專利名稱：用于增強(qiáng)基因表達(dá)的來(lái)自核糖體蛋白啟動(dòng)子的核酸片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于改進(jìn)篩選具有高表達(dá)水平的宿主細(xì)胞的手段和方法。
背景技術(shù)：
生物活性蛋白在各種宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，從細(xì)菌和酵母菌到哺乳動(dòng)物細(xì)胞。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)需要某種翻譯后修飾如糖基化以發(fā)揮適當(dāng)功能時(shí)，優(yōu)選以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。通常，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)由編碼目的蛋白的所謂的“轉(zhuǎn)基因”表達(dá)。為確保篩選出正確的產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞，將編碼目的基因的轉(zhuǎn)基因和編碼可篩選標(biāo)記的第二轉(zhuǎn)基因相偶聯(lián)，通常它們位于相同的載體上。常見(jiàn)的問(wèn)題是篩選的嚴(yán)格性很低，這就意味著為了在毒性篩選條件下存活，細(xì)胞不得不只產(chǎn)生很少量的選定蛋白。如果細(xì)胞的篩選僅需要可篩選標(biāo)記蛋白的有限表達(dá)，那么這也指示了轉(zhuǎn)基因蛋白的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)基因蛋白的低表達(dá)通常伴隨著可篩選標(biāo)記蛋白的低表達(dá)水平。這顯然是低篩選嚴(yán)格性帶來(lái)的不良負(fù)面影響。
使用博萊霉素篩選標(biāo)記能夠看到篩選嚴(yán)格性的改善。這是因?yàn)椴┤R霉素篩選蛋白不是以酶的形式發(fā)揮作用，而是按化學(xué)計(jì)量與兩個(gè)博萊霉素篩選分子結(jié)合，但不對(duì)它們進(jìn)行進(jìn)一步加工的形式發(fā)揮作用。因此，與單個(gè)分子就能夠催化許多篩選劑分子失活的酶促可篩選標(biāo)記蛋白相比，細(xì)胞必須產(chǎn)生更多的化學(xué)計(jì)量上的可篩選標(biāo)記(例如，博萊霉素篩選蛋白)的分子。當(dāng)與目的基因偶聯(lián)時(shí)，化學(xué)計(jì)量上的可篩選標(biāo)記的較高嚴(yán)格性通常導(dǎo)致較高水平的mRNA和/或目的基因產(chǎn)物的表達(dá)。
由于在篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆時(shí)僅能針對(duì)用于可篩選標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行篩選，而不能針對(duì)目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行篩選，因此，優(yōu)選的是，目的基因的表達(dá)和可篩選標(biāo)記的表達(dá)水平有直接的聯(lián)系。實(shí)現(xiàn)該目的的一種方法是通過(guò)將IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，InternalRibosome Entry Site)序列置于目的基因和編碼可篩選標(biāo)記的基因之間。這就產(chǎn)生了單個(gè)雙順?lè)醋觤RNA，雙順?lè)醋觤RNA翻譯目的基因產(chǎn)物和篩選蛋白(Rees et al.，1996，Biotechniques20:102-110)o因此，篩選標(biāo)記的高水平表達(dá)(例如，通過(guò)使用高嚴(yán)格性標(biāo)記)能夠和目的基因產(chǎn)物的高水平表達(dá)直接耦合。這是一種公認(rèn)的且常用的用于篩選表達(dá)相對(duì)高水平目的基因產(chǎn)物的克隆的方法(參見(jiàn)例如W003/106684、W02006/005718和W02007/096399)。
通過(guò)使用具有能夠減弱但不會(huì)完全破壞篩選標(biāo)記活性的突變的可篩選標(biāo)記，可以使篩選嚴(yán)格性進(jìn)一步加強(qiáng)。在相同的篩選條件下，較高水平的受損篩選蛋白需要與野生型篩選蛋白進(jìn)行比較。當(dāng)通過(guò)IRES序列與目的基因相偶聯(lián)時(shí)，受損篩選標(biāo)記的較高mRNA水平確保了存在更多能用于翻譯的目的基因的mRNA(參見(jiàn)例如W001/32901和W02006/048459)。
在另一個(gè)高篩選嚴(yán)格性體系的實(shí)例中，通過(guò)使用可篩選標(biāo)記蛋白的非優(yōu)選的、非ATG翻譯起始密碼子，篩選標(biāo)記蛋白的翻譯起始嚴(yán)重受損。這些篩選體系被稱為“STAR-Select”(Otte et al.(2 007)Biotechnol.Progr.23(4):801-807;W02006/048459and W02007/096399)。
最近，本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種新的嚴(yán)格的篩選原則，通過(guò)將短肽的編碼序列直接置于篩選標(biāo)記的上游，從而使篩選標(biāo)記蛋白的翻譯起始嚴(yán)重受損，因此，需要核糖體在篩選標(biāo)記蛋白的翻譯起始密碼子處重新起始翻譯(尚未授權(quán)的申請(qǐng)PCT/NL2010/050367)。在這個(gè)體系中，篩選的嚴(yán)格性可以通過(guò)增加短肽的長(zhǎng)度進(jìn)行微調(diào):當(dāng)短肽變長(zhǎng)時(shí)，翻譯機(jī)制在可篩選標(biāo)記蛋白的翻譯起始密碼子處重新起始的難度將會(huì)增加。與博萊霉素可篩選標(biāo)記蛋白結(jié)合時(shí),這種嚴(yán)格篩選體系被稱為“ppZeo篩選體系”(PP=小肽(petite peptides))。
然而，高嚴(yán)格性篩選體系的一個(gè)問(wèn)題是:轉(zhuǎn)化后獲得的克隆數(shù)量顯著降低了，甚至低至幾乎不能獲得克隆的水平。該問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)在表達(dá)載體中插入表達(dá)增強(qiáng)序列(例如，位點(diǎn)控制區(qū)(Locus Control Regions)) (LCR;Needham et al., 1995.Protein ExprPurif6:124-131)或 STARs (W003/004704、W003/106674、W003/106684、W02006/005718、W02006/048459和W02007/096399)得以解決。W02006/123097公開(kāi)了來(lái)自編碼核糖體蛋白S3和Sll (分別為RPS3和RPSlI)基因的啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段，當(dāng)與含有異源啟動(dòng)子的表達(dá)盒相連時(shí)，能夠通過(guò)表達(dá)盒中的異源啟動(dòng)子增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。
然而，本領(lǐng)域仍需要用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高嚴(yán)格性篩選的改進(jìn)的手段和方法，以實(shí)現(xiàn)克隆的高產(chǎn)和/或目的基因產(chǎn)物的高表達(dá)水平。具體地，仍需要進(jìn)一步改善的能夠增強(qiáng)含有高嚴(yán)格可篩選標(biāo)記的表達(dá)盒的表達(dá)的DNA片段。發(fā)明內(nèi)容
定義
本文中的“核酸構(gòu)建體”指的是使用重組DNA技術(shù)人工制造的核酸分子。核酸構(gòu)建體是單鏈或雙鏈的核酸分子，它已經(jīng)被修飾并包括以一定方式組合和并列的核酸片段，它們?cè)谧匀唤缰胁⒉淮嬖?。核酸?gòu)建體通常是一個(gè)“載體”，也就是用于將創(chuàng)建的外源DNA送遞至宿主細(xì)胞中的核酸分子。常見(jiàn)的載體類型來(lái)源于天然存在的質(zhì)粒、噬菌體和病毒。通常載體進(jìn)一步包括遺傳元件例如在一種或多種宿主細(xì)胞等中有功能的可篩選標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)，以促進(jìn)它們?cè)诜肿涌寺≈械膽?yīng)用。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”通常用于指在細(xì)胞內(nèi)特定的核酸產(chǎn)物(優(yōu)選特定的RNA產(chǎn)物)或特定的蛋白或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。如果涉及RNA產(chǎn)物，它指的是轉(zhuǎn)錄過(guò)程。如果涉及蛋白質(zhì)，它指的是轉(zhuǎn)錄、翻譯和任選的翻譯后修飾過(guò)程。如果涉及分泌蛋白，它指的是轉(zhuǎn)錄、翻譯和任選的翻譯后修飾(例如糖基化、二硫鍵的形成等)、隨之分泌的過(guò)程。如果涉及多聚體蛋白，它任選地包括多肽單體的多聚體結(jié)構(gòu)的組裝。
一種類型的核酸構(gòu)建體是“表達(dá)構(gòu)建體”或“表達(dá)盒”或“表達(dá)載體”。這些術(shù)語(yǔ)指的是能夠影響宿主細(xì)胞或與該種序列相容的宿主生物體中的基因的表達(dá)的核苷酸序列。表達(dá)構(gòu)建體、表達(dá)盒或表達(dá)載體通常至少包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控序列和任選的3’轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。也可以存在必要的或有利于實(shí)現(xiàn)表達(dá)的附加因子，例如表達(dá)增強(qiáng)子元件。
術(shù)語(yǔ)“單順?lè)醋踊颉北欢x為能夠提供編碼一個(gè)基因產(chǎn)物的RNA分子的基因?！岸囗?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元”(也被稱為多順?lè)醋踊?被定義為能夠提供編碼至少兩個(gè)基因產(chǎn)物的RNA分子的基因。術(shù)語(yǔ)“雙順?lè)醋踊?bicistronic gene)”(也被稱為“雙順?lè)醋踊颉?被定義為能夠提供編碼兩個(gè)基因產(chǎn)物的RNA分子的基因。因此雙順?lè)醋踊虬ㄔ诙囗樂(lè)醋踊虻亩x內(nèi)。
本文中的術(shù)語(yǔ)“肽”指的是包括由肽鍵連接的氨基酸鏈的任何分子。因此術(shù)語(yǔ)“肽”包括寡肽、多肽和蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括多聚體蛋白，不限于特定的作用方式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來(lái)源。本文使用的“多肽”通常包括至少五個(gè)由肽鍵連接的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”或“多肽”可以互換使用。因此，蛋白質(zhì)的“片段”或“部分”仍然可被稱為“蛋白質(zhì)”。所使用的術(shù)語(yǔ)“分離蛋白質(zhì)”指的是不再處于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如在試管內(nèi)(in vitro)或在重組(真菌或植物)宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“肽”也包括經(jīng)翻譯后修飾(例如糖基化、乙?；⒘姿峄?的肽。本發(fā)明使用的目的“基因產(chǎn)物”或“轉(zhuǎn)錄單元”包括染色體DNA、cDNA、人造DNA、它們的組合等。“目的基因產(chǎn)物”可以是任何基因產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)、RNA1、shRNA等。目的蛋白的非限制性實(shí)例是酶、免疫球蛋白鏈、治療性蛋白例如抗癌蛋白質(zhì)或診斷蛋白質(zhì)。含有幾個(gè)順?lè)醋拥霓D(zhuǎn)錄單元被轉(zhuǎn)錄為單個(gè)mRNA。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指的是將多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式連接。當(dāng)核酸和其他核酸序列以有功能的方式連接時(shí)，它是“可操作地連接”。例如，如果轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列能夠影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，它就是與編碼序列可操作地連接。可操作地連接意味著被連接的DNA序列通常是連續(xù)的，且當(dāng)必須連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)，應(yīng)當(dāng)連續(xù)并處于讀碼框內(nèi)。
“表達(dá)控制序列”指的是能夠調(diào)控與其可操作地連接的核苷酸序列的表達(dá)的核酸序列。當(dāng)表達(dá)控制序列能夠控制和調(diào)控核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯時(shí)，所述表達(dá)控制序列與所述核苷酸之間就是“可操作地連接”的。因此，表達(dá)控制序列可以包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、轉(zhuǎn)錄終止子、位于編碼蛋白質(zhì)基因之前的起始密碼子、內(nèi)含子的剪接信號(hào)和終止密碼子。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制序列”意指至少包括被設(shè)計(jì)用于影響表達(dá)的序列，也包括附加的有利組件。例如，前導(dǎo)序列和融合伴侶序列都是表達(dá)控制序列。該術(shù)語(yǔ)也包括經(jīng)設(shè)計(jì)從而從序列中移除框內(nèi)外的非必需的潛在起始密碼子的核酸序列。它也包括經(jīng)設(shè)計(jì)從而移除非必需的潛在剪接位點(diǎn)的核酸序列。它包括序列或聚腺苷酸化序列(PA)，所述聚腺苷酸化序列指導(dǎo)附加的PolyA尾部，也就是位于mRNA的3’ -端的一串腺嘌呤殘基(這一序列被稱為polyA序列)。也可以通過(guò)設(shè)計(jì)來(lái)增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。影響轉(zhuǎn)錄和翻譯穩(wěn)定性的表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子，以及影響翻譯的序列例如Kozak序列，已知存在于真核(宿主)細(xì)胞中。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”指的是用來(lái)控制一種或多種編碼序列的轉(zhuǎn)錄的核酸片段，相對(duì)于編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向而言它位于上游，其結(jié)構(gòu)特征是存在依賴DNA的RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其他DNA序列，所述其他DNA序列包括但 并不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、阻抑蛋白和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的直接或間接地調(diào)控由啟動(dòng)子開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄量的任何其他核苷酸序列?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中具有活性的啟動(dòng)子?！翱烧T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是受生理或發(fā)育例如應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑調(diào)控的啟動(dòng)子?！敖M織特異性”啟動(dòng)子僅在特定類型的組織或細(xì)胞中具有活性。
本文中使用的“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)”或“IRES”指的是這樣的元件:它促使內(nèi)部核糖體直接進(jìn)入順?lè)醋?蛋白質(zhì)編碼區(qū)域)的翻譯起始密碼子(也稱作起始密碼子)，從而引起不依賴于帽結(jié)構(gòu)(cap-1ndependent)的基因翻譯。參見(jiàn)，例如Jackson RJ, HowellM T, Kaminski A (1990) Trends Biochem Sci 15 (12):477-83)和 Jackson R J andKaminski, A.(1995) RNAl (10):985-1000。本發(fā)明包括使用任何不依賴于帽結(jié)構(gòu)的翻譯起始序列，尤其是任何能夠促使內(nèi)核糖體直接進(jìn)入順?lè)醋悠鹗济艽a子的IRES元件。本文所使用的“在IRES翻譯控制下”指的是翻譯和IRES相聯(lián)系并以不依賴于帽結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“ IRES”包括IRES序列的功能性變體，只要該變體能夠促使內(nèi)核糖體直接進(jìn)入順?lè)醋拥钠鹗济艽a子即可。
本文中使用的“順?lè)醋印敝傅氖嵌嗪塑账嵝蛄?DNA)區(qū)段，包括產(chǎn)生單多肽鏈的所有信息。
