專利名稱：用于分析受試者血樣中疾病標記物的存在的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療診斷領域，具體地屬于疾病診斷和監(jiān)測領域。本發(fā)明涉及一種用于檢測疾病的標記物，涉及一種用于檢測疾病的方法，以及涉及一種用于確定疾病治療療效的方法。
背景技術：
在臨床實踐中，強烈需求能夠在疾病早期階段檢測疾病以預測疾病的進展，并進行為病人定制的治療。特別是腫瘤性疾病(癌癥)的早期發(fā)現(xiàn)是至關重要的，以確保疾病的有利治療。盡管醫(yī)學研究中的許多進展，癌癥仍然是全球死亡的一個重要原因。當患者求醫(yī)時，他們一般都表現(xiàn)出遠處轉移癥狀，意為往往發(fā)現(xiàn)癌癥為時已晚。肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌是最常見的腫瘤，并為了通過手術切除、放療、化療或其他已知的治療方法有利于適當?shù)难a救行動，需要快速且簡單的用于癌癥的早期診斷的方法。同樣重要的是用于癌癥的好診斷方法的可用性以評估患者對治療的反應，或評估由于在原來位置的再生或轉移的復發(fā)。目前已知幾種類型的癌癥標記物，例如，癌基因產物、生長因子和生長因子受體、血管生長因子、蛋白酶、粘附因子和腫瘤抑制基因產物等，它們不僅被認為對于早期診斷是必要的，而且對于不明確的臨床異常情況的患者的區(qū)別診斷也是必要的，例如區(qū)分惡性和良性異常情況；預測已確定惡性的具體患者對選擇的治療方法的治療可能的反應；以及提供與人或動物受試者中惡性的風險、存在、狀態(tài)，或未來的行為有關的信息。目前，通過檢測腫瘤或癌癥標記物來檢測和診斷癌癥的能力是廣泛關注的領域，并因此存在對在患者標本中鑒定新的和更有用的腫瘤標記物的可重復的和可靠的方法的需求。膠質母細胞瘤是最常見的和最惡劣的人類原發(fā)性腦腫瘤類型。部分地由于阻礙了治療藥物的傳遞和潛在的重要的診斷標記物的檢測的血腦屏障，該疾病很難診斷并且治療甚至更難。膠質母細胞瘤的診斷標記物是可獲得的，但只針對腫瘤組織本身并且需要腫瘤樣品。為在早期階段檢測癌癥并跟進疾病的進展，需要改進的篩選和檢測方法。在癌癥的情況下，我們的狀態(tài)下，我們不僅需要檢測腫瘤，而且還需要在它已達到不可返回的點之前檢測它，此時治療成為姑息治療而非治愈性治療。高危人群以及具有復發(fā)性癌癥的患者，應廣泛進行監(jiān)控。此外，因為腫瘤對不同的治療方法能有不同的反應，病人分層變得非常重要。使用腫瘤活檢的遺傳分析已經允許對癌癥的診斷和新興的病人分層策略有用的許多突變的鑒定。然而，當前腫瘤的遺傳分析的缺點是需要腫瘤活檢，這往往不可能解剖患者。此外，使用的活檢是靜態(tài)的，并且不允許遺傳監(jiān)測隨時間推移的腫瘤惡化或復發(fā)。而且，許多腫瘤是異質的，從而導致這類腫瘤活檢的潛在的假陽性或假陰性的遺傳特性。最近，將循環(huán)腫瘤細胞用于腫瘤進展或復發(fā)的診斷和監(jiān)測表明將血液用作腫瘤來源的材料源，特別是細胞形式的組織碎片。然而，循環(huán)腫瘤細胞的使用對于大多數(shù)癌癥是無效的。一般情況下，疾病標記物定義為，與正常健康受試者比較時，患病患者的生物流體中濃度改變，優(yōu)選濃度升高的化合物，并且其隨后可用作表明疾病的標記物化合物。然而，在多種體液中作為疾病例如癌癥的標記物的具體化合物例如蛋白質的鑒定，已經由缺乏其合適的技術而受到阻礙。另外，在癌癥以外的疾病的情況下，標記物可以利用但難以檢測。這阻礙疾病的早期診斷。本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術的問題:并非所有患病組織或疾病類型(例如腫瘤)都產生循環(huán)患病細胞(例如循環(huán)腫瘤細胞)。本發(fā)明還旨在克服用于檢測疾病例如癌癥的蛋白質標記物難以檢測的問題。