專利名稱：提高植物對低氧條件抗性的方法
提高植物對低氧條件抗性的方法本申請是發(fā)明人于2006年6月6日提交的題為“提高植物對低氧條件抗性的方法”的中國專利申請200680021382. X的分案申請。本發(fā)明提供用于提高植物對低氧或無氧條件抗性的方法。這類方法可用于促進植物根穿透生長培養(yǎng)基或土壌。本發(fā)明的方法可包括對植物基因組的修飾，所述修飾通過對植物提供外源脅迫耐受性基因或?qū)?yīng)于這類外源基因的內(nèi)源基因的脅迫耐受性變體。本發(fā)明的方法也可包括對植物或其生境，或?qū)ζ浼毎蚍N子使用新煙堿類化合物(neonicotinoid compound)，例如但不限于吡蟲啉(imidacloprid)、烯啶蟲胺 (nitenpyram)、ロ足蟲脈(acetamiprid)、噻蟲啉(thiacloprid)、噻蟲嗪(thiamethoxam)、可尼丁(clothianidin)和呋蟲胺(dinotefuran)。特別有效的新煙堿類化合物是包含氯吡啶(chloropyridine)側(cè)鏈的新煙堿類化合物，例如吡蟲啉、烯啶蟲胺、啶蟲脒和噻蟲啉，特別是其在植物中的降解能夠釋放6-氯煙酸(6-chloronicotininc acid,6-CNA)的那些新煙堿類化合物，像例如吡蟲啉和噻蟲啉。植物或其生境也可直接用6-CNA處理。
背景技術(shù)：
改造為脅迫耐受的植物為本領(lǐng)域所已知。植物細胞和植物的脅迫耐受性可例如通過降低內(nèi)源聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)或聚(ADP-核糖)糖原水解酶(PARG)的活性或水平實現(xiàn)，其分別描述于WO 00/04173和W004/090140中。歐洲專利申請No. 04077624. 7描述了使用下述核苷酸序列例如在植物中過表達來實現(xiàn)植物和植物細胞的脅迫耐受性，所述核苷酸編碼參與NAD補救合成途徑和/或NAD 從頭合成途徑的酶。然而，這些文件均沒有公開使用其中提到的脅迫耐受性基因在植物細胞和植物中獲得對低氧或無氧條件的耐受性的可能性。它們也沒有公開其中所述脅迫耐受性基因用于下述目的的用途允許植物的根系更深地穿透進入生長培養(yǎng)基或土壌中。除昆蟲控制外，新煙堿類化合物在植物中其他目的的應(yīng)用也是本領(lǐng)域已知的(W0 01/26468，WO 03/096811)。WO 01/26468公開了改善植物生長的方法，其包括向植物或其所在地應(yīng)用至少ー 種選自新煙堿類的化合物。W003/096811描述了在下述地點的農(nóng)學(xué)植物的產(chǎn)量和/或活力可以通過用新煙堿類化合物處理植物的種子來提高或改進，所述地點中蟲害水平低于所指示的需要使用殺蟲劑用于昆蟲控制目的的水平。所述方法被認為適用于非轉(zhuǎn)基因植物和具有外源基因的植物，所述外源基因編碼經(jīng)修飾的蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis) δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。然而，這些文件均未描述為了提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件的耐受性， 或允許植物的根系更深地穿透進入生長培養(yǎng)基或土壌的目的，將新煙堿類化合物用于植物的用途。因此，本領(lǐng)域仍未涉及增加植物根系或根進入生長培養(yǎng)基或土壌的穿透深度，或提高植物細胞或植物對低氧或無氧脅迫條件的耐受性的方法，所述方法如下文在不同的實施方案和權(quán)利要求中所述使用脅迫耐受性基因，或通過對植物或其細胞使用新煙堿類化合物。發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方案提供提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的新方法，所述方法包括向植物細胞或植物提供脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，其中所述脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因選自-能夠降低植物內(nèi)源PARP基因表達的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，特別是其中所述轉(zhuǎn)基因編碼PARP抑制性RNA分子；-能夠降低植物內(nèi)源PARG基因表達的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，特別是其中所述轉(zhuǎn)基因編碼PARG抑制性RNA分子；或-編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(nicotinate phosphoribosyltransferase)、畑酸單核苷酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。在另ー實施方案中，本發(fā)明涉及這類脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因促進植物根穿透生長培養(yǎng)基(包括土壌)的用途。本發(fā)明的另ー實施方案提供用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括向植物細胞、植物，或?qū)㈤L成此類植物的種子或其生境使用有效量的新煙堿類化合物。在另ー實施方案中，本發(fā)明涉及這類化合物促進植物根穿透生長培養(yǎng)基(包括土壌)的用途。本發(fā)明還涉及用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，包括將有效量的6-氯煙酸提供給所述植物的細胞的步驟。本發(fā)明還涉及6-CNA用于促進植物根穿透進入生長培養(yǎng)基中的用途。


圖1 測量生長于瓊脂溶液中的植物根深的測定法的示意圖。用透明的或半透明的生長培養(yǎng)基C3)填充帶有封ロ( 的容器(1)，所述生長培養(yǎng)基為例如0.4%的瓊脂-水或0.7%的瓊脂-水，其中可添加額外的測試化合物。向管中加入一粒預(yù)萌發(fā)的種子，并允