本文中“序列同一性”被定義為兩個(gè)或多個(gè)氨基酸(多肽或蛋白質(zhì))序列或兩個(gè)或多個(gè)核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系，這種關(guān)系是通過(guò)比較序列來(lái)確定的。本領(lǐng)域中，“同一性”也指的是氨基酸或核酸序列之間的序列相關(guān)性的程度，這種情況下可以通過(guò)匹配成串的序列來(lái)確定同一性。通過(guò)將氨基酸序列和一個(gè)多肽的保守氨基酸置換與另一多肽序列比較來(lái)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的“相似性”?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴焙苋菀淄ㄟ^(guò)已知的方法計(jì)算出來(lái)。術(shù)語(yǔ)“序列同一性”或“序列相似性”指的是:在最佳比對(duì)條件下，優(yōu)選在序列全長(zhǎng)(比較時(shí)至少是最短序列)上，使匹配的數(shù)量最大化，使間隙的數(shù)量最小化時(shí)，例如在默認(rèn)參數(shù)下使用ClustalWa.83)、GAP或BESTFIT軟件進(jìn)行比對(duì)時(shí)，兩個(gè)(多)肽或兩個(gè)核苷酸序列之間具有至少一定百分比的序列同一'I"生(如本文所定義)。GAP使用了 Needleman和Wunsch全局比對(duì)算法來(lái)比對(duì)整條鏈上的兩個(gè)序列，使匹配的數(shù)量最大化，使間隙的數(shù)量最小化。通常，使用GAP默認(rèn)參數(shù),空格創(chuàng)造罰分(gap creation penalty)=50(核苷酸)/8(蛋白質(zhì)),空格延伸罰分=3 (核苷酸)/2 (蛋白質(zhì))。對(duì)于核苷酸使用的默認(rèn)記分矩陣是nwsgapdna,對(duì)于蛋白質(zhì)使用的默認(rèn)記分矩陣是 Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992，PNAS89, 915-919)。優(yōu)選用于比對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列的多重比對(duì)軟件是ClustalWa.83)，該軟件使用的是blosum矩陣和默認(rèn)設(shè)置(空格開(kāi)放罰分:10，空格延伸罰分:0.05)。序列同一性百分比的序列比對(duì)和記分可以通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)確定，例如GCG Wisconsin Package, 10.3版本，可從Accelrys有限公司，9685斯克蘭頓大道，圣地亞哥，CA92121-3752美國(guó)獲得，或使用開(kāi)放源代碼軟件來(lái)確定，例如“needle”軟件(使用全局Needleman Wunsch算法)或EmbossffIN2.10.0版本的“water”軟件(使用局部Smith Waterman算法),使用和上述GAP相同的參數(shù)，或使用默認(rèn)設(shè)置(對(duì)于“needle”和“water”以及用于蛋白質(zhì)和DNA比對(duì)的默認(rèn)空格開(kāi)放罰分是10.0，默認(rèn)空格延伸罰分是0.5;用于蛋白質(zhì)的默認(rèn)記分矩陣是810%1111162，用于DNA的默認(rèn)記分矩陣是DNAFull)。當(dāng)序列的總長(zhǎng)度相差很多時(shí)，優(yōu)選使用局部對(duì)比例如使用Smith Waterman算法?？梢允褂美鏔ASTA、BLAST等算法通過(guò)檢索公共數(shù)據(jù)庫(kù),來(lái)確定相似性或同一性的百分比。
本發(fā)明的編碼核酸序列的核苷酸序列也可以由它們和本文公開(kāi)的或部分公開(kāi)的特定核苷酸序列雜交(在溫和、優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下)的能力來(lái)確定。本文所述的嚴(yán)格雜交條件被定義為允許核酸序列的至少約25，優(yōu)選約50、75或100個(gè)核苷酸，最優(yōu)選約200個(gè)以上的核苷酸在約65°C的溶液中發(fā)生雜交，所述溶液含有大約IM鹽，優(yōu)選6X SSC或任何其他含有類似離子強(qiáng)度的溶液，并在約65°C的溶液中進(jìn)行洗滌，洗滌溶液含有約0.1M以下的鹽，優(yōu)選0.2 X SSC或任何其他含有類似離子強(qiáng)度的溶液。優(yōu)選雜交過(guò)夜，也就是至少進(jìn)行10小時(shí)，優(yōu)選至少洗滌一小時(shí)，其間洗滌溶液至少更換兩次。這些條件通常使得具有約90%以上的序列同一性的序列發(fā)生特異性雜交。
本文中的溫和雜交條件 被定義為允許核酸序列的至少約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選約200個(gè)以上的核苷酸在約45°C的溶液中發(fā)生雜交，所述溶液含有約IM鹽，優(yōu)選6XSSC或任何其他含有類似離子強(qiáng)度的溶液，在室溫的溶液中進(jìn)行洗滌，洗滌溶液含有約IM鹽，優(yōu)選6 X SSC或任何其他含有類似離子強(qiáng)度的溶液。優(yōu)選雜交過(guò)夜，也就是至少進(jìn)行10小時(shí)，優(yōu)選至少洗滌一小時(shí)，其間洗滌溶液至少更換兩次。這些條件通常使得具有約50%序列同一性的序列發(fā)生特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠改變所述雜交條件以特異性識(shí)別同一性在50 %至90 %之間變化的序列。
編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列對(duì)于宿主細(xì)胞中的密碼子使用的適應(yīng)性由密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)表達(dá)。本文中的密碼子適應(yīng)指數(shù)被定義為在特定宿主細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)的基因的密碼子使用相對(duì)于高表達(dá)基因的密碼子使用的相對(duì)適應(yīng)性的量度。各個(gè)密碼子的相對(duì)適應(yīng)性(w)是各個(gè)密碼子的使用和對(duì)于相同氨基酸的最常用的密碼子的使用之間的比值。CAI指數(shù)被定義為相對(duì)適應(yīng)性值的幾何平均值。非同義密碼子和終止密碼子(依賴于遺傳編碼)不計(jì)算在內(nèi)。CAI值的范圍從O至1，具有較高的CAI值說(shuō)明具有較高比例的最常用的密碼子(參見(jiàn) Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research!^: 1281-1295;還可參見(jiàn)Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res.31 (8):2242-51)。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的核酸是核酸構(gòu)建體，其中編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列可以與啟動(dòng)子以及任選地其他調(diào)控元件(例如終止子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、分泌信號(hào)序列等)可操作地連接。這樣的核酸構(gòu)建體對(duì)于使用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的目的基因產(chǎn)物尤其有用，其中，編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)，如 Ausubel et al."Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishingand ffiley-1nterscience, New York(1987)和 Sambrook and Russell(2001)"MolecularCloning:A Laboratory Manual (3rdedition), Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York中所述。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指的是將多核苷酸元件以有功能 的方式連接。當(dāng)核酸和其他核酸序列以有功能的方式連接時(shí)，它是“可操作地連接”。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子能夠影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，它就是與編碼序列可操作地連接?？刹僮鞯剡B接意味著被連接的DNA序列通常是連續(xù)的，且當(dāng)必須連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)，應(yīng)當(dāng)連續(xù)并處于讀碼框內(nèi)。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將核糖體蛋白L32基因的啟動(dòng)子區(qū)(還稱為60S核糖體蛋白L32、RPL32、RPL32) (SEQ ID NO:1)和如本文中進(jìn)一步定義的部分的特定序列置于表達(dá)載體(包括可操作地連接啟動(dòng)子、在真核宿主細(xì)胞中起作用的編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列以及編碼目的基因產(chǎn)物的可選的開(kāi)放讀碼框)中時(shí)，能夠增加在篩選條件下優(yōu)選嚴(yán)格篩選條件下形成的克隆的數(shù)量(與在嚴(yán)格篩選條件下沒(méi)有該特定序列的相同表達(dá)載體相比，并且還優(yōu)選與在嚴(yán)格篩選條件下沒(méi)有RPL32序列的相同表達(dá)載體相比，但該載體的兩側(cè)與如 TO2006/048459 和 W02007/096399 中描述的 STAR6/67/7 元件相連)。
RPL32編碼的核糖體蛋白為60S亞基的組分。所述蛋白屬于核糖體蛋白的L32E家族，并位于細(xì)胞質(zhì)中。RPL32基因本身及其啟動(dòng)子區(qū)在黑猩猩、犬、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)、果妮(Drosophila)、蚊、秀_ 隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis eIegans)、釀酒酵母(Saccharomycecerevisiae)、阿拉伯芥(Arabidobsis thaliana)、稻和惡性痕原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)中是非常保守的。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，即，含有來(lái)自RPL32啟動(dòng)子區(qū)的序列的表達(dá)構(gòu)建體，可用來(lái)篩選細(xì)胞，優(yōu)選真核細(xì)胞，更優(yōu)選植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)對(duì)可篩選標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行篩選，可以篩選具有目的基因產(chǎn)物高表達(dá)水平的細(xì)胞(與不具有本發(fā)明核苷酸序列的對(duì)照相比)和/或產(chǎn)生大量穩(wěn)定克隆的細(xì)胞(與不具有本發(fā)明核苷酸序列的對(duì)照相比)。隨后或同時(shí)，可以識(shí)別一種或多種篩選出的細(xì)胞，并進(jìn)一步用于表達(dá)高水平的目的基因產(chǎn)物。
本發(fā)明基于可篩選標(biāo)記的受損表達(dá)效率(impaired efficiency ofexpression)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)檢測(cè)可篩選標(biāo)記的表達(dá)，例如通過(guò)測(cè)定在正常的篩選期后存活的克隆的數(shù)量來(lái)檢測(cè)可篩選標(biāo)記的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，有許多參數(shù)可以表示篩選標(biāo)記多肽的表達(dá)水平，例如細(xì)胞耐篩選劑的最大濃度、給定濃度下存活的克隆的數(shù)量、篩選劑存在時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度(倍增時(shí)間)、上述參數(shù)的組合等。通過(guò)使用本發(fā)明，可以識(shí)別具有高水平表達(dá)的可篩選標(biāo)記的細(xì)胞和/或提供大量的細(xì)胞克隆。
第一方面，本發(fā)明涉及一種核酸片段，該核酸片段包括或由與以下核苷酸序列具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性(優(yōu)選地，在它的全長(zhǎng)上)的核苷酸序列組成:i)含有來(lái)自SEQ ID NO:1的至少1001、1187、1195、1250、1500、1750、2000、2500、3000或全部的連續(xù)核苷酸；和ii)含有SEQ ID NO:1的1782-1921位核苷酸殘基(SEQ ID NO:1中1921位為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))。優(yōu)選地，在實(shí)施例1的條件下測(cè)試，當(dāng)所述核酸片段與具有SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的表達(dá)盒直接在表達(dá)盒的上游側(cè)面相連時(shí)，與在表達(dá)盒的上游側(cè)面連接STARs 7和67和在表達(dá)盒的下游側(cè)面連接STAR 7的相同表達(dá)盒(SEQ ID N0:3)相比，產(chǎn)生至少50、75、90、100、101、110、125或150%的克隆數(shù)。
優(yōu)選地，所述核酸片段為包括或由與以下核苷酸序列具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性(優(yōu)選地，在它的全長(zhǎng)上)的核苷酸序列組成的片段:i)含有來(lái)自 SEQ ID NO:1 的至少 1187、1195、1250、1500、1750、2000、2500、3000 或全部的連續(xù)核苷酸；和ii)含有SEQ ID NO:1的1236-2423位核苷酸殘基，否則，片段如上定義。更優(yōu)選地，所述該核酸片段為包括或由與以下核苷酸序列具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性(優(yōu)選地，在它的全長(zhǎng)上)的核苷酸序列組成的片段:i)含有來(lái)自SEQ ID NO:1的至少1750、2000、2500、3000或全部的連續(xù)核苷酸；和ii)含有SEQ ID NO:1的1236-3220位核苷酸殘基或1-2423位核苷酸殘基；否則，片段如上定義。最優(yōu)選地，所述核酸片段為選自由與以下核苷酸序列具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性(優(yōu)選地，在它的全長(zhǎng)上)的核酸片段所組成的組中的片段:包括或由 SEQ ID NO:1 的 1236-2423、1782-3220、1236-3220、1-2013、1-2423 或1-3220位核苷酸殘基組成。
優(yōu)選地，所述核酸片段是分離的核酸片段，這應(yīng)當(dāng)理解為是從自然環(huán)境中分離或純化的片段。優(yōu)選地，所述核酸片段來(lái)自哺乳動(dòng)物的基因組，更優(yōu)選來(lái)自靈長(zhǎng)類動(dòng)物或嚙齒類動(dòng)物的基因組，最優(yōu)選地，所述核酸片段來(lái)自人、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、牛、雞、犬、豚鼠、豬或兔的基因組。優(yōu)選的核酸片段來(lái)自SEQ ID N0:1。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸片段具有不超過(guò)30，000個(gè)核苷酸殘基的長(zhǎng)度，更優(yōu)選地，不超過(guò)20，000、10，000、5000、4500、3750、3600、3500、3000、2 750、2500、2000、1750 或 1500 個(gè)核苷酸殘基。
本發(fā)明的第二方面涉及含有以上定義的核酸片段的核酸構(gòu)建體，其中，片段至少和一個(gè)核苷酸連接，所述核苷酸在片段來(lái)源的基因組中不直接與片段發(fā)生天然連接。優(yōu)選地，所述核酸構(gòu)建體包括一個(gè)以上的與片段連接的非天然狀態(tài)的核苷酸，例如包括一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)或與PCR引物互補(bǔ)的接頭序列(adapter sequences)的一段核苷酸。
更優(yōu)選地，在所述核酸構(gòu)建體中包括以上定義的核酸片段，片段和表達(dá)盒相連接。優(yōu)選地，所述表達(dá)盒至少含有與編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以是如下定義的啟動(dòng)子。所述表達(dá)盒可以進(jìn)一步含有例如如下所述的在真核宿主細(xì)胞中具有功能的編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的核酸片段以“順式(in cis)”的方式發(fā)揮作用。因此，優(yōu)選地，在核酸構(gòu)建體中，本發(fā)明的核酸片段與所述表達(dá)盒或更優(yōu)選地與所述表達(dá)盒的最上游啟動(dòng)子(優(yōu)選地，當(dāng)位于盒上游時(shí))之間的距離在5kb以內(nèi)，更優(yōu)選2kb以內(nèi)，更優(yōu)選Ikb以內(nèi)，最優(yōu)選500bp以內(nèi)。如果本發(fā)明的核酸片段位于構(gòu)建體中表達(dá)盒的下游，本發(fā)明的核酸片段與所述表達(dá)盒或更優(yōu)選地與所述表達(dá)盒的最下游的轉(zhuǎn)錄終止序列和/或聚腺苷酸化位點(diǎn)之間的距離在5kb以內(nèi)，更優(yōu)選2kb以內(nèi)，更優(yōu)選Ikb以內(nèi)，最優(yōu)選500bp以內(nèi)。因此,核酸構(gòu)建體可以含有位于表達(dá)盒下游或上游的本發(fā)明的核酸片段?？蛇x擇地，核酸構(gòu)建體可以含有位于表達(dá)盒上游和下游的本發(fā)明的核酸片段。在核酸構(gòu)建體中，位于表達(dá)盒上游和下游的本發(fā)明的核酸片段可以獨(dú)立選自如上定義的核酸片段。因此，在核酸構(gòu)建體中，表達(dá)盒上游的核酸片段和表達(dá)盒下游的核酸片段可以不同。或者，在核酸構(gòu)建體中，表達(dá)盒上游和下游的核酸片段可以(基本上)相同。