另外，本發(fā)明旨在提供不需要活檢并允許廣泛監(jiān)測患者的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一方面提供一種分析受試者血樣中疾病標記物的存在的方法。所述方法包括下述步驟:a)從所述血樣的無核血細胞,優(yōu)選凝血細胞(thrombocyte)中提取核酸，以提供無核血細胞提取的核酸片段(fraction)，以及b)分析所述無核血細胞提取的核酸片段中疾病標記物的存在，其中，所述疾病標記物是所述受試者的有核細胞的基因中的疾病特異突變，或其中所述疾病標記物是所述受試者的有核細胞的基因的疾病特異表達譜(expression profile)。本文使用的術語“無核血細胞”指沒有細胞核的細胞。該術語包括對紅細胞和凝血細胞的引用。在本發(fā)明各方面中無核細胞的優(yōu)選實施方式是凝血細胞。術語“無核血細胞”優(yōu)選不包括對作為錯誤的細胞分裂的結果而沒有細胞核的細胞的引用。本文使用的術語“有核細胞”指具有細胞核的細胞。該術語包括對體細胞、生殖細胞和干細胞的引用，并且可包括來自結腸、胰腺、腦、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宮、肝、腎、脾、胸腺、甲狀腺、神經組織、結締組織、血液、上皮組織、淋巴結、骨、肌肉和皮膚組織的細胞。有核細胞優(yōu)選來自病變組織的細胞。因此，本發(fā)明一般旨在分析從有細胞核的細胞已轉移到沒有細胞核的細胞中的核酸，其中，所述沒有細胞核的細胞能容易地從血液流中分離并包含來自有核細胞的核酸。術語“細胞核”指在真核細胞中發(fā)現(xiàn)的膜封閉的細胞器，其包含大部分以染色體形式組織的細胞的遺傳物質。這些染色體內的基因是細胞的核基因組。細胞核的內部包含一些亞核體(subnuclear body),該亞核體包括主要參與含RNA的核糖體的組裝的含RNA的核糖體。在細胞核內產生后，核糖體輸出至它們翻譯mRNA的細胞質。無核血細胞提取的核酸片段優(yōu)選是指包括染色體DNA、核糖體RNA、細胞核RNA和/或信使RNA的片段。本文所用的術語“基因”，并且特別是表述為“有核細胞的基因中的突變”的術語意思是指有核細胞(體細胞)的染色體和染色體外的任何核酸序列，優(yōu)選細胞核核酸序列，并且可包括轉錄序列和非轉錄序列以及核糖體RNA序列，最優(yōu)選轉錄成RNA的染色體序列。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方式中，所述疾病特異突變發(fā)生在染色體基因內。在另一優(yōu)選實施方式中，所述基因不是來自無核血細胞的基因。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方式中，所述疾病特異表達譜是染色體基因表達譜。具體地來自有核細胞的染色體基因，它的mRNA存在于凝血細胞中。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方式中，所述核酸是核糖核酸(RNA)，更優(yōu)選是信使核糖核酸(mRNA)。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方式中，所述核酸不是mtDNA。因此，線粒體核酸優(yōu)選不是本發(fā)明的方面。在根據(jù)本發(fā)明分析血樣的方法的另一優(yōu)選實施方式中，分析所述無核血細胞提取的核酸片段中疾病標記物的存在的所述步驟b)包括選擇性擴增:i)所述突變，使用至少一種核酸突變特異擴增引物或探針，通過反轉錄酶聚合酶鏈反應擴增，或ii)多個mRNA，通過反轉錄酶聚合酶鏈反應擴增，以確定編碼所述mRNA的染色體基因的表達水平，由此以提供所述基因的表達譜，并將所述表達譜與參考譜進行比較。優(yōu)選血樣在體外。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方式中，所述疾病選自由癌癥、自身免疫性疾病、皮膚疾病、眼疾病、內分泌疾病、神經紊亂以及心血管