許其生長三周。在垂直位置生長三周后，從培養(yǎng)基頂部到根的最低點測量植物的根深 ⑶。圖2:擬南芥(Arabidopsis thaliana) cv. Col-Ο植物根深(mm)的箱狀圖示，所述植物與非轉(zhuǎn)基因擬南芥植物(Col-O)相比包含轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因編碼能夠降低內(nèi)源 PARP2基因表達的dsRNA分子。分析以下種群· Col-O 數(shù)據(jù)指示野生型擬南芥株系· 427-16 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有弱耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系
· 427-20 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有弱耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系· 427-20 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系該圖左側(cè)表示了各組值的代表性箱狀圖(或箱狀圖和須盒圖)，所述值總結(jié)了以下的統(tǒng)計學(xué)測量-中位數(shù)-上四分位和下四分位數(shù)-最小和最大數(shù)據(jù)值。另外，在各組數(shù)值的右邊，指示這些數(shù)值的均值和均值標(biāo)準差。箱狀圖解釋如下-箱自身包含中間50%的數(shù)據(jù)。箱的上緣(接合處)指出數(shù)據(jù)集的第75百分位數(shù)，下接合處指出第25百分位數(shù)。中間兩個四分位數(shù)的范圍已知為四分位數(shù)間距。-箱中的線指示數(shù)據(jù)的中位值。-須的末端指示最大和最小的數(shù)據(jù)值，存在異常值(outlier)的情況除外，在這種情況下須延伸至在1. 5倍四分位數(shù)間距的范圍內(nèi)最近的值點。圖3 擬南芥cv. Col-O植物根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標(biāo)準差，所述植物包含轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因編碼能夠降低內(nèi)源PARP基因表達的dsRNA分子。分析以下種群· Col-O 數(shù)據(jù)指示野生型擬南芥株系· 427-22 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有高耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系· 427-24 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有低耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系圖4 擬南芥cv. C24植物根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標(biāo)準差，所述植物包含轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因編碼能夠降低內(nèi)源PARP基因表達的dsRNA分子。分析了以下種群· C24 數(shù)據(jù)指示野生型擬南芥株系· 1599 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有高耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系· 1463 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARP2基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系· 1681 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARPl基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系· 1690 數(shù)據(jù)指示對強光脅迫條件具有中等耐受性的包含抗PARPl基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系圖5 對待分離抗PARP2轉(zhuǎn)基因的擬南芥Col-O種群測量的根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標(biāo)準差。分析了以下的種群
·不成對的(Azygous)數(shù)據(jù)指示來自不含有抗PARP2基因的種群的擬南芥植物·轉(zhuǎn)基因的數(shù)據(jù)指示來自含有抗PARP2基因的種群的擬南芥植物圖6 用多種濃度的吡蟲啉處理的擬南芥cv. C24植物與未處理的擬南芥cv. C24 植物相比，根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標(biāo)準差。分析了以下的種群· 0 未處理的擬南芥CM植物· 50 用50毫克/升吡蟲啉處理的擬南芥CM植物· 100 用100毫克/升吡蟲啉處理的擬南芥CM植物圖7 用多種濃度的6-氯煙酸處理的擬南芥cv. CM植物與未處理的擬南芥 cv. CM植物相比，根深(mm)測量值的箱狀示意圖和均值標(biāo)準差。分析了以下的種群· 0 未處理的擬南芥CM植物· 1 用1毫克/升6-氯煙酸處理的擬南芥CM植物· 5 用5毫克/升6-氯煙酸處理的擬南芥CM植物發(fā)明詳述本發(fā)明基于以下的認識包含脅迫耐受性基因(例如編碼下述dsRNA的嵌合基因， 所述dsRNA目的在于使植物parpl或parp2基因的表達沉默)的植物產(chǎn)生了下述根系，所述根系的根與對照植物的根相比伸入生長培養(yǎng)基中更深。如現(xiàn)有技術(shù)所述，包含脅迫耐受性基因的植物根穿透更深的現(xiàn)象仍未被注意，并需要開發(fā)如本文所述的具體測定法用于統(tǒng)計學(xué)分析根進入培養(yǎng)基的穿透性。