此外，優(yōu)選地，在核酸構(gòu)建體中，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)核酸片段與所述表達(dá)盒的連接方向使得片段中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄與所述表達(dá)盒中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄在同一方向上。
本文使用的“表達(dá)盒”是一種核苷酸序列，該核苷酸序列至少包括與編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列功能性連接的表達(dá)所需的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述表達(dá)盒進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。表達(dá)盒中還可以包括其他調(diào)控序列例如增強(qiáng)子。除了編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列以外，優(yōu)選地，所述表達(dá)盒還包括用于篩選含有表達(dá)盒的宿主細(xì)胞的編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列和編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列在表達(dá)盒中具有部分相同的(多順?lè)醋?轉(zhuǎn)錄單元。因此，本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒，優(yōu)選地，所述表達(dá)盒在5'至3'方向上包括，并可操作地連接:a) 5'-啟動(dòng)子-編碼可 篩選標(biāo)記的核苷酸序列-編碼目的基因產(chǎn)物的開(kāi)放讀碼框-任選的轉(zhuǎn)錄終止和/或聚腺苷酸化序列-3'，或b)5'-啟動(dòng)子-編碼目的基因產(chǎn)物的開(kāi)放讀碼框-編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列-任選的轉(zhuǎn)錄終止和/或聚腺苷酸化序列-3'。啟動(dòng)子和其他調(diào)控序列必須能夠在目的真核宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用，也就是它們必須能夠驅(qū)動(dòng)目的基因產(chǎn)物和可篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。因此，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄單元可操作地連接，該轉(zhuǎn)錄單元包括可篩選標(biāo)記和編碼目的基因產(chǎn)物的開(kāi)放讀碼框。表達(dá)盒可以進(jìn)一步任選地包括本領(lǐng)域已知的其他因子，例如含有內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)等。在一些實(shí)施方式中，內(nèi)含子位于啟動(dòng)子之后，編碼開(kāi)放讀碼框的序列之前。
在其他實(shí)施方式中，IRES可以位于轉(zhuǎn)錄單元中，該轉(zhuǎn)錄單元包括可篩選標(biāo)記密碼子序列和編碼目的基因產(chǎn)物的序列，IRES可以位于可篩選標(biāo)記的開(kāi)放讀碼框和目的基因產(chǎn)物之間。在病毒和哺乳動(dòng)物基因中內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)元件是已知的(Martinez-Salas, 1999, Curr Opin Biotechnol 10:458-464),目.已通過(guò)篩選小的合成寡核苷酸而被識(shí)別(Venkatesan & Dasgupta, 2001Mol Cell Biol21:2826-2837) 來(lái)自腦心肌炎病毒的 IRES 已經(jīng)被詳細(xì)地分析(Mizuguchi et al.，2000，Mol Therl: 376-382)。IRES 是在DNA中編碼的元件，在轉(zhuǎn)錄RNA中它產(chǎn)生了真核核糖體能夠結(jié)合和起始翻譯的結(jié)構(gòu)。IRES促使從單個(gè)RNA分子上產(chǎn)生兩種或多種蛋白質(zhì)(在它的5'端的帽結(jié)構(gòu)上與RNA結(jié)合的核糖體翻譯了第一個(gè)蛋白質(zhì)，(Martinez-Salas, 1999,見(jiàn)上文)。因此,本發(fā)明提供了這樣一種表達(dá)盒，優(yōu)選地，該表達(dá)盒在5'至3'方向上包括:5'-啟動(dòng)子-編碼目的基因產(chǎn)物的開(kāi)放讀碼框-1RES-可篩選標(biāo)記-任選的轉(zhuǎn)錄終止和/或聚腺苷酸化序列-3'或5'-啟動(dòng)子-可篩選標(biāo)記-1RES-編碼目的基因產(chǎn)物的開(kāi)放讀碼框-任選的轉(zhuǎn)錄終止和/或聚腺苷酸化序列-3'。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸構(gòu)建體所含有的應(yīng)用于表達(dá)盒的啟動(dòng)子在真核宿主細(xì)胞中起作用；更優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子在植物或動(dòng)物宿主細(xì)胞中起作用；更優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子在脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞中起作用，最優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中起作用，均用于轉(zhuǎn)錄單元的起始轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以是組成型的或是受控的，也可以從各種來(lái)源中獲得，包括病毒、原核或真核來(lái)源，或是人工設(shè)計(jì)的。目的核酸的表達(dá)可以來(lái)自天然的啟動(dòng)子或它的衍生物或完全來(lái)自異源啟動(dòng)子(Kaufman, 2000, Mol.Biotechnoll6:151-160)。根據(jù)本發(fā)明，在選定的真核細(xì)胞中提供高轉(zhuǎn)錄水平的強(qiáng)啟動(dòng)子是優(yōu)選的。熟知的經(jīng)常用于真核細(xì)胞表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子包括來(lái)自病毒例如腺病毒的啟動(dòng)子，例如EIA啟動(dòng)子；來(lái)自巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子例如CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子(本文稱為CMV啟動(dòng)子)(例如從pcDNA，Invitrogen 獲得)；來(lái)自猿猴病毒 40 (SV40) (Das et al, 1985, Prog Nucleic Acid ResMol Biol.迪:217-36)的啟動(dòng)子等。適當(dāng)?shù)膹?qiáng)啟動(dòng)子也可以來(lái)自真核細(xì)胞，例如金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子、延長(zhǎng)因子(EF-Ια )啟動(dòng)子、泛素C或UB6啟動(dòng)子(Gill et al., 2001, GeneTherapy8:1539-1546; Schorpp et al, 1996, Nucleic Acids Res24:1787-8)、肌動(dòng)蛋白啟云力子例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，例如倉(cāng)鼠或人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(SEQ IDN0:10)、免疫球蛋白啟動(dòng)子、熱激啟動(dòng)子等。測(cè)試啟動(dòng)子的功能和啟動(dòng)子的強(qiáng)度是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作，通常包括例如在啟動(dòng)子序列之后克隆報(bào)告基因例如半乳糖苷酶(lacZ)、熒光素酶、GFP等，并測(cè)試報(bào)告基因的表達(dá)。當(dāng)然，可以通過(guò)序列的刪除、增加和突變來(lái)改變啟動(dòng)子，并測(cè)試它的功能以找到新的、減弱的或增強(qiáng)的啟動(dòng)子序列。本發(fā)明使用的啟動(dòng)子優(yōu)選為人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、泛素C啟動(dòng)子或EFl- α啟動(dòng)子。
本文中的開(kāi)放讀碼框應(yīng)被理解為核苷酸序列，它從5'至3'方向上包括:1)翻譯起始密碼子，2)用于編碼目的基因產(chǎn)物(優(yōu)選為蛋白質(zhì))的一個(gè)或多個(gè)密碼子，和3)翻譯終止密碼子，應(yīng)當(dāng)理解的是1)、2)和3)在框中是可操作地連接的。因此，開(kāi)放讀碼框由3重核苷酸(三聯(lián)體)組成。
根據(jù)本發(fā)明的目的基因產(chǎn)物可以是任何基因產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)。目的基因產(chǎn)物可以是單體蛋白質(zhì)或(部分)多聚體蛋白。多聚體蛋白至少包括兩個(gè)多肽鏈。本發(fā)明的目的蛋白的非限制性實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酶、激素、免疫球蛋白或它們的鏈或片段、治療性蛋白質(zhì)例如抗癌蛋白質(zhì)、凝血蛋白質(zhì)例如因子VII1、多功能蛋白質(zhì)例如紅細(xì)胞生成素、診斷蛋白質(zhì)、或用于疫苗接種目的的蛋白質(zhì)或片段。
目的基因產(chǎn)物可以來(lái)自任何來(lái)源，在某些實(shí)施方式中來(lái)自哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)、人造蛋白質(zhì)(例如融合蛋白質(zhì)或突變蛋白質(zhì))，優(yōu)選來(lái)自人蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用宿 主細(xì)胞的密碼子適應(yīng)指數(shù)針對(duì)表達(dá)目的肽的宿主細(xì)胞，對(duì)編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。編碼酶的核苷酸序列相對(duì)于宿主細(xì)胞中密碼子使用的適應(yīng)性可以用密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)來(lái)表達(dá)。本文中的密碼子適應(yīng)指數(shù)被定義為在特定宿主細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)的基因的密碼子使用相對(duì)于高表達(dá)基因的密碼子使用的相對(duì)適應(yīng)性的量度。各個(gè)密碼子的相對(duì)適應(yīng)性(w)是各個(gè)密碼子的使用和對(duì)于相同氨基酸的最常用的密碼子的使用之間的比值。CAI指數(shù)被定義為相對(duì)適應(yīng)性值的幾何平均值。非同義密碼子和終止密碼子(依賴于遺傳編碼)不計(jì)算在內(nèi)。CAI值的范圍從O至1，具有較高的CAI值說(shuō)明具有較高比例的最常用的密碼子(參見(jiàn)Sharp and Li, 1987, Nucleic AcidsResearch!^: 1281-1295;還可參見(jiàn) Kim et al., Gene.1997, 199:293-301; zur Megede etal., Journal of Virology, 2000，74:2628-2635)。優(yōu)選地，編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列的 CAI 至少是 0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 或 0.95。
在一種實(shí)施方式中，當(dāng)最終目標(biāo)不是生產(chǎn)目的多肽，而是RNA分子例如用表達(dá)盒生產(chǎn)更大量的RNA時(shí)，可以使用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，所述RNA可以用于調(diào)控其他基因(例如RNAi，反義RNA)、基因治療、在體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)等。
為了生產(chǎn)多聚體蛋白，可以使用兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。例如兩個(gè)表達(dá)盒可以均是多順?lè)醋雍怂針?gòu)建體，各自用于編碼不同的可篩選標(biāo)記蛋白，從而有可能篩選兩個(gè)表達(dá)盒。例如該實(shí)施方式對(duì)于表達(dá)輕鏈或重鏈免疫球蛋白例如抗體是有利的。顯而易見(jiàn)的是，在兩個(gè)核酸構(gòu)建體被引入宿主細(xì)胞之前，它們可以位于一個(gè)核酸分子中或位于單獨(dú)的核酸分子中。當(dāng)兩個(gè)核酸構(gòu)建體被引入宿主細(xì)胞時(shí)，將它們置于一個(gè)核酸分子上的優(yōu)勢(shì)是兩個(gè)核酸構(gòu)建體以單一的預(yù)定比率(例如1:1)存在。另一方面，當(dāng)兩個(gè)核酸構(gòu)建體被置于兩個(gè)不同的核酸分子上，它們被引入宿主細(xì)胞時(shí)就有可能改變它們的摩爾比，如果優(yōu)選的摩爾比不是1:1或預(yù)先不知道優(yōu)選的摩爾比是多少時(shí)，這是有利的，從而本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易的找到它們的變化并憑經(jīng)驗(yàn)找到最佳摩爾比。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選至少一個(gè)核酸構(gòu)建體，更優(yōu)選每個(gè)核酸構(gòu)建體至少包括一個(gè)優(yōu)選包括兩個(gè)本發(fā)明的核酸片段。
在另一種實(shí)施方式中，單一表達(dá)構(gòu)建體中含有不同的亞基或部分多聚體蛋白。W02006/048459 (例如第40頁(yè))已經(jīng)描述了和表達(dá)構(gòu)建體相結(jié)合的有用的抗抑制因子的構(gòu)型，通過(guò)引用的方式將其納入本文。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，目的基因產(chǎn)物是凝血因子例如因子VIII或因子VI1、干擾素和白介素，例如人干擾素-Y或治療性的抗癌單克隆抗體例如赫賽汀(抗EGF受體)或阿瓦斯丁 (抗血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子(VEGF))或ΕΡ0。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以以雙鏈DNA的形式存在，對(duì)于可篩選標(biāo)記和編碼目的基因產(chǎn)物的開(kāi)放讀碼框具有編碼鏈和非編碼鏈，編碼鏈與被翻譯的RNA具有相同的序列，除了存在的T代替了 U。因此，AUG起始密碼子在編碼鏈中被ATG序列編碼，含有與RNA中的AUG起始密碼子相應(yīng)的ATG序列的鏈被稱為DNA的編碼鏈。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，起始密碼子或翻譯起始序列事實(shí)上存在于RNA分子中，但也可以認(rèn)為它們同樣存在于編碼該RNA分子的DNA分子中；因此，無(wú)論本發(fā)明指的是起始密碼子還是翻譯起始序列，均包括相應(yīng)的DNA分子，該DNA分子具有和RNA序列相同的序列但在所述DNA分子的編碼鏈中T替代了 U,反之亦然，除非明確指明。換句話說(shuō)，例如起始密碼子是RNA中的AUG序列，而在DNA的編碼鏈中相應(yīng)的ATG序列也指的是本發(fā)明的起始密碼子。同樣可以借鑒到‘框內(nèi)’編碼序列，指的是RNA分子中的三聯(lián)體(3個(gè)堿基)被翻譯為氨基酸，但也認(rèn)為是DNA分子的編碼鏈中的相應(yīng)的三核苷酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體所包括的在表達(dá)盒中應(yīng)用的可篩選標(biāo)記在真核宿主細(xì)胞中起作用，更優(yōu)選地該標(biāo)記在植物或動(dòng)物宿主細(xì)胞中起作用，更優(yōu)選地在脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞中起作用，最優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中起作用。
術(shù)語(yǔ)“可篩選標(biāo)記”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的術(shù)語(yǔ)，在本文中用于描述在表達(dá)時(shí)可用來(lái)篩選含有(和/或表達(dá))可篩選標(biāo)記的細(xì)胞的任何基因?qū)嶓w?？珊Y選標(biāo)記可以是顯性的或隱性的或雙向的?？珊Y選標(biāo)記可以是編碼產(chǎn)物的基因，它使得細(xì)胞表達(dá)耐篩選劑例如抗生素或除草劑的基因。可篩選標(biāo)記可以編碼例如篩選蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠中和毒性篩選劑或使毒性篩選劑失活，并保護(hù)宿主細(xì)胞免受制劑致死效應(yīng)或生長(zhǎng)抑制的影響。在特定條件下其他可篩選標(biāo)記能夠補(bǔ)足細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制性缺陷。這種基因的實(shí)例包括使原養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)闋I(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的基因。使用的術(shù)語(yǔ)“報(bào)告物”主要指的是可見(jiàn)標(biāo)記，例如綠色熒光蛋白(GFP)、d2EGFP、熒光素酶、⑶S等，以及nptll標(biāo)記等。這種報(bào)告物被用來(lái)篩選表達(dá)可見(jiàn)標(biāo)記的細(xì)胞(通過(guò)主動(dòng)將表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞和不表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞分類)，例如使用突光激活細(xì)胞分選儀(FACS)篩選表達(dá)熒光標(biāo)記蛋白的細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的可篩選標(biāo)記能夠提供對(duì)篩選劑的致死和/或生長(zhǎng)抑制影響的抗性。
