 試劑 F :10000 X SYBER Green I 2 μ , DMSO 18 μ 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食品中病原菌的快速檢測(cè)方法，特別是一種以HisJ為靶基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的方法及試劑盒。所述的檢測(cè)方法是以沙門(mén)菌HisJ基因?yàn)榘谢?，使用四條環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增特異性引物檢測(cè)沙門(mén)菌，所述四條環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增特異性引物序列如SEQIDNO1-4所示。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，靈敏度高；適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可替代傳統(tǒng)的食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424861SQ20121000367
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者孫林, 張磊, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 陳祥, 黃金林 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)