盡管不意圖將本發(fā)明限制于具體的作用方式，仍認為脅迫耐受性基因提高植物細胞的耐受性(包括根的植物細胞對低氧和無氧條件的耐受性)，從而允許包含這類脅迫耐受性基因的根在較不良好的氧條件下生長，如可在生長培養(yǎng)基的更深區(qū)域或更深的土壤層中發(fā)現(xiàn)，那里氧張カ更低。植物根系進入更深土壌層的提高的穿透性部分地解釋了在野外條件下對含有本文所述脅迫耐受性基因(例如下述dsRNA，所述dsRNA編碼使內(nèi)源parpl或 parp2基因表達沉默的基因)所觀察到的植物提高的干旱抗性。添加新煙堿類化合物或6-氯煙酸后，可在所述測定法中觀察到根伸長的類似效應(yīng)。新煙堿類的使用對根生長深度的效應(yīng)與昆蟲的存在無關(guān)，所述昆蟲是上述新煙堿類的靶標(biāo)。因此，該效應(yīng)也與植物或植物細胞或長成植物的種子的脅迫耐受性(特別是與低氧或無氧相關(guān)的脅迫耐受性)的生物化學(xué)改良相關(guān)。因此，在第一個實施方案中，本發(fā)明指向脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件的耐受性的用途。本文使用的“低氧或無氧條件”是指植物細胞、植物或這類植物的部分所暴露的條件，其中氧的可用性低或非常低。無氧條件是指幾乎不能獲得氧的條件。一般地，溶解氧濃度低于約2毫克/升的條件被稱為低氧(0. 1毫克/升到2毫克/升)，溶解氧低于0. 1毫克/升，特別是低于0.05毫克/升的條件被稱為無氧。水中正常溶解的氧濃度為約8毫克/升。土壌中的低氧條件是指氧張カ低的條件，特別是土壤大氣中氧降至低于5%的條件。低氧條件可發(fā)生于植物或植物部分被淹沒吋。低氧條件還可發(fā)生于氧消耗高吋，例如在包含大量微生物代謝過程中的有機碎屑的土壤層中。另外，低氧條件發(fā)生于生長培養(yǎng)基的較深層，其中氧從表面發(fā)生擴散。低氧條件還發(fā)生于土壤較深層，因為氧擴散和導(dǎo)致的氧張カ比表面降低。氧減少的速率取決于土壤的緊密度(compactness) (土壤越緊密，存在的土壤大氣越少)、分解中的有機材料的存在、水含量等。本文使用的“脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因”是指這樣的轉(zhuǎn)基因，即當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因被引入植物細胞或植物中，或在植物細胞或植物中表達時，給細胞或植物提供更好的脅迫耐受性， 所述脅迫耐受性例如通過使用化合物(除草剤、殺真菌劑、殺蟲劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、佐劑、 肥料)、暴露于非生物脅迫(例如干旱、水澇、淹沒、強光條件、強UV輻射、提高的過氧化氫水平、極端(高或低)溫度、臭氧及其他大氣污染物、土壤鹽度或重金屬、低氧、無氧等等)或生物脅迫(例如病原體或害蟲感染，包括真菌感染、病毒感染、細菌感染、昆蟲感染、線蟲感染、支原體感染和支原體樣生物感染等)而被賦予植物。這類脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因可以是如WO 00/04173或EP04077984. 5(在本文引用作為參考)中所述的，能夠降低植物細胞或植物中多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的表達和/或活性的轉(zhuǎn)基因。多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)也稱為多聚(ADP-核糖)轉(zhuǎn)移酶(ADPRT) (EC 2. 4. 2. 30)，是發(fā)現(xiàn)于多數(shù)真核生物中的核酶，所述真核生物包括脊椎動物、節(jié)肢動物、軟體動物、粘菌類(slime mould)、溝編藻類(dinoflagellates)、真菌和除酵母外的其他低等真核生物。所述酶活性也已在大量植物中得到證明(Payne等人，1976 ；Willmitzer和Wagner， 1982 ；Chen 等人，1994 ；0' Farrell, 1995)PARP主要催化來自NAD+的ADP-核糖部分向靶蛋白中谷氨酸殘基的羧基的轉(zhuǎn)化， 以及隨后的ADP-核糖聚合作用。主要的靶蛋白是PARP自身，但是組蛋白、高遷移率類染色體蛋白質(zhì)(high mobility groupchromosomal protein)、拓撲異構(gòu)醇、內(nèi)切核酸醇禾ロDNA 聚合酶也顯示為可受到此修飾。作為具體的實施方案，脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因可包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)被轉(zhuǎn)錄后得到下述RNA分子的DNA區(qū)，所述RNA分子(PARP抑制性RNA分子) 能夠降低植物的內(nèi)源PARP編碼基因的表達；c)參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的DNA區(qū)。所述DNA區(qū)轉(zhuǎn)錄后可產(chǎn)生所謂的反義RNA分子，所述反義RNA分子以轉(zhuǎn)錄方式或轉(zhuǎn)錄后方式降低靶植物或靶植物細胞中PARP編碼基因的表達，所述反義RNA分子包含至少 20或21個連續(xù)的核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與所述植物細胞或植物中存在的PARP編碼基因核苷酸序列的互補序列具有至少95%到100%的序列同一性。所述DNA區(qū)還可產(chǎn)生所謂的有義RNA分子，所述有義RNA分子以轉(zhuǎn)錄方式或轉(zhuǎn)錄后方式降低靶植物或靶植物細胞中PARP編碼基因的表達，所述有義RNA分子包含至少20 或21個連續(xù)的核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與所述植物細胞或植物中存在的PARP編碼基因的核苷酸序列具有至少95%到100%的序列同一性。然而，約20nt的PARP編碼區(qū)的反義或有義RNA區(qū)的最小核苷酸序列可以包含在更大的RNA分子中，所述更大RNA分子的大小在20nt到與靶基因尺寸相等的長度間變化。因此，所述反義或有義核苷酸區(qū)可以是約21nt到約5000nt長，例如長度為21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt 或甚至約 5000nt 或更長。另外，本發(fā)明