本發(fā)明使用的編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列編碼被用于篩選真核宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)，例如相比于沒(méi)有蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主細(xì)胞，由于宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá),為表達(dá)可篩選標(biāo)記蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞提供了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)?；谒拗骷?xì)胞中被編碼的可篩選標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)，優(yōu)選編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列能夠提供對(duì)篩選劑(例如抗生素)的抗性，而篩選劑能夠引起不表達(dá)可篩選標(biāo)記蛋白的宿主細(xì)胞的致死效應(yīng)和/或生長(zhǎng)抑制。因此，本發(fā)明的可篩選標(biāo)記必須在真核宿主細(xì)胞中起作用，因而能夠在真核宿主細(xì)胞中被篩選出來(lái)。滿足這一標(biāo)準(zhǔn)的任何可篩選標(biāo)記多肽基本上都可以在本發(fā)明中使用。當(dāng)用于在真核宿主細(xì)胞中獲得克隆時(shí)，這種可篩選標(biāo)記在本領(lǐng)域中是已知的并是常規(guī)使用的，本文還提供了一些實(shí)例。
為了方便并通常被技術(shù)人員接受，在許多出版物以及本文中，通常編碼可篩選標(biāo)記的基因和引起耐篩選劑的可篩選標(biāo)記分別被稱為“(耐)篩選劑基因”或“(耐)篩選劑蛋白”，盡管官方名稱不同，例如編碼耐新霉素(以及G418和卡那霉素)的蛋白質(zhì)的基因通常被稱為(耐)新霉素(或nec/)基因，然而官方名稱是氨基糖苷3，-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可篩選標(biāo)記能夠提供對(duì)篩選劑的致死效應(yīng)或生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的抗性，所述篩選劑選自以下組成的組中:博萊霉素抗生素家族、嘌呤霉素、殺稻痕素、潮霉素(hygromycin)、氨基糖苷抗生素、氨甲蝶呤和氨基亞砜蛋氨酸(methioninesulphoximine)。
編碼提供耐博萊霉素抗生素家族的可篩選標(biāo)記的核苷酸序列是例如編碼野生型“ble”基因的核苷酸序列，包括但不限于Sh ble、Tn5ble和Sa ble或它們的變體。SEQ IDN0:8記載了其實(shí)例。通常被ble基因編碼的基因產(chǎn)物使得它們的宿主可以耐博萊霉素家族的銅螯合的糖肽類抗生素，它是切割DNA的糖肽類。本發(fā)明中作為篩選劑使用的博萊霉素家族抗生素的實(shí)例包括但不限于:博萊霉素、腐草霉素、他利霉素、培洛霉素和Zeocin 。博萊霉素(Zeocin)作為篩選劑是特別有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)槟筒┤R霉素蛋白(博萊霉素-R)通過(guò)與藥物相結(jié)合起作用從而使其變得無(wú)害。因此很容易通過(guò)滴定確定殺死具有低水平博萊霉素-R表達(dá)的細(xì)胞而使高表達(dá)子存活的藥物的用量。大多數(shù)(即使不是全部)常用的其他耐抗生素可篩選標(biāo)記都是酶，因此它們都是以催化的方式起作用(也就是說(shuō)酶和篩選劑的化學(xué)計(jì)量不是特定的，例如為1:1)。因此，抗生素博萊霉素是優(yōu)選的可篩選標(biāo)記。
編碼提供耐氨基糖苷類抗生素的可篩選標(biāo)記的核苷酸序列是例如編碼野生型氨基糖苷類3,-磷酸轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列或其變體。本發(fā)明的氨基糖苷類是通常已知的氨基糖苷類抗生素(Mingeot-Leclercq, M.et al., 1999, Chemother.43:727-737),它至少包括一個(gè)通過(guò)糖苷鍵和其他半數(shù)分子相結(jié)合的氨基-吡喃糖或氨基-呋喃糖部分。它們的抗生素的影響基于抑制蛋白質(zhì)的合成。本發(fā)明作為篩選劑使用的氨基糖苷類抗生素的實(shí)例包括但不限于卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、G418 (遺傳霉素)、新霉素B (弗氏囷絲素)、紫蘇霉素、丁胺卡那霉素、異帕米星等。
本發(fā)明中可以使用的可篩選標(biāo)記的其他實(shí)例是DHFR、胱硫醚Y -裂解酶和谷氨酸合成酶(GS)基因。使用這些類型的代謝酶作為可篩選標(biāo)記多肽的潛在優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)⑺鼈冇糜谑顾拗骷?xì)胞保持連續(xù)的篩選，這在特定環(huán)境下是有利的。
通過(guò)氨甲蝶呤，尤其是通過(guò)增加氨甲蝶呤細(xì)胞的濃度來(lái)篩選DHFR基因，可以篩選DHFR基因以增加DHFR基因的拷貝數(shù)。DHFR基因也可以被用來(lái)彌補(bǔ)DHFR缺陷，例如具有DHFR—表型的CHO細(xì)胞中，含有葉酸而缺乏甘氨酸、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基中。如果可篩選標(biāo)記是DHFR，在有利的實(shí)施方式中，用含有葉酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該培養(yǎng)基基本上缺乏次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，優(yōu)選還缺乏甘氨酸。通常，本文中的術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基基本上缺乏”指的是在培養(yǎng)基中維持細(xì)胞生長(zhǎng)的指定組分的不足，從而，當(dāng)指定酶的遺傳信息在細(xì)胞中被表達(dá)，且指定前體組分在培養(yǎng)基中存在時(shí)，進(jìn)行好的篩選是可能的。優(yōu)選培養(yǎng)基中不含指定組分。缺乏指定組分的培養(yǎng)基可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備，或從培養(yǎng)基供應(yīng)商處獲得。
通過(guò)不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)的缺乏GS (例如NS-O細(xì)胞)的細(xì)胞中，或通過(guò)添加GS抑制劑、氨基亞砜蛋氨酸(MSX)而缺乏GS (例如CHO細(xì)胞)的細(xì)胞中，篩選谷氨酰胺合成酶(GS)基因例如野生型人或小鼠谷氨酰胺合成酶基因是可能的。
胱硫醚Y-裂解酶(EC4.4.1.1)是合成氨基酸L-半胱氨酸重要的酶。CHO細(xì)胞是用于將胱硫醚轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的天然的營(yíng)養(yǎng)缺陷體。因此，可以利用例如來(lái)自小鼠或人的胱硫醚Y -裂解酶(cys-裂解酶)基因通過(guò)在不含L-半胱氨酸和L-胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞借助互補(bǔ)作用 篩選細(xì)胞?；赾ys-裂解酶標(biāo)記的篩選可能需要培養(yǎng)基中存在無(wú)毒性前體L-胱硫醚。在一些脊椎動(dòng)物細(xì)胞系中作為可篩選標(biāo)記使用的cys-裂解酶可能首先需要內(nèi)源性胱硫醚Y-裂解酶基因的失活(敲除)?？蛇x擇地，基于cys-裂解酶標(biāo)記的篩選還可能需要培養(yǎng)基中存在胱硫醚Y-裂解酶活性抑制劑。用于該目的的合適的胱硫醚Y -裂解酶活性抑制劑包括，例如，炔丙基甘氨酸、三氟丙氨酸甲酯(trifluoroalanine)、氨基乙氧基乙烯甘氨酸和L- β -草酰-氨基-L-丙氨酸(L-beta-oxalyl-amino-L-alanine)o
可以在本發(fā)明的內(nèi)容中使用的其他可篩選標(biāo)記和它們的篩選劑如US5, 561，053的表I中所描述的，通過(guò)引用將其并入本文；Kaufman，Methods inEnzymology, 185:537-566(1990)也總結(jié)了這些可篩選標(biāo)記和它們的篩選劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的表達(dá)盒包括是嚴(yán)格可篩選標(biāo)記的可篩選標(biāo)記。本文的嚴(yán)格可篩選標(biāo)記應(yīng)被理解為需要在表達(dá)標(biāo)記的待篩選的宿主細(xì)胞(即希望從篩選中存活的宿主細(xì)胞)中被高水平地轉(zhuǎn)錄(和/或表達(dá))的可篩選標(biāo)記。在本發(fā)明中，優(yōu)選地，可篩選標(biāo)記的嚴(yán)格性至少能夠被下列因素之一增強(qiáng):a)降低可篩選標(biāo)記的翻譯(起始)效率，和b)降低可篩選標(biāo)記多肽的活性和/或效率。因此，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的表達(dá)盒優(yōu)選含有編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列，該核苷酸序列至少是下列核苷酸序列其中之一:
a)在起始密碼子中具有突變的核苷酸序列，該突變能夠降低可篩選標(biāo)記多肽在真核宿主細(xì)胞中的翻譯起始效率；
b)作為多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元一部分的核苷酸序列，所述多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元含有:i)編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列；和ii)含有在5'至3'方向上的翻譯起始密碼子、至少一個(gè)氨基酸密碼子和翻譯終止密碼子的功能性開(kāi)放讀碼框；其中所述功能性開(kāi)放讀碼框的終止密碼子位于編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列的獨(dú)立翻譯起始密碼子的上游的0-250個(gè)核苷酸處，其中分隔功能性開(kāi)放讀碼框的終止密碼子和編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列的獨(dú)立翻譯起始密碼子的序列缺乏翻譯起始密碼子；以及
c)含有突變的編碼可篩選標(biāo)記多肽的核苷酸序列，該突變編碼至少一個(gè)氨基酸置換(amino acid change),與其相應(yīng)的野生型相比,可篩選標(biāo)記多肽的活性降低。
在(翻譯)起始密碼子(次優(yōu)的非AUG起始密碼子)中具有突變的編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列降低了真核宿主細(xì)胞中的可篩選標(biāo)記多肽的翻譯起始效率，這是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如W02007/096399)。本文中的非ATG (非AUG)起始密碼子應(yīng)當(dāng)理解是在起始密碼子中具有突變的翻譯起始密碼子，這降低了真核宿主細(xì)胞中可篩選標(biāo)記多肽的翻譯起始效率。本發(fā)明可用于編碼可篩選標(biāo)記序列的非ATG起始密碼子的實(shí)例包括例如GTG、TTG、CTG、ATT和ACG。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，ATG起始密碼子突變?yōu)镚TG起始密碼子。更優(yōu)選地，ATG起始密碼子突變?yōu)門TG起始密碼子，它提供了比GTG起始密碼子更低表達(dá)水平的可篩選標(biāo)記多肽。當(dāng)使用非ATG起始密碼子時(shí)，優(yōu)選非ATG起始密碼子存在于最有利于翻譯起始密碼子的環(huán)境中，例如下文定義的Kozak共有序列。當(dāng)將非ATG起始密碼子應(yīng)用到可篩選標(biāo)記時(shí)，編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列可以發(fā)生突變而缺乏內(nèi)在ATG密碼子，尤其缺乏非ATG起始密碼子框內(nèi)的內(nèi)在ATG密碼子。優(yōu)選在構(gòu)建體中可篩選標(biāo)記位于編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列的上游，并且在編碼目的基因產(chǎn)物的序列和標(biāo)記之間沒(méi)有使用IRES。W02006/048459公開(kāi)了如何實(shí)現(xiàn)(例如通過(guò)置換、插入或缺失，優(yōu)選置換)和如何測(cè)試獲得的可篩選標(biāo)記多肽的功能性。
以上b)所述的降低翻譯起始效率的第二項(xiàng)，在可篩選標(biāo)記的翻譯起始密碼子之前直接使用了(短的)功能性開(kāi)放讀碼框(ppx，其中PPx是X個(gè)氨基酸殘基的小肽)。功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的長(zhǎng)度是可以變化的，目的是微調(diào)低水平的可篩選標(biāo)記多肽的翻譯效率，從而獲得理想的精確的嚴(yán)格篩選水平。因此，功能性開(kāi)放讀碼框可以編碼至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80 或 90 個(gè)氨基酸殘基(在Y端具有起始密碼子，在:V端具有終止密碼子)，優(yōu)選編碼至多200、180、160、150、140、130、120、110、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91 或 90 個(gè)氨基酸殘基(在 5'端具有起始密碼子，在3'端具有終止密碼子)。因此，通過(guò)改變功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的長(zhǎng)度，轉(zhuǎn)錄過(guò)程中直接在編碼可篩選標(biāo)記的序列之前，提供了可篩選標(biāo)記的翻譯效率的連續(xù)變化范圍。功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)可以直接位于獨(dú)立的可篩選標(biāo)記的起始密碼子的上游，在這種情況下，功能性開(kāi)放讀碼框的起始密碼子直接與編碼可篩選標(biāo)記的序列的起始密碼子相鄰。另外，功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的上游終止密碼子和編碼可篩選標(biāo)記的序列的起始密碼子可以相隔 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250個(gè)以上的核苷酸。分隔功能性開(kāi)放讀碼框(ppx)的上游終止密碼子和編碼可篩選標(biāo)記的序列的起始密碼子的間隔序列的長(zhǎng)度的變化進(jìn)一步增加了可篩選標(biāo)記的翻譯效率的微調(diào)水平。分隔功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的終止密碼子和編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列的獨(dú)立翻譯起始密碼子的間隔序列缺乏翻譯起始密碼子。因此優(yōu)選所述間隔序列缺乏ATG密碼子。更優(yōu)選所述間隔序列還缺乏次優(yōu)非ATG密碼子例如嵌入在Kozak序列(如下所述)中的GTG、TTG、CTG、ATT和ACG (如下所述)。最優(yōu)選所述間隔序列缺乏任一的ATG、GTG、TTG、CTG、ATT和ACG密碼子。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，分隔功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的終止密碼子和編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列的獨(dú)立翻譯起始密碼子的間隔序列缺乏終止密碼子，也就是缺乏TAA、TAG和TGA密碼子。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列和功能性開(kāi)放讀碼框(ppx)的翻譯起始密碼子中的至少一個(gè)是ATG密碼子。更優(yōu)選地，至少編碼功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的核苷酸序 列的起始密碼子是ATG密碼子，在這種情況下，編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列的起始密碼子可以是非ATG起始密碼子(也被稱為次優(yōu)或不太有利的翻譯起始密碼子)，目的是允許更加嚴(yán)格的篩選(如上所述)。最優(yōu)選地，編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列和功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的翻譯起始密碼子都是ATG密碼子。然而，本發(fā)明不排除編碼功能性開(kāi)放讀碼框(PPx)的核苷酸序列的起始密碼子是非ATG起始密碼子。