的目的不要求所使用的抑制性PARP RNA分子的核苷酸序列或轉(zhuǎn)基因的編碼區(qū)與內(nèi)源PARP 基因完全相同或互補，所述內(nèi)源PARP基因的表達被靶向以在植物細胞中降低。序列越長， 對整體序列同一性的要求越不嚴格。因此，有義或反義區(qū)可以具有與內(nèi)源PARP基因或其互補序列的核苷酸序列約40%或50%或60%或70%或80%或90%或100%的整體序列同一性。然而如前文所述，反義或有義區(qū)應(yīng)當(dāng)包含20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其與內(nèi)源 PARP基因的核苷酸序列具有約100%的序列同一性。優(yōu)選地，約100%序列同一性的一段序列應(yīng)當(dāng)是約50,75或IOOnt0就本發(fā)明的目的而言，以百分比表示的兩個相關(guān)核苷酸序列的“序列同一性”是指兩個最佳比對的序列中具有相同殘基的位置數(shù)除以所比較的位置數(shù)(X100%)?？瘴槐徽J為是具有不相同殘基的位置，即ー個序列存在殘基而另ー個序列中不存在該殘基的比對中的位置。兩個序列的比對通過Needleman和mmsch算法(Needleman和1Wunsch 1970)計算機輔助序列比對進行，可使用標(biāo)準軟件程序如GAP (其為Wisconsin Package 10. 1版本 (Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，美國)的一部分)，使用默認評分矩陣 (空位產(chǎn)生罰分50和空位延伸罰分3)來便利地進行。應(yīng)當(dāng)明白一旦參照相應(yīng)DNA分子的核苷酸序列定義RNA分子的核苷酸序列吋，核苷酸序列中的胸腺嘧啶⑴應(yīng)當(dāng)用尿嘧啶⑶代替。本申請的上下文會明確是參照用RNA 還是DNA。上述轉(zhuǎn)基因降低內(nèi)源PARP基因表達的效力可以通過包含DNA元件而被進ー步增強，所述DNA元件導(dǎo)致異常的、未多聚腺苷酸化的PARP抑制性RNA分子的表達。適用于該目的的一個這類DNA元件為如W000/01133A1中所述的編碼自我剪接核酶的DNA區(qū)。如WO 99/53050A1中所述，上述轉(zhuǎn)基因降低植物細胞內(nèi)源PARP基因表達的效カ還可通過如下方式進ー步增強在ー個植物細胞中同時包括本文所述編碼反義PARP抑制性 RNA分子的轉(zhuǎn)基因和本文所述編碼有義PARP抑制性RNA分子的轉(zhuǎn)基因，其中所述反義和有義PARP抑制性RNA分子能夠通過所述至少20個連續(xù)核苷酸之間的堿基配對形成雙鏈RNA 區(qū)。如在WO 99/53050A1中所進ー步描述的，能夠形成雙鏈RNA區(qū)的有義和反義PARP 抑制性RNA區(qū)可以存在于ー個RNA分子中，優(yōu)選地被間隔區(qū)分離。間隔區(qū)可包含內(nèi)含子序列。這類轉(zhuǎn)基因可如下所述便利地構(gòu)建將反向重復(fù)序列中包含來自分離的或鑒定的內(nèi)源PARP基因的至少20個核苷酸的DNA片段(其表達被靶向降低)與植物可表達的啟動子和參與轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’末端形成區(qū)有效地連接。為了實現(xiàn)這類轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建，可使用WO 02/059294A1中描述的載體。現(xiàn)有的命名法將經(jīng)典的含鋅指的聚合酶稱作PARPl蛋白質(zhì)(和相應(yīng)的parpl基因)，而結(jié)構(gòu)上非經(jīng)典的PARP蛋白質(zhì)現(xiàn)在被稱為PARP2 (和相應(yīng)的parp2基因)，本文使用的“PARP編碼基因”可指二者中的任ー類型。以下的實驗性鑒定證實的和假定的多聚ADP-核糖聚合酶蛋白質(zhì)序列、其部分或同源序列的數(shù)據(jù)庫登錄號(在本文引用作為參考)可以根據(jù)本發(fā)明使用BAD53855(稻 (Oryza sativa)) ；BAD52929(稻)；XP_477671 (稻)；BAC84104(稻)；AAT25850 (玉米(Zea mavs)) ；AAT25849(玉米)；NP 197639(擬南芥)；NP 8δ0165(擬南芥)；NP I88IO7 (擬南芥)；NP_850586(擬南芥)；BAB09119 (擬南芥)；AAD20677 (擬南芥)；Ql 1207(擬南芥)； C84719(擬南芥)；T51353(擬南芥)；Τ01311(擬南芥)；ΑΑΝ12901 (擬南芥)；AAM13882(擬南芥)；CAB80732(擬南芥)；CAA10482 (擬南芥)；AAC79704 (玉米):AAC19283 (擬南芥)； CAAlO888 (玉米)；CAAlO889 (玉米)；CAA8擬88 (擬南芥)。作為本發(fā)明具體的實施方案，降低PARP基因表達的基因可包含以下有效連接的 DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)被轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生RNA分子的DNA區(qū)，所述RNA分子包含a.反義核苷酸序列，其包含至少約20個連續(xù)的核苷酸，所述連續(xù)的核苷酸與選自以下的約20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列具有約96%的序列同一性SEQ ID 1 (擬南芥 parpl編碼區(qū))、SEQ ID 2 (擬南芥parp 2編碼區(qū))、SEQ ID 3 (玉米parpl編碼區(qū))、SEQ ID 4 (另一玉米parpl編碼區(qū))、SEQ ID 5 (玉米parp2編碼區(qū))或SEQ ID 6 (棉花parp2 部分cDNA)的核苷酸序列或編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)具有與所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列。b.有義核苷酸序列，其包含至少約20個與反義核苷酸序列互補的核苷酸。因此， 有義核苷酸序列可包含至少約20個連續(xù)核苷酸的序列，所述序列與選自以下的約20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列具有約96%的序列同一性SEQ ID 1 (擬南芥parpl編碼區(qū))、SEQ ID 2 (擬南芥parp 2編碼區(qū))、SEQ ID 3 (玉米parpl編碼區(qū))、SEQ ID 4 (另一玉米parpl 編碼區(qū))、SEQ ID5 (玉米parp2編碼區(qū))或SEQ ID 6 (棉花parp2部分cDNA)的核苷酸序列或編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)具有與所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列；其中有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA分子(dsRNA)；c)用于轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的DNA區(qū)。然而，應(yīng)當(dāng)明白可使用如WO 00/04173或EP 04077984. 5中描述的其他降低PARP
基因表達的基因。在本發(fā)明的另ー實施方案中，脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因可以是能夠降低植物或植物細胞的PARG編碼基因表達和/或活性的轉(zhuǎn)基因，如W02004/090140 (在本文引用作為參考) 中所述。PARG (多聚(ADP-核糖)糖原水解酶；E. C. 3. 2. 1. 143)通過其外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶活性(PARG)將聚(ADP-核糖)聚合物轉(zhuǎn)化為游離的ADP-核糖。在植物中，通過基于基因圖譜對野生型基因的克隆而鑒定了聚(ADP-核糖)糖原水解酶在突變體中失活，所述突變體受到擬南芥中時鐘控制基因轉(zhuǎn)錄和從植物性生長到開花的光周期依賴性轉(zhuǎn)換(tej)的影響。該基因的核苷酸序列可以在登錄號AF394690(Panda 等人，2002 Dev. Cell. 3,51-61 ；SEQ ID No 7)下從核苷酸數(shù)據(jù)庫中獲得。其他來自植物的植物PARG編碼基因的核苷酸序列以及從其他植物分離其他 PARG編碼基因及其變體的方法可見于WO 2004/090140A2,該核苷酸序列例如來自馬鈴薯 (Solanum tuberosum)的 PARG 基因(SEQ ID No8)；稻(SEQ ID No 9)或玉米(SEQ ID No 10)。因此，在一個實施方案中，被改造為抗脅迫的植物或植物細胞可包含以下有效連
13接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)當(dāng)被轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生抑制性RNA分子的DNA區(qū)，所述RNA分子包含i.反義核苷酸區(qū)，其包含至少約20個連續(xù)的核苷酸，所述連續(xù)的核苷酸與選自以下的約20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列具有至少96%的序列同一性編碼植物PARG蛋白的核苷酸序列(例如SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)的互補序列，或編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)具有與所述核苷酸序列相似或相同的氨基酸序列；或ii.有義核苷酸區(qū)，其包含至少約20個選自以下的連續(xù)核苷酸編碼植物PARG蛋白質(zhì)的核苷酸序列(例如SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)，或編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)具有與所述核苷酸序列相似或相同的氨基酸序列； 或iii.如i)或ii)所述的反義和有義核苷酸序列，其中所述反義和有義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA分子；c)參與轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的DNA區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將立刻可以明白，有義和反義核苷酸序列或dsRNA分子的長度， 以及ParG抑制性RNA分子的序列同一性的其他參數(shù)可如上所述用于PARP抑制性RNA分子。本發(fā)明的另ー實施方案中，脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因可以是編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的轉(zhuǎn)基因。因此，脅迫耐受性增強基因可包含以下如EP 04077624. 7中所述(在本文引用作為參考)的有效連接的DNA分子a)植物可表達的啟動子；b)編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的DNA區(qū)，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、畑酸單核苷酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶；和c)參與轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化的3’末端區(qū)。本文使用的“煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶”是這樣的酶， 即當(dāng)將其引入植物中、與合適的調(diào)控元件(例如植物可表達的啟動子和終止子區(qū))連接后能夠在植物細胞中被轉(zhuǎn)錄并翻譯而產(chǎn)生有功能的NAD補救合成途徑的酶。