在一種實(shí)施方式中，編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列和功能性開(kāi)放讀碼框(ppx)的起始密碼子中的至少一個(gè)被嵌入到Kozak共有序列中。本文中將Kozak共有序列(脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞)定義為 ANN (AUG) N (SEQ ID N0:4)和 GNN (AUG) G(SEQ ID NO:5)，其中(AUG)代表了相關(guān)編碼序列的起始密碼子。優(yōu)選在(AUG)之前的N’s是C’S。更優(yōu)選的Kozak共有序列是GCCRCC(AUG)G(SEQ ID NO:6)，其中R是嘌呤。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，Kozak共有序列之前還可以存在另一個(gè)GCC三聯(lián)體。
優(yōu)選的上游帶有功能性開(kāi)放讀碼框(ppx)的可篩選標(biāo)記為例如ρρ9°ΖΕ0 (編碼新霉素抗性蛋白前面的90個(gè)氨基酸的ppx開(kāi)放讀碼框；pp9°編碼序列如SEQ ID N0:7所示)。
在一種實(shí)施方式中，擇一實(shí)施或組合使用以上a)或b)所述的降低翻譯起始效率的方法，也可以有利于提供可篩選標(biāo)記多肽的降低的翻譯延伸效率。例如可以通過(guò)改變編碼可篩選標(biāo)記多肽的序列，從而降低所討論宿主細(xì)胞中密碼子使用的適應(yīng)性來(lái)實(shí)現(xiàn)。這就再次提供了進(jìn)一步控制本發(fā)明核酸構(gòu)建體的篩選嚴(yán)格性水平。因此，編碼可篩選標(biāo)記蛋白的核苷酸序列優(yōu)選能夠適應(yīng)所討論宿主細(xì)胞中的次優(yōu)密碼子使用。優(yōu)選地，適應(yīng)本發(fā)明的核苷酸序列的密碼子具有不超過(guò)0.7,0.6,0.5,0.4,0.3或0.2的CAI (見(jiàn)以上有關(guān)CAI的定義)。
在一種實(shí)施方式中，擇一實(shí)施或組合實(shí)施以上a)或b)所述的具有降低的翻譯起始效率的可篩選標(biāo)記的實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明，可以使用適當(dāng)?shù)目珊Y選標(biāo)記的突變體或衍生物，因此只要可篩選標(biāo)記仍然起作用，它們便在術(shù)語(yǔ)“可篩選標(biāo)記”的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，可篩選標(biāo)記的突變體或衍生物與它相應(yīng)的野生型相比，可篩選標(biāo)記的活性降低，從而使得可以進(jìn)一步微調(diào)本發(fā)明核酸構(gòu)建體篩選嚴(yán)格性的控制水平。擇一實(shí)施或組合實(shí)施一個(gè)或多個(gè)其他實(shí)施方式，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列編碼可篩選標(biāo)記多肽，該可篩選標(biāo)記多肽包括一個(gè)或多個(gè)(共同地)能夠降低可篩選標(biāo)記多肽活性(與它相應(yīng)的野生型相比)的突變。突變的可篩選標(biāo)記多肽的活性可以為其相應(yīng)的野生型活性的90、80、70、60、50、40、30、20、10、5 或 1% 以上。
作為非限制性的實(shí)例，博萊霉素抗性多肽中第9位的脯氨酸可能突變?yōu)槔鏣hr或Phe (參見(jiàn)例如W02006/048459的實(shí)施例14，通過(guò)引用將其引入本文)，對(duì)于新霉素抗性多肽，第182或261位的氨基酸殘基或第182和261位的氨基酸殘基可發(fā)生突變(參見(jiàn)例如W001/32901)。優(yōu)選的具有降低活性的可篩選標(biāo)記多肽是具有由SEQ ID N0:8編碼的氨基酸序列的博萊霉素抗性多肽，其中第21位的谷氨酸變?yōu)楦拾彼幔?6位的丙氨酸變?yōu)樘K氨酸(ZeoEPP5)。
特別優(yōu)選的嚴(yán)格可篩選標(biāo)記是PP8ZEOepp5,它結(jié)合了 8個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框ppx和具有降低的活性的ZeoEPP5博萊霉素抗性蛋白。PP8ZEOepp5的序列如SEQ ID N0:9所示。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選被包括在質(zhì)粒中或所述表達(dá)構(gòu)建體可以是質(zhì)粒。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法能夠容易地操作質(zhì)粒，例如被設(shè)計(jì)為能夠在原核和/或真核細(xì)胞中復(fù)制?；蛘撸怂針?gòu)建體可以是載體。許多載體可以直接或以所需的分離片段的形式用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并可整體或部分地整合到這些細(xì)胞的基因組中，從而獲得在其基因組中含有所需核酸的穩(wěn)定的宿主細(xì)胞。
常規(guī)的表達(dá)體系是重組質(zhì)?；蛑亟M病毒基因組形式的DNA分子。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法將質(zhì)粒或病毒基因組引入(真核宿主)細(xì)胞中，優(yōu)選地整合到它們的基因組中，W02006/048459 (例如第30-31頁(yè))中已經(jīng)描述了一些有關(guān)的方面，通過(guò)引用將其納入本文。
公知的是，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和其它表觀遺傳控制機(jī)制可能會(huì)影響真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(例如，Whitelaw et al, 2001, Methods Mol Bioll58:351_68)。為了增加在嚴(yán)格篩選體制中篩選存活的宿主細(xì)胞的克隆的幾率，以及盡可能增加獲得的克隆的表達(dá)穩(wěn)定性，將通常優(yōu)選增加轉(zhuǎn)錄的可預(yù)測(cè)性。因此，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體和載體除含有如上定義的本發(fā)明的核酸片段(即，含有來(lái)自RPL32啟動(dòng)子區(qū)的序列或與之相似的序列)外，還含有至少一個(gè)或多個(gè)連接到表達(dá)盒上的其他“表達(dá)增強(qiáng)核酸片段”。這種其他“表達(dá)增強(qiáng)核酸片段”可以包括下文描述的“染色質(zhì)控制元件”、“反阻遏序列”和“基因表達(dá)增強(qiáng)元件”。
本文中所用的“染色質(zhì)控制元件”為DNA序列的集合術(shù)語(yǔ)(collective term),所述DNA序列在真核細(xì)胞中 可以以某種方式影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及隨后影響轉(zhuǎn)基因附近的表達(dá)水平和/或表達(dá)穩(wěn)定性(他們以“順式”的方式發(fā)揮作用，因此，優(yōu)選地，被置于與轉(zhuǎn)基因相距5kb以內(nèi)，更優(yōu)選2kb以內(nèi)，更優(yōu)選Ikb以內(nèi))。有時(shí)使用這種元件來(lái)增加具有所需轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的克隆的數(shù)量。W02006/048459已描述了按照本發(fā)明使用的幾種類型的這種元件(例如，32-34頁(yè))，通過(guò)引用將其并入本文，并且，為了本發(fā)明的目的，染色質(zhì)控制元件選自由基質(zhì)或支架附著區(qū)(scaffold attachment regions) (MARs/SARs)、絕緣子(例如，β-球蛋白絕緣子元件(雞β -球蛋白位點(diǎn)的5’HS4))、scs、scs’等、常染色質(zhì)開(kāi)放元件(ubiquitous chromatin opening element) (UCOE)以及反阻遏序列(還被稱為 “STAR，，序列)所組成的組中。
優(yōu)選地，所述染色質(zhì)控制元件為反阻遏序列，優(yōu)選選自由W02007/096399中公開(kāi)的SEQ.1D.N0.1到SEQ.1D.N0.66所組成的組中。更優(yōu)選地，所述染色質(zhì)控制元件選自由W02007/096399 中公開(kāi)的 STAR67、STAR7、STAR9、STARl7, STAR27、STAR29、STAR43、STAR44、STAR45、STAR47、STAR61或所述STAR序列的功能片段或衍生物所組成的組中。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用STAR7和STAR67組合，或STAR7和STAR67的功能片段或衍生物。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，將STAR7和STAR67或它們的功能片段或衍生物的至少一種置于驅(qū)動(dòng)多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元表達(dá)的啟動(dòng)子的上游。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的兩側(cè)均與如上描述的反阻遏序列的至少一種相連。在某些實(shí)施方式中，按照5’到3’的順序，根據(jù)本發(fā)明提供的表達(dá)盒包括反阻遏序列A-反阻遏序列B-[啟動(dòng)子-根據(jù)本發(fā)明的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元(編碼目的基因產(chǎn)物并且其下游為有功能的可篩選標(biāo)記蛋白)_轉(zhuǎn)錄終止序列]-反阻遏序列C，其中，A、B和C可以相同或不同。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，A和C為STAR7，且B為STAR67。W02006/048459中已經(jīng)描述了對(duì)本發(fā)明有用的具有反阻遏活性(反阻遏序列)及其特性的序列，以及它們的功能片段或衍生物，它們的結(jié)構(gòu)和功能的定義，以及獲得并使用它們的方法(例如，34-38頁(yè))，通過(guò)引用將其并入本文。
另一種優(yōu)選的用于本發(fā)明的基因表達(dá)增強(qiáng)元件(可以使用其替代或插入上述染色質(zhì)控制元件或反阻遏序列)為作用為基因間轉(zhuǎn)錄源的核酸片段。優(yōu)選地，作用為基因間轉(zhuǎn)錄源的核酸片段含有基因組區(qū)域的至少1，000、1，500,2, 000,3, 500或7，000個(gè)連續(xù)核苷酸，所述基因組區(qū)域位于脊椎動(dòng)物Rbl或P15基因的翻譯起始位點(diǎn)的上游，且作用為基因間轉(zhuǎn)錄源。優(yōu)選的，所述核酸片段含有SEQ ID N0:ll(人RblF和E)的至少l，000、l，500、2，000、3，500或7，000個(gè)連續(xù)核苷酸，SEQ ID NO: 11由位于人Rbl基因的翻譯起始位點(diǎn)上游的約7kb的核苷酸組成。更優(yōu)選地，所述核酸片段含有SEQ ID NO: 12 (人RblE)的至少1，000、1，500,2, 000,2, 500,3, 000或3，498個(gè)連續(xù)核苷酸(另參見(jiàn)本文的實(shí)施例)?？蛇x擇優(yōu)選地，所述核酸片段含有 SEQ ID NO: 13 (人 P15C)的至少 1，000、1，500、2，000、2，500、3，000 或3，352個(gè)連續(xù)核苷酸。在某些實(shí)施例中，按照5’到3’的順序，根據(jù)本發(fā)明提供的表達(dá)盒包括作用為基因間轉(zhuǎn)錄源的核酸片段A-[啟動(dòng)子-根據(jù)本發(fā)明的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元(編碼目的基因產(chǎn)物和CLase可篩選標(biāo)記)_轉(zhuǎn)錄終止序列]-作用為基因間轉(zhuǎn)錄源的核酸片段B，其中，A和B可以相同或不同。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，A和B為SEQ ID NO: 12，或A和B為SEQID N0:13，或A和B為如上所述的SEQ ID NO’ s: 12和13中的一個(gè)的子片段。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體含有附加的可篩選標(biāo)記，例如如前所述的DHFR代謝可篩選標(biāo)記。這 種核酸構(gòu)建體的優(yōu)勢(shì)是通過(guò)使用與IRES可操作地連接的可篩選標(biāo)記例如博萊霉素、新霉素等，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)具有聞表達(dá)的宿主細(xì)胞的篩選，從而在篩選出具有高表達(dá)的宿主細(xì)胞后，停止抗生素的篩選，再使用附加的可篩選標(biāo)記進(jìn)行連續(xù)的或間歇的篩選。本實(shí)施方式中的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元至少是三順?lè)醋印?br> 優(yōu)選使用分離的核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)不同的目的基因產(chǎn)物，當(dāng)需要這些產(chǎn)物來(lái)形成多聚體蛋白的各部分時(shí)也是如此(參見(jiàn)例如W02006/048459的實(shí)施例13，通過(guò)引用將其納入本文):抗體的每個(gè)重鏈和輕鏈由本發(fā)明分離的轉(zhuǎn)錄單元所編碼。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)本發(fā)明的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元在單個(gè)的宿主細(xì)胞中被篩選出來(lái)時(shí)，優(yōu)選每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元含有用于不同可篩選標(biāo)記的編碼序列，促使兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的篩選。當(dāng)然，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元可以都存在于單個(gè)核酸分子中或每一轉(zhuǎn)錄單元可以存在于分離的核酸分子中。
第三方面，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體。
第四方面，本發(fā)明涉 及一種含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選真核宿主細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”和“細(xì)胞系”或“宿主細(xì)胞系”分別被定義為細(xì)胞或它們的同源群體，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法將它們?cè)谂囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，并具有表達(dá)異源或同源蛋白質(zhì)的能力。宿主是真核宿主細(xì)胞，例如真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是昆蟲(chóng)或脊椎動(dòng)物來(lái)源的動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是細(xì)胞系的細(xì)胞。W02006/048459 (例如第41-42頁(yè))已經(jīng)描述了可以使用的宿主細(xì)胞的一些示例，通過(guò)引用將其納入本文，這樣的細(xì)胞包括例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于CHO 細(xì)胞，例如 CHO-Kl、CHO-S, CH0-DG44、CH0-DG44-S、CH0-DP12、CH0-DUKXBI I，包括具有dhfr-表型的CHO細(xì)胞，以及骨髓瘤細(xì)胞(例如Sp2/0、NSO), HEK293細(xì)胞、HEK 294細(xì)胞和PER.C6細(xì)胞?？梢允褂玫乃拗骷?xì)胞的其他實(shí)例是U-2 OS骨肉瘤、HuNS-1骨髓瘤、WER1-Rb-1視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、BHK、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0_Agl4、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO和NC1-H295R腎上腺癌細(xì)胞系。
這樣的真核宿主細(xì)胞能夠表達(dá)所需的基因產(chǎn)物，并經(jīng)常被用于上述目的。優(yōu)選以本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體、表達(dá)盒或表達(dá)載體的形式將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中可以獲得這樣的真核宿主細(xì)胞。優(yōu)選將核酸構(gòu)建體整合到宿主細(xì)胞的基因組中，可以整合到各種宿主細(xì)胞的不同位置，篩選將提供克隆，在其中轉(zhuǎn)基因被整合到適當(dāng)?shù)奈恢?，依?jù)表達(dá)水平、穩(wěn)定性、生長(zhǎng)特性等方面性質(zhì)得到具有所需屬性的宿主細(xì)胞克隆。
或者，不含啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體可以被定向或隨機(jī)選擇地整合到具有轉(zhuǎn)錄活性的染色體區(qū)域，例如基因組中存在的啟動(dòng)子之后。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，通過(guò)篩選可篩選標(biāo)記多肽來(lái)進(jìn)行含有本發(fā)明的DNA的細(xì)胞的篩選。當(dāng)將這種不含啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體整合到基因組的啟動(dòng)子之后時(shí)，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體能夠在原位產(chǎn)生，也就是在宿主細(xì)胞的基因組內(nèi) 產(chǎn)生。
優(yōu)選地，宿主細(xì)胞來(lái)自穩(wěn)定的克隆，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)流程來(lái)篩選和繁殖該克隆。如果細(xì)胞含有本發(fā)明的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元，這種克隆的培養(yǎng)物能夠生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物。