該酶包括得自植物來源的來自NAD補救合成的酶(和編碼基因)，以及得自酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cereviseae))或得自其他酵母或真菌的酶。認為后面的蛋白質(zhì)甚至可更適用于本發(fā)明的方法，因為它們較不可能受到酶反饋調(diào)節(jié)等，而類似的來自植物的酶可受到所述調(diào)節(jié)。參與NAD補救合成途徑的酶包括以下-畑酰胺酶(EC3. 5. 1. 19)，其催化煙酰胺的酰胺基水解，從而釋放煙酸根和NH3。 該酶也已知為煙酰胺脫氨酶、畑酰胺酰胺酶、YNDase或煙酰胺酰胺水解酶；-煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.2. 11)，其也已知為煙酸核糖核苷酸酶、 煙酸單核苷酸糖原水解酶；煙酸單核苷酸焦磷酸化酶；煙酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶；其催化以下反應(yīng)煙酸鹽/酷-D-核糖核苷酸+ ニ磷酸鹽=煙酸鹽/酷+5-磷酸-α -D核糖1_ ニ磷酸鹽-煙酸核苷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶(EC2. 7. 7. 18)也已知為去酰胺-NAD+焦磷酸化酶； 煙酸單核苷酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶；去酰胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸化酶；NaMT-ATase ； 煙酸單核苷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶；其催化以下反應(yīng)ATP+煙酸核糖核苷酸=ニ磷酸鹽+去酰胺基-NAD+-NAD-合酶(EC 6. 3. 1. 5)，也已知為NAD合成酶；NAD+合酶；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶；二磷酸吡啶核苷酸合成酶；其催化以下反應(yīng)去酰胺基-NAD++ATP+NH3= AMP+ ニ磷酸鹽 +NAD+在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼NAD補救合成途徑的植物功能酶的DNA區(qū)可包含來自SEQ ID Noll、12、13、14或15的核苷酸序列或編碼下述蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)具有與上述核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)相似或相同的氨基酸序列。如Hunt等，2004所述，這些酶的植物同源物已被鑒定，且這些DNA序列可被用于相似的效應(yīng)(Hunt等人，2004，New Phytologistl63 (I) :31-44)。經(jīng)鑒定的DNA序列具有以下的登錄號煙酰胺酶為 At5g23220(SEQ ID No 16) ；At5g23230 (SEQ ID No 17)和 At3gl6190(SEQ ID No 18)；煙酸鹽 / 酯磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶為 At4g36940 (SEQ ID No 19)、 At2g23420 (SEQ ID No20)，煙酸單核苷酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶為 At5g55810 (SEQ ID No 21), NAD 合成酶為 Atlg55090(SEQ ID No 22)。然而，應(yīng)當(dāng)明白被改造為抗脅迫的植物也可包含這些核苷酸序列的變體，其包括插入、缺失和取代。同樣的，可使用來自除釀酒酵母以外物種的所述核苷酸序列的同源物。 這些包括但不僅限于來自植物的核苷酸序列，和編碼具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及這類核苷酸序列的變體。所述核苷酸序列的變體與經(jīng)鑒定的核苷酸序列(其編碼來自NAD補救補救途徑的酶，例如序列表中鑒別的序列)應(yīng)具有優(yōu)選至少約80 %，或85 %或90 %或95 %的序列同一性。優(yōu)選這些變體將編碼功能性蛋白質(zhì)，其具有與來自NAD補救途徑的酶相同的酶活性。閱讀上文對脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件耐受性的本發(fā)明用途的描述后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會立刻明白可使用對應(yīng)這類脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因的內(nèi)源基因的變體獲得相似的效應(yīng)，所述變體使得帶有這類變體的植物細胞或植物有更高的脅迫耐受性。舉例而言，植物內(nèi)源parp2基因的變體(其具有更低的表達水平， 并給具有該變體的植物提供提高的脅迫耐受性)可以以與降低內(nèi)源parp2基因表達的轉(zhuǎn)基因相似的方式使用。這類變體基因可通過育種技術(shù)被引入植物細胞或植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會明白不同脅迫耐受性增強基因或轉(zhuǎn)基因的表達可引起一群不同的事件，這顯示不同的效應(yīng)分布——從幾乎沒有效應(yīng)到非常顯著的效應(yīng)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然能夠區(qū)分、鑒別或分離最適應(yīng)需要的群體代表。另ー實施方案本發(fā)明提供用于促進植物根穿透進入生長培養(yǎng)基或土壌的方法，其包括對植物提供脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因或這些脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因的內(nèi)源變體，如本文在其不同的實施方案中所述的那些。本文使用的“植物根伸長”或“植物根穿透進入生長培養(yǎng)基或土壌”是指從生長培養(yǎng)基表面到根的最低點所測量的根在固體生長培養(yǎng)基(包括土壌)中生長的深度(也參見圖1)。
通常，“植物根伸長或穿透的提高”是指從培養(yǎng)基表面到根生長的最低點所測量的生長培養(yǎng)基中根生長深度的至少統(tǒng)計學(xué)顯著的提高，其也可測量為野生型參照植物根深與被改造為脅迫耐受的植物根深的比較中的差異，或測量為用特別的化合物處理的植物根深與未處理植物根深的比較中的差異。為了正確理解本發(fā)明，明白以下內(nèi)容是重要的通過本發(fā)明方法達到的植物根系更深地穿透進入生長培養(yǎng)基或土壌中不等于根系在體積或干重或鮮重上的提高。事實上， 根系的體積可被顯著提高，但是根全部處在生長培養(yǎng)基或土壌表面下非常淺表處。相反，根據(jù)本發(fā)明處理的植物根在尺寸、體積、重量或甚至長度上可以是相等的，但是更深地伸入生長培養(yǎng)基或土壌的表面下。本文使用的“生長培養(yǎng)基”旨在涉及適用于植物生長的任何培養(yǎng)基，包括土壌。這類培養(yǎng)基包括固化的或凝膠化的液體，例如水-瓊脂、泥炭(peat)、草炭(turf)、不同類型
的土壌等。在另ー實施方案中，本發(fā)明指向新煙堿類化合物提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件耐受性的用途。因此，本發(fā)明提供用來提高植物細胞、植物或種子對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括對植物細胞、植物、種子或植物的生境或?qū)ιL培養(yǎng)基使用有效量的式(I)的新煙堿類化合物的步驟。
權(quán)利要求
1.用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括步驟 a)對所述植物細胞或所述植物的細胞提供脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因；其中所述脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因選自1.能夠降低植物內(nèi)源PARP基因表達的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，特別是其中所述轉(zhuǎn)基因編碼PARP抑制性RNA分子； .能夠降低植物內(nèi)源PARG基因表達的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，特別是其中所述轉(zhuǎn)基因編碼PARG抑制性RNA分子；或iii.編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、畑酸單核苷酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
2.用于促進植物根穿透進入生長培養(yǎng)基的方法，其包括步驟a)對所述植物細胞或所述植物的細胞提供脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因；其中所述脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因選自i.能夠降低植物內(nèi)源PARP基因表達的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，特別是其中所述轉(zhuǎn)基因編碼PARP抑制性RNA分子； .能夠降低植物內(nèi)源PARG基因表達的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，特別是其中所述轉(zhuǎn)基因編碼PARG抑制性RNA分子；或iii.編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶的脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、畑酸單核苷酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述脅迫耐受性增強基因編碼PARP抑制性RNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區(qū)，其包含選自SEQID No 1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQ ID No 6的核苷酸序列的20個連續(xù)核苷酸中的至少19個；和c)轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化DNA區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區(qū)，其包含選自SEQID No 1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQ ID No 6的核苷酸序列的互補序列的20個連續(xù)核苷酸中的至少 19個；和c)轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化DNA區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區(qū)，所述RNA分子包含i.有義核苷酸序列，其包含選自SEQ ID No 1的核苷酸序列、SEQ IDNo 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或 SEQ ID No 6的核苷酸序列的20個連續(xù)核苷酸中的至少19個；和 .反義核苷酸序列，其包含與所述有義核苷酸序列中所述至少20個連續(xù)核苷酸互補的核苷酸序列，其中所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區(qū)；以及c)轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化DNA區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述反義核苷酸序列與所述有義核苷酸序列具有約 95 %的序列同一性或完全相同。