可以通過(guò)幾種方法之一來(lái)引入將要在細(xì)胞中表達(dá)的核酸，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，也依賴于待引入的核酸的形式。所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、感染、注射、轉(zhuǎn)化等?？梢酝ㄟ^(guò)篩選來(lái)獲得適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)目的基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體被整合到本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞的基因組中。這將賦予核酸構(gòu)建體穩(wěn)定的遺傳性。
第五方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)用于表達(dá)目的基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞的方法，其中，該方法包括以下步驟:a)將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的表達(dá)載體引入多個(gè)宿主細(xì)胞中；b)在能夠篩選表達(dá)可篩選標(biāo)記多肽的條件下培養(yǎng)從a)中獲得的多個(gè)宿主細(xì)胞；和c)篩選至少一個(gè)表達(dá)可篩選標(biāo)記多肽的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)目的基因產(chǎn)物。
這一方法的優(yōu)勢(shì)和W02006/048459 (例如第46_47頁(yè))中公開(kāi)描述的方法的優(yōu)勢(shì)相似，通過(guò)引用將其納入本文。當(dāng)能夠獲得具有相對(duì)低拷貝數(shù)的核酸構(gòu)建體和高表達(dá)水平的克隆時(shí)，可以將本發(fā)明的篩選體系與擴(kuò)增方法結(jié)合從而進(jìn)一步改進(jìn)表達(dá)水平。例如這可以通過(guò)使用氨甲蝶呤擴(kuò)增共-整合的DHFR基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如將DHFR置于與本發(fā)明的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元相同的核酸分子上，或當(dāng)DHFR在分離的DNA分子上時(shí)使用共轉(zhuǎn)染。DHFR基因也可以是本發(fā)明核酸構(gòu)建體的一部分或是本發(fā)明表達(dá)載體的一部分。
篩選存在的可篩選標(biāo)記多肽并用于表達(dá)的過(guò)程可以在最初獲得宿主細(xì)胞的過(guò)程中進(jìn)行。在某個(gè)實(shí)施方式中，篩選劑至少在培養(yǎng)過(guò)程的部分時(shí)間中存在于培養(yǎng)基中，可以以足夠的濃度或以較低的濃度來(lái)篩選表達(dá)可篩選標(biāo)記的細(xì)胞。
第六方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)目的基因產(chǎn)物的方法，該方法包括培養(yǎng)含有本發(fā)明核酸構(gòu)建體或本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的宿主細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的宿主細(xì)胞，以及從核酸構(gòu)建體中表達(dá)目的基因產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物的最后階段過(guò)程中，篩選劑不再存在于培養(yǎng)基中，從而能夠避免可能存在的微量毒性篩選劑污染基因產(chǎn)物的任何風(fēng)險(xiǎn)。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)載體編碼免疫球蛋白重鏈或輕鏈或抗原結(jié)合部分，以及它們的衍生物和/或類似物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明的蛋白表達(dá)單元，其中所述目的蛋白是免疫球蛋白重鏈。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了根據(jù)本發(fā)明的蛋白表達(dá)單元，其中所述目的基因產(chǎn)物是免疫球蛋白輕鏈。當(dāng)這兩個(gè)蛋白表達(dá)單元存在于相同的(宿主)細(xì)胞中時(shí)，可組裝成多聚體蛋白特別是免疫球蛋白。因此，在某個(gè)實(shí)施方式中，目的蛋白是免疫球蛋白例如抗體，它是多聚體蛋白。優(yōu)選地，這種抗體是人或人源化抗體。在某個(gè)實(shí)施方式中，它是IgG、IgA或IgM抗體。免疫球蛋白可以在不同的表達(dá)載體上或在單一表達(dá)載體上編碼重鏈和輕鏈。因此，各個(gè)重鏈和輕鏈可以存在于分離的表達(dá)載體上，各自都具有它自己的啟動(dòng)子(兩個(gè)表達(dá)載體可以相同或不同)，各自都含有根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單元，重鏈和輕鏈?zhǔn)悄康幕虍a(chǎn)物，優(yōu)選各自編碼不同的可篩選標(biāo)記蛋白，以使得當(dāng)表達(dá)載體被引入和/或存在于真核宿主細(xì)胞時(shí)，能夠進(jìn)行重鏈和輕鏈表達(dá)載體的篩選。或者，編碼重鏈和輕鏈的序列可以存在于根據(jù)本發(fā)明的含有多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元的單一表達(dá)載體上，由單個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，其中輕鏈和 重鏈?zhǔn)撬鼈兏髯缘木幋a序列之間具有IRES的目的基因產(chǎn)物。
對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以使得它能夠代謝和/或生長(zhǎng)和/或分裂和/或產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括但不限于給細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。所述方法包括表面粘附生長(zhǎng)、懸浮生長(zhǎng)或它們的組合。使用批量(batch)、分批補(bǔ)料(fed-batch)、連續(xù)系統(tǒng)例如灌注系統(tǒng)等，例如可以在培養(yǎng)皿、搖瓶或生物反應(yīng)器中完成培養(yǎng)。為了通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模(連續(xù))生產(chǎn)重組基因產(chǎn)物，本領(lǐng)域優(yōu)選細(xì)胞能夠懸浮生長(zhǎng)，優(yōu)選地，細(xì)胞能夠在缺乏動(dòng)物或源自人的血清或缺乏動(dòng)物或源自人的血清組分的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
生長(zhǎng)或增殖細(xì)胞的條件(如Tissue Culture, Academic Press, Kruse andPaterson, editors (1973)所述)和表達(dá)重組產(chǎn)物的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的?？傮w而言，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)能力達(dá)到最大化的原理、方案和實(shí)用技巧在Ma_alianCell Biotechnology:a Practical Approach(M.Butler, ed., IRL Press, 1991)中有記載。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)目的基因產(chǎn)物的方法進(jìn)一步包括收獲目的基因產(chǎn)物?？梢允斋@、從細(xì)胞或從培養(yǎng)基、或從細(xì)胞和培養(yǎng)基中收集或分離表達(dá)的基因產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)。然后使用已知的方法將其純化，例如過(guò)濾、柱色譜法等，通常使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。
除非另外說(shuō)明，本發(fā)明的操作使用的是免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，這些是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。例如參見(jiàn)Sambrook，F(xiàn)ritschand Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd edition,1989;CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel FM，et al，eds，1987;the series Methods inEnzymology(Academic Press, Inc.);PCR2:APractical Approach, MacPherson MJ，HamsBDj Taylor GRj eds,1995;Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow and Lane，eds，1988.
。下面的實(shí)施例進(jìn)一步解釋了本發(fā)明。實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明，它們僅僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。
在本說(shuō)明書(shū)和它的權(quán)利要求中，使用動(dòng)詞“含有”和它的詞形變化形式非限制性指的是包括以下所述的項(xiàng)目，但沒(méi)有特別提到的項(xiàng)目并不排除在外。另外，涉及被不定冠詞“一”或“一個(gè)”修飾的要素，并不排除一個(gè)以上要素存在的可能性，除非上下文明顯另有所指是一個(gè)或只有一個(gè)要素。因此不定冠詞“一”或“一個(gè)”通常指的是“至少一個(gè)”。
通過(guò)引用將本說(shuō)明書(shū)中引用的所有專利和參考文獻(xiàn)將其整體納入本文。
下面的實(shí)施例僅以說(shuō)明為目的，并不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。


圖1:在嚴(yán)格篩選體系環(huán)境下，用于與人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子結(jié)合的啟動(dòng)子對(duì)克隆形成的影響。
圖2:在嚴(yán)格篩選體系環(huán)境下，用于與人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子結(jié)合的啟動(dòng)子對(duì)蛋白表達(dá)的影響。
圖3:在另一種嚴(yán)格篩選體系下，用于與人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子結(jié)合的啟動(dòng)子對(duì)克隆形成的影響。
圖4:在另一種嚴(yán)格篩選體系下，用于與人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子結(jié)合的啟動(dòng)子對(duì)蛋白表達(dá)的影響。
圖5:RPL32啟動(dòng)子對(duì)EPO蛋白表達(dá)的影響。
圖6:不同的RPL32啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)克隆形成和蛋白表達(dá)的影響。
圖7:與不同啟動(dòng)子結(jié)合的RPL32啟動(dòng)子對(duì)克隆形成的影響。
圖8:影響克隆形成和蛋白表達(dá)的RPL32啟動(dòng)子的特征。
圖9:在懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞中，RPL32結(jié)合對(duì)蛋白表達(dá)的影響。
圖10:在懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞中，RPL32結(jié)合對(duì)蛋白表達(dá)的影響。
具體實(shí)施方式
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實(shí)施例
1.實(shí)施例1:在嚴(yán)格篩選體系環(huán)境下，測(cè)試置于人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游的異源啟動(dòng)子對(duì)克隆形成和蛋白表達(dá)的影響
當(dāng)CH0-DG44被含有嚴(yán)格篩選標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，僅出現(xiàn)少量克隆或沒(méi)有克隆出現(xiàn)。這種嚴(yán)格篩選標(biāo)記可以為博萊霉素抗性標(biāo)記，所述博萊霉素抗性標(biāo)記已發(fā)生突變且其前面有一小肽，并且位于目的基因的下游，IRES之后(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))(見(jiàn)圖1)。然而，當(dāng)整個(gè)表達(dá)盒兩側(cè)均連接有STAR元件時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)更多的克隆，當(dāng)將400 μ g/ml博萊霉素添加到CH0-DG44培養(yǎng)基中時(shí)，克隆數(shù)通常在50-100/轉(zhuǎn)染的范圍內(nèi)(圖1)。一般地，產(chǎn)生的克隆表現(xiàn)出高蛋白表達(dá)水平。本文中，我們測(cè)試了于相同篩選條件下，在人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游插入異源啟動(dòng)子是否會(huì)誘導(dǎo)至少和STAR元件一樣多的CH0-DG44克隆。因此，我們使用的博萊霉素抗性標(biāo)記和STAR元件所使用的博萊霉素抗性標(biāo)記相同，即pp8Ze0EPP5。表達(dá)盒置于人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制下(圖1)。SEQ ID NO: 2中給出了整個(gè)表達(dá)盒的序列。SEQ ID Ν0:3中給出了參照構(gòu)建體的序列，其中，SEQ ID NO:2的表達(dá)盒的兩側(cè)與STAR元件連接(圖1)。
1.1 結(jié)果
選擇了 12個(gè)啟動(dòng)子用于測(cè)試:病毒CMV (viral CMV)和SV40啟動(dòng)子、人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子本身、人Y-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、人UBC、EFl-a、GAPDH基因的啟動(dòng)子、以及人核糖體基因RPL32、RPLP1、RPS21、RPL8和RPL42的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子通過(guò)以人基因組DNA為模板的PCR進(jìn)行分離(序列表中關(guān)于引物參見(jiàn)SEQ ID N0’s:14-47 ；F:正向，R:反向)。通過(guò)DNA測(cè)序?qū)?dòng)子的序列(identity)進(jìn)行驗(yàn)證。啟動(dòng)子被克隆到緊鄰(immediately)人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游。選擇具有STAR6/67/7組合的構(gòu)建體作為對(duì)照。另一對(duì)照為具有驅(qū)動(dòng)d2EGFP IRES pp8Ze0EPP5表達(dá)單元的人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，但不具有任何其它元件或異源啟動(dòng)子的構(gòu)建體(圖1)。
我們用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞。用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen)將所有構(gòu)建體相同數(shù)量的DNA (3 μ g)轉(zhuǎn)染至CH0-DG44細(xì)胞中。在含有400 μ g/ml博萊霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后添加博萊霉素。培養(yǎng)基由HAMF12:DMEM=1: 1+4.6%的胎牛血清組成。大約兩周后，計(jì)算穩(wěn)定的已產(chǎn)生的克隆數(shù)。如圖1所示，含有STAR7/67/7的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了 112個(gè)穩(wěn)定的克隆。不含有元件或啟動(dòng)子(陰性對(duì)照)的構(gòu)建體未產(chǎn)生克隆。使用的十種異源啟動(dòng)子獲得了同樣的結(jié)果，人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游含有RPL8的構(gòu)建體(55個(gè)克隆)，特別是含有RPL32啟動(dòng)子的構(gòu)建體(> 250個(gè)克隆)除外(圖1)。
分離了由指定的構(gòu)建體誘導(dǎo)的多達(dá)24個(gè)的獨(dú)立的克隆。轉(zhuǎn)染 6周后，繁殖克隆，然后用流式細(xì)胞儀分析(EPICS-XLM，Beckman-Coulter)。源自d2EGFP的熒光信號(hào)(非穩(wěn)定的)與細(xì)胞中存在的d2EGFP蛋白的量呈線性關(guān)系，因此它是細(xì)胞中d2EGFP表達(dá)水平的可靠的指標(biāo)。在單個(gè)FACS分析中，分析了來(lái)自含有多達(dá)4000個(gè)細(xì)胞的樣品的熒光信號(hào)。這種細(xì)胞樣品其中之一取自 獨(dú)立的、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。由于信號(hào)在克隆中的單個(gè)細(xì)胞之間不同，樣品中 4000個(gè)細(xì)胞的平均熒光水平被作為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆中d2EGFP表達(dá)水平的量度。