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼ParG抑制性RNA分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區(qū)，其包含選自SEQID No7的核苷酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的20個連續(xù)核苷酸中的至少19個；和c)轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化DNA區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區(qū)，其包含選自SEQID No7的核苷酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的互補序列的20個連續(xù)核苷酸中的至少19個；和c)轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化DNA區(qū)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達的啟動子；b)編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區(qū)，所述RNA分子包含i.有義核苷酸序列，其包含選自SEQ ID No 7的核苷酸序列、SEQ IDNo 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的20個連續(xù)核苷酸中的至少19個；和 .反義核苷酸序列，其包含與所述有義核苷酸序列中所述至少20個連續(xù)核苷酸互補的核苷酸序列，其中所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區(qū)；和c)轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化DNA區(qū)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述反義核苷酸序列與所述有義核苷酸序列具有約 95 %的序列同一性或完全相同。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑的植物功能酶，所述酶選自煙酰胺酶、煙酸鹽/酯磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、畑酸單核苷酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQ ID 11的核苷酸序列、SEQ ID 12的核苷酸序列、SEQ ID 13的核苷酸序列、SEQ ID 14的核苷酸序列、SEQ ID 15的核苷酸序列、SEQ ID 16的核苷酸序列、SEQ ID 17的核苷酸序列、SEQ ID 18的核苷酸序列、SEQ ID 19的核苷酸序列、SEQ ID 20的核苷酸序列、SEQID 21的核苷酸序列或SEQ ID 22的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任ー項的方法，其包括另ー步驟，即對所述植物或其生境， 或?qū)λ鲋参锏姆N子使用有效量的式(I)化合物
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述式(I)化合物中由Het表示的所述雜環(huán)代表被氯取代的吡啶-3-基雜環(huán)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述(I)式的化合物是吡蟲啉或噻蟲啉。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任ー項的方法，其還包括步驟將有效量的6-氯煙酸提供給所述植物的細胞。
19.用于提高植物細胞或植物對低氧或無氧條件耐受性的方法，其包括步驟將有效量的6-氯煙酸提供給所述植物細胞或植物。
20.用于促進植物根穿透進入生長培養(yǎng)基的方法，其包括步驟將有效量的6-氯煙酸提供給所述植物的細胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的方法，其中通過對所述植物或其生境或?qū)λ鲋参锏姆N子使用有效量的式(I)化合物而對所述植物細胞或植物提供所述6-氯煙酸
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中包含氯吡啶側(cè)鏈的新煙堿類在植物降解過程中釋放所述6-氯煙酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述新煙堿類是吡蟲啉或噻蟲啉。
24.根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的方法，其中將所述6-氯煙酸直接應(yīng)用于所述植物或其所述生境、所述植物細胞或所述種子。
25.以下物質(zhì)用于促進植物根伸入生長培養(yǎng)基中的用途a)外源DNA，其包含脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因或?qū)?yīng)于這類脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因的內(nèi)源基因的變體，和/或b)6-氯煙酸或式(I)化合物
26.以下物質(zhì)用于提高植物對低氧或無氧條件耐受性的用途a)外源DNA，其包含脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因或?qū)?yīng)于這類脅迫耐受性增強轉(zhuǎn)基因的內(nèi)源基因的變體，和/或b) 6-氯煙酸或式(I)化合物
27.權(quán)利要求沈的用途，其中通過暴露于水澇、浸沒或淹沒將所述低氧或無氧條件帶給所述植物。
全文摘要
本發(fā)明提供用于提高植物對低氧或無氧條件抗性的方法。這類方法可被用于促進植物根在生長培養(yǎng)基中或進入土壤中的穿透。本發(fā)明的方法可包括提供有脅迫耐受性基因的植物?？赏ㄟ^對植物使用化合物，包括新煙堿類化合物來獲得相似的效應(yīng)。
文檔編號C12N15/11GK102533846SQ20121000363
公開日2012年7月4日 申請日期2006年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月15日
發(fā)明者M·德布洛克, M·梅茨拉夫 申請人:拜爾作物科學(xué)公司