如圖2所示，將異源啟動(dòng)子置于人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游產(chǎn)生了不同的d2EGFP表達(dá)值。在譜的下端，置于人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游的CMV、EFl-α和RPL21啟動(dòng)子誘導(dǎo)了非常低的d2EGFP值(圖2)，也幾乎沒(méi)有任何克隆(圖1)。但重要的是，在含有RPL32-13-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子組合的構(gòu)建體中d2EGFP表達(dá)水平和在STAR7/67/7中誘導(dǎo)的d2EGFP值同樣高(圖2)。加上中間d2EGFP值(圖2)，僅RPL18啟動(dòng)子還產(chǎn)生了一些克隆(圖1)。
我們推斷，在CH0-DG44細(xì)胞中，將RPL32置于人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游，與d2EGFP IRES pp8ZeoEPP5表達(dá)單元組合，誘導(dǎo)了比與STAR7/67/7組合更多的克隆。另外，在這些克隆中的d2EGFP表達(dá)值和STAR7/67/7誘導(dǎo)的克隆的表達(dá)水平相同。
2.實(shí)施例2:在另一種嚴(yán)格篩選體系環(huán)境下，測(cè)試置于人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游的異源啟動(dòng)子對(duì)克隆形成和蛋白表達(dá)的影響
通過(guò)修飾博來(lái)霉素篩選標(biāo)記的翻譯起始密碼子構(gòu)建了另一種非常嚴(yán)格的博來(lái)霉素篩選標(biāo)記。這是特殊的具有TTG翻譯起始密碼子的博來(lái)霉素抗性標(biāo)記的情況，并被置于人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制下(見(jiàn)圖3)。在這種嚴(yán)格篩選標(biāo)記環(huán)境下，幾乎沒(méi)有克隆出現(xiàn)。然而，和d2EGFP IRES pp8ZeoEPP5博來(lái)霉素標(biāo)記的情況相同，當(dāng)TTG Zeo d2EGFP表達(dá)盒兩側(cè)均連接有STAR元件時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)更多的克隆，當(dāng)將400 μ g/ml博萊霉素添加到CH0-DG44培養(yǎng)基中時(shí)，克隆數(shù)通常在50-100/轉(zhuǎn)染的范圍內(nèi)(圖3)。當(dāng)具有TTG Zeo、兩側(cè)連接有STAR的質(zhì)粒時(shí)也如此，產(chǎn)生的克隆顯示了高蛋白表達(dá)水平。本文中，我們測(cè)試了于相同篩選條件下，在人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游插入異源啟動(dòng)子是否會(huì)誘導(dǎo)至少和STAR元件一樣多的CH0-DG44克隆。因此，我們使用的博萊霉素抗性標(biāo)記和STAR元件，TTG Zeo所使用的博萊霉素抗性標(biāo)記相同。將表達(dá)盒置于人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制之下(圖3)。
2.1.結(jié)果
選用與實(shí)施例1中相同的12種啟動(dòng)子用于測(cè)試:病毒CMV和SV40啟動(dòng)子、人β-肌動(dòng)蛋白異啟動(dòng)子本身、人Y-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、人UBC、EFl-a、GAPDH基因的啟動(dòng)子、以及人核糖體基因RPL32、RPLP1、RPS21、RPL8和RPL42的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子被克隆到緊鄰人β -肌動(dòng)蛋白異源啟動(dòng)子的上游。選擇具有STAR6/67/7組合的構(gòu)建體作為對(duì)照。另一對(duì)照為具有驅(qū)動(dòng)TTGZeo d2EGFP表達(dá)單元的人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，但不具有任何其它元件或異源啟動(dòng)子的構(gòu)建體(圖3)。
按照實(shí)施例1中的描述，我們用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞。如圖3所示，含有STAR7/67/7的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了 135個(gè)穩(wěn)定的克隆。不含有元件或啟動(dòng)子(陰性對(duì)照)的構(gòu)建體產(chǎn)生< 10個(gè)克隆。使用的十種異源啟動(dòng)子獲得了同樣的結(jié)果，人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游含有RPL8的構(gòu)建體(50個(gè)克隆)，特別是含有RPL32啟動(dòng)子的構(gòu)建體(> 350個(gè)克隆)除外(圖3)。整體上，在TTG Zeo標(biāo)記的環(huán)境下比在IRES pp8Ze0EPP5結(jié)構(gòu)的環(huán)境下誘導(dǎo)的穩(wěn)定的克隆數(shù)稍高(比較圖1和3)。
按照實(shí)施例1中的描述，分離了由指定的構(gòu)建體誘導(dǎo)的多達(dá)24個(gè)的獨(dú)立的克隆并確定了 d2EGFP值。如圖4所示，將異源啟動(dòng)子置于人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游產(chǎn)生了不同的d2EGFP表達(dá)值。在譜的下端，置于人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游的EFl-a啟動(dòng)子誘導(dǎo)了非常低的d2EGFP值(圖4)，和較少的克隆數(shù)(圖3)。相反地，置于人β_肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游的人Y-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子誘導(dǎo)了少量的克隆(圖3)，但在這些克隆中的d2EGFP表達(dá)水平較高(圖4)。重要的是，在含有RPL32-人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子組合的構(gòu)建體中d2EGFP表達(dá)水平和在STAR7/67/7中 誘導(dǎo)的d2EGFP值同樣高(圖4)。
在本次最后的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，我們還利用TTG Zeo作為篩選標(biāo)記測(cè)試了另一種報(bào)告蛋白。如圖5所示，置于人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游的RPL32比STAR7/67/7組合誘導(dǎo)了更多的克隆。在這些克隆中，EPO表達(dá)值與STAR元件和RPL32啟動(dòng)子的非常相似(圖5)。
我們推斷，在CH0-DG44細(xì)胞中，將RPL32置于人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游，與TTG Zeo篩選標(biāo)記組合，誘導(dǎo)了比與STAR7/67/7組合更多的克隆。另外，在這些克隆中的d2EGFP表達(dá)值以及EPO蛋白表達(dá)水平與STAR7/67/7誘導(dǎo)的克隆中的表達(dá)水平相同。結(jié)合實(shí)施例1，這些結(jié)果顯示，在兩種不同的嚴(yán)格篩選體系和多種報(bào)告基因的環(huán)境中，RPL32啟動(dòng)子發(fā)揮了其積極的作用。
3.實(shí)施例3:將RPL32置于表達(dá)構(gòu)建體中的結(jié)構(gòu)的影響和RPL32啟動(dòng)子對(duì)其它啟動(dòng)子的影響
我們測(cè)試了構(gòu)建體中RPL32啟動(dòng)子的位置是否會(huì)對(duì)誘導(dǎo)的克隆的數(shù)量和d2EGFP表達(dá)值產(chǎn)生影響。我們還測(cè)試了是否是RPL32，而不是人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子對(duì)其它啟動(dòng)子具有有益影響。
3.1 結(jié)果
我們構(gòu)建了將RPL32置于人β _肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游、整個(gè)表達(dá)盒下游或人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和報(bào)告基因之間的構(gòu)建體(圖6)。另外，我們?cè)诒磉_(dá)盒的上游和下游均插入了 RPL32。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞，按照如上描述的對(duì)克隆計(jì)數(shù)，并確定這些克隆中的d2EGFP表達(dá)值。如圖6所示，在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)將RPL32啟動(dòng)子置于整個(gè)表達(dá)盒下游時(shí)產(chǎn)生了大部分克隆。將單一 RPL32啟動(dòng)子置于人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游的構(gòu)建體誘導(dǎo)了稍少的克隆，但幾乎為使用兩個(gè)RPL32啟動(dòng)子與整個(gè)表達(dá)盒兩側(cè)連接時(shí)的兩倍(圖6)。當(dāng)將RPL32啟動(dòng)子置于β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游時(shí)沒(méi)有克隆形成，但在這種結(jié)構(gòu)中，RPL32啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向不受肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的影響(圖6)。這表明源于RPL32啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄必須通過(guò)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子進(jìn)行。當(dāng)確定了各個(gè)克隆中的d2EGFP值時(shí)，我們觀察到“單個(gè)”RPL32-13-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)了最高的平均d2EGFP表達(dá)水平(圖6)。由使用兩個(gè)RPL32啟動(dòng)子的質(zhì)粒或由單個(gè)RPL32啟動(dòng)子置于β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下游的質(zhì)粒誘導(dǎo)的d2EGFP值大大降低(圖6)。
接下來(lái)，我們測(cè)試了將RPL32置于啟動(dòng)子但不是β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游是否也會(huì)導(dǎo)致大量克隆的形成和d2EGFP表達(dá)值。我們將RPL32啟動(dòng)子置于CMV和SV40啟動(dòng)子的上游(圖7)，作為對(duì)照，我們?cè)贑MV和SV40驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體的兩側(cè)連接了 STAR7/67/7組合。如圖7所示，我們發(fā)現(xiàn)將RPL32啟動(dòng)子置于CMV啟動(dòng)子的上游與STAR7/67/7組合相比，誘導(dǎo)了 > 3倍的克隆。使用SV40啟動(dòng)子，RPL32誘導(dǎo)了與STAR7/67/7組合數(shù)量相等的克隆(圖7)。當(dāng)確定了這些各個(gè)克隆中的d2EGFP表達(dá)水平時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)RPL32-13-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子組合誘導(dǎo)了與STAR7/67/7組合相同的d2EGFP表達(dá)水平(圖7)，這也在以上實(shí)施例1和2中觀察到了。然而，使用CMV和SV40啟動(dòng)子，RPL32啟動(dòng)子與STAR7/67/7組合相比，誘導(dǎo)了高得多的d2EGFP表達(dá)水平(圖7 )。
因此，我們推斷，置于不同啟動(dòng)子上游的RPL32啟動(dòng)子在誘導(dǎo)克隆數(shù)量和蛋白表達(dá)水平方面對(duì)這些啟動(dòng)子均具有有益的影響。
4.實(shí)施例4:RPL32啟動(dòng)子的方向和功能元件對(duì)于它對(duì)人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的影響是重要的。
我們測(cè)試了哪些要素決定了 RPL32對(duì)人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的積極作用。
4.1 結(jié)論
RPL32啟動(dòng)子缺乏典型的TATA盒，RPL32啟動(dòng)子的β結(jié)合位點(diǎn)包括DNA序列元件(CGGAAC)并結(jié)合 Ets-相關(guān)蛋白 GA-結(jié)合蛋白(GABP) (Thompson et al.，1991，Science253:762-8;Macleod et al.,1992，Trends Biochem Sci17:251-6;Yoganathan etal.，1992a，Biochem.1287:349-53; Genuario et al.，1993，Gene Exprf: 279-88)。盡管在RPL32基因啟動(dòng)子中缺乏典型的TATA元件，但不在其它因子的幫助下，TATA-結(jié)合蛋白(TBP)能夠與加帽位點(diǎn)(cap site)上游3 0個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域相互作用(Yoganathan etal., 1992b, Biochem T285:721~3)0該區(qū)域包括Y因子的結(jié)合位點(diǎn)，表明在RPL32基因的轉(zhuǎn)錄中，Y因子可以與TBP起到相似的作用。
如圖8Α中所示，我們敲除了最初分離的3220bp的RPL32啟動(dòng)子區(qū)的5’和3’的幾個(gè)部分。另外，我們敲除了緊鄰含有上述認(rèn)為重要的結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的IOObp(圖8A)。我們稱該構(gòu)建體為-1918-Λ-1302 (圖8Β)。我們用各個(gè)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CH0-DG44細(xì)胞。如圖8Α所示，我們發(fā)現(xiàn)，RPL32的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的IOObp對(duì)于它對(duì)人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的影響是重要的。含有-1918-Λ-1302啟動(dòng)子構(gòu)建體的構(gòu)建體沒(méi)有形成克隆。出人意料的是，5’或3’位點(diǎn)的敲除(分別為-1918-504和-691-1302，分別對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:1的1-2423和1236-3220的位置)，與RPL32啟動(dòng)子片段全長(zhǎng)(-1918-1302，即，整個(gè)SEQ IDΝ0:1)相比，導(dǎo)致了克隆數(shù)量的增加。任何一種情況下，平均d2EGFP值非常相似。然而，進(jìn)一步縮短(分別為-1918-94 和-137-1302，分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO:1 的 1-2013 和 1782-3220的位置)導(dǎo)致了克隆數(shù)量的急劇下降(圖SB)。在這些克隆中，d2EGFP值也急劇降低。根據(jù)這些結(jié)果會(huì)認(rèn)為敲除5’或3’位點(diǎn)的大部分并沒(méi)有影響，但事實(shí)并非如此。使用這種構(gòu)建體(-691-504，對(duì)應(yīng)SEQ ID N0:1的1236-2423的位置)，克隆數(shù)量和d2EGFP值均降低了(圖SB)，表明為獲得完全有益的效果，需要RPL32啟動(dòng)子區(qū)的大部分區(qū)域。
我們推斷，功能性RPL32啟動(dòng)子對(duì)于它對(duì)人β _肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的有益影響是重要的，并且，RPL32啟動(dòng)子的方向必須為RPL32的轉(zhuǎn)錄和人β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄在相同的方向上。最后，在克隆形成和基因表達(dá)水平方面，對(duì)啟動(dòng)子起有益作用的RPL32啟動(dòng)子內(nèi)的確切區(qū)域的精確定位是復(fù)雜的。
5.實(shí)施例5:在無(wú)血■清懸浮轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)條件下RPL32啟動(dòng)子的作用
以上描述的實(shí)驗(yàn)均在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。但是，啟動(dòng)子和基因活性增強(qiáng)元件在無(wú)血清培養(yǎng)條件下作用可能不同。因此，我們?cè)跓o(wú)血清條件下，用對(duì)照和含有構(gòu)建體的RPL32轉(zhuǎn)染懸浮的CH0-DG44-S懸浮細(xì)胞(Gibco/Invitrogen CatalogueN0.12609-012;www.1nvitrogen.com),同樣地,在無(wú)血清懸浮條件下培養(yǎng)它們。
5.1 結(jié)果
在補(bǔ)加有200mM谷氨酰胺、普朗克尼酸(pluronic acid)和抗凝結(jié)劑(ant1-clumping agent)的無(wú)血清 CD-DG44 培養(yǎng)基中于搖床(130rpm)上 37°C /8%C02 下培養(yǎng)野生型CH0-DG44-S 懸浮細(xì)胞。每2-3天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。使用核轉(zhuǎn)染試劑盒V(Nucleofection-kit Amaxa V),按照說(shuō)明書(shū)的描述,通過(guò) Amaxa Nucleofector 轉(zhuǎn)染(核轉(zhuǎn)染)細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，在培養(yǎng)基中添加ITS，并在培養(yǎng)箱中平衡所述培養(yǎng)基，以調(diào)整pH。對(duì)于每次核轉(zhuǎn)染，將生長(zhǎng)至密度在7X IO5和1父106之間，并且存活率(^&1^1^7)>90%的IXlO6的野生型DG44-S細(xì)胞，在外擺式離心機(jī)中進(jìn)行離心(900rpm，5min)。將細(xì)胞沉淀溶于100 μ I核轉(zhuǎn)染溶液中，并加入5yg的DNA (于5μ1體積中)。將樣品轉(zhuǎn)移至透明小容器中，并在Amaxa Nucleofector中進(jìn)行電轉(zhuǎn)染(使用U_30程序),之后將樣品轉(zhuǎn)移至均衡培養(yǎng)基中(在6-孔培養(yǎng)板中)。5-6小時(shí)后，將總體積5ml的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25 (懸浮液)培養(yǎng)瓶。48小時(shí)后，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加50 μ g/ml的博來(lái)霉素開(kāi)始篩選。每2-3天更換一次培養(yǎng)基。在接下來(lái)的3周，檢測(cè)細(xì)胞的存活率，如果可以，確定d2EGFP表達(dá)水平。
核轉(zhuǎn)染3周后，將5000-10000個(gè)活細(xì)胞/ml倒入半固體培養(yǎng)基中(Genetix)中以形成亞克隆。10天后，分離克隆并轉(zhuǎn)移至含有100 μ I培養(yǎng)基的96-孔培養(yǎng)板中。又過(guò)一周后，可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24-孔板(含有0.5ml培養(yǎng)基)。此時(shí)，F(xiàn)ACS或ELISA試驗(yàn)確定d2EGFP、EPO或抗體的表達(dá)水平。在T25培養(yǎng)瓶中(含有5ml培養(yǎng)基)培養(yǎng)以使篩選的亞克隆增殖。另過(guò)2-3周后，第二次測(cè)量d2EGFP、EP0或抗體的表達(dá)水平。
通過(guò)以下元件驅(qū)動(dòng)下列構(gòu)建體
I單獨(dú)的CMV啟動(dòng)子，兩側(cè)沒(méi)有連接任何元件，
2CMV啟動(dòng)子，但兩側(cè)連接有STARs7/67/7，
3單獨(dú)的RPL32啟動(dòng)子，兩側(cè)沒(méi)有連接任何元件，
4CMV啟動(dòng)子，具有置于上游的RPL32啟動(dòng)子
作為篩選標(biāo)記，使用pp8Ze0EPP5突變(圖9)。核轉(zhuǎn)染2周后，作為不同構(gòu)建體效果的量度，我們確定了懸浮群中的綠色熒光細(xì)胞的百分率。如圖9所示，2周后，提供單獨(dú)的CMV啟動(dòng)子僅顯示了 7%的綠色細(xì)胞，作為單獨(dú)啟動(dòng)子的RPL32也如此(8%)。只有將元件添加到構(gòu)建體上時(shí)，核轉(zhuǎn)染2周后，綠色細(xì)胞的百分率才有顯著的增加。側(cè)面連接STAR元件時(shí)，百分率上升至15%，將RPL32啟動(dòng)子置于CMV啟動(dòng)子上游時(shí)，上升至35% (圖9)。
當(dāng)確定了 d2EGFP，核轉(zhuǎn)染3周后，我們注意到平均d2EGFP表達(dá)值與2周后綠色細(xì)胞的百分率非常接近。具有單獨(dú)CMV或RPL32啟動(dòng)子的d2EGFP表達(dá)值較低(圖9)，側(cè)面連接STAR元件的有所增加，且連接RPL32啟動(dòng)子的最高。這些結(jié)果顯示了在懸浮生長(zhǎng)的CH0-DG44-S細(xì)胞中，RPL32啟動(dòng)子也是增加基因表達(dá)細(xì)胞數(shù)量以及d2EGFP表達(dá)值的有效工具。
我們還確定了在類似的構(gòu)建體中RPL32啟動(dòng)子的效果，但使用EPO作為報(bào)告基因，而不是d2EGFP基因。因此，我們用EPO基因替換了 d2EGFP基因。在這種情況下，我們不能使用產(chǎn)生細(xì)胞的％作為核轉(zhuǎn)染效果的量度，因此，我們直接確定了從半固體培養(yǎng)基中分離的6個(gè)克隆中每個(gè)構(gòu)建體的EPO體積產(chǎn)量(μ g/ml/天)。如圖10所示，我們發(fā)現(xiàn)EPO表達(dá)和d2EGFP表達(dá)的趨勢(shì)相同。單獨(dú)的CMV和RPL32是很沒(méi)有效果的。使用STAR元件EPO表達(dá)水平有所增加，但在C MV啟動(dòng)子上游具有RPL32啟動(dòng)子的最高。我們推斷，例如EPO的分泌蛋白，置于另一啟動(dòng)子上游的RPL32啟動(dòng)子也是增強(qiáng)這種第二啟動(dòng)子活性的有效工具。
權(quán)利要求
1.一種核酸構(gòu)建體,該核酸構(gòu)建體包括: a)與含有至少1187個(gè)來(lái)自SEQID NO:1的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性并含有SEQ ID NO:1的1782-1921位核苷酸殘基的核酸片段；以及， b)含有與編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子的表達(dá)盒， 其中，片段與表達(dá)盒的連接方向使得片段中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)盒中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄在同一方向上， 并且，其中，在實(shí)施例1的條件下進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)片段與具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的表達(dá)盒直接在表達(dá)盒的上游側(cè)面連接且連接方向使片段中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄與SEQ IDNO:2中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄在同一方向上時(shí)，與在表達(dá)盒的上游側(cè)面連接STARs7和67和在表達(dá)盒的下游側(cè)面連接STAR 7的相同表達(dá)盒(SEQ ID NO:3)相比，產(chǎn)生至少50%的克隆數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述含有至少1187個(gè)來(lái)自SEQID NO:1的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1的1236-2423位核苷酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述含有至少1187個(gè)來(lái)自SEQID NO:1的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1的1236-3220位核苷酸殘基或1-2423位核苷酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述核酸片段選自由以下核酸片段所組成的組中:與含有 SEQ ID NO:1 的 1236-2423、1782-3220、1236-3220、1-2013、1-2423 或1-3220 位核苷酸殘基(或由 SEQ ID NO:1 的 1236-2423、1782-3220、1236-3220、1-2013、1-2423或1-3220位核苷酸殘基組成)的核苷酸序列具有至少80%的序列同一'I"生的核酸片段。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述核酸片段位于所述表達(dá)盒的上游和下游的至少一處(位于所述表達(dá)盒的上游、下游、或上游和下游)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體，其中，表達(dá)盒上游的核酸片段和表達(dá)盒下游的核酸片段不同。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述表達(dá)盒進(jìn)一步含有在真核宿主細(xì)胞中具有功能的編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述可篩選標(biāo)記提供對(duì)篩選劑的致死效應(yīng)或生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的抗性，所述篩選劑選自以下組成的組中:博萊霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟素、潮霉素、新霉素、氨 甲蝶呤、氨基亞砜蛋氨酸和卡那霉素。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列至少是下列核苷酸序列其中之一: a)在起始密碼子中具有突變的核苷酸序列，該突變能夠降低可篩選標(biāo)記多肽在真核宿王細(xì)胞中的翻譯起始效率； b)作為多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元一部分的核苷酸序列，所述多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元含有:i)編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列；和ii)含有在5'至3'方向上的翻譯起始密碼子、至少一個(gè)氨基酸密碼子和翻譯終止密碼子的功能性開(kāi)放讀碼框；其中所述功能性開(kāi)放讀碼框的終止密碼子位于編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列的獨(dú)立翻譯起始密碼子的上游的0-250個(gè)核苷酸處，其中分隔功能性開(kāi)放讀碼框的終止密碼子和編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列的獨(dú)立翻譯起始密碼子的序列缺乏翻譯起始密碼子；以及C)含有突變的編碼可篩選標(biāo)記多肽的核苷酸序列，該突變編碼至少一個(gè)氨基酸置換，與其相應(yīng)的野生型相比，可篩選標(biāo)記多肽的活性降低。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中，編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列和編碼目的基因產(chǎn)物的核苷酸序列存在于單個(gè)多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元中，其中所述多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元與啟動(dòng)子和位于多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單元下游的轉(zhuǎn)錄終止序列可操作地連接。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述表達(dá)盒中的啟動(dòng)子是β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、泛素C啟動(dòng)子或EFl- α啟動(dòng)子。
12.—種表達(dá)載體,該表達(dá)載體含有權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)定義的核酸片段或根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體。
13.—種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是細(xì)胞系的細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞系選自以下組成的組中:U-20S骨肉瘤、CHO、CHO-Kl、CH0-DG44、CH0-DG44-S、CH0-DP12、CH0-DUKXBI 1、PER.C6、HEK293、HuNS-1骨髓瘤、WER1-Rb-1視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、BHK、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0_Agl4、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO和NC1-H295R腎上腺癌細(xì)胞系。
17.—種生產(chǎn)用于表達(dá)目的基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞的方法，其中，該方法包括以下步驟: a)將根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體引入多個(gè)宿主細(xì)胞中； b)在篩選表達(dá)可篩選標(biāo)記多肽的條件下培養(yǎng)從a)中獲得的多個(gè)宿主細(xì)胞；和 c)篩選至少一個(gè)表達(dá)可篩選標(biāo)記多肽的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)目的基因產(chǎn)物。
18.—種表達(dá)目的基因產(chǎn)物的方法,該方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13-16中任意一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法獲得的宿主細(xì)胞，以及從核酸構(gòu)建體中表達(dá)目的基因廣物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，所述方法還包括收獲所述目的基因產(chǎn)物。
20.一種核酸片段，該核酸片段與含有至少1187個(gè)來(lái)自SEQ ID NO:1的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性并含有SEQ ID NO:1的1782-1921位核苷酸殘基，其中，在實(shí)施例1的條件下進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)片段與具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的表達(dá)盒直接在表達(dá)盒的上游側(cè)面連接且連接方向使片段中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄與SEQ ID N0:2中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄在同一方向上時(shí)，與在表達(dá)盒的上游側(cè)面連接STARs 7和67和在表達(dá)盒的下游側(cè)面連接STAR 7的相同表達(dá)盒(SEQ ID NO:3)相比，產(chǎn)生至少50%的克隆數(shù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸片段，其中，所述含有至少1187個(gè)來(lái)自SEQID NO:1的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1的1236-2423位核苷酸殘基。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸片段，其中，所述含有至少1187個(gè)來(lái)自SEQID NO:1的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1的1236-3220位核苷酸殘基或1-2423位核苷酸殘基。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸片段，其中，所述核酸片段選自由以下核酸片段所組成的組中:與含有 SEQ ID NO:1 的 1236-2423、1782-3220、1236-3220、1-2013、1-2423 或1-3220 位核苷酸殘基(或由 SEQ ID NO:1 的 1236-2423、1782-3220、1236-3220、1-2013、1-2423或1-3220位核苷酸殘基組成)的核苷酸序列具有至少80%的序列同一'I"生的核酸片段。
24.一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體含有根據(jù)權(quán)利要求20-23中任意一項(xiàng)所述的核酸片段，其中，片段至少和一個(gè)核苷酸連接，所述核苷酸在片段來(lái)源的基因組中不直接與片段發(fā)生天然連 接。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有來(lái)自60S核糖體蛋白L32基因(RPL32)的啟動(dòng)子區(qū)的基因組核苷酸序列的核酸片段和構(gòu)建體，用于在真核宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中在嚴(yán)格可篩選標(biāo)記存在的條件下生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，生產(chǎn)所述宿主細(xì)胞的方法和使用所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/85GK103180443SQ201180050335
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者A·P·奧特, F·霍克薩馬, J·A·沃赫斯, H·J·M·范布洛克蘭德 申請(qǐng)人:薩拉基尼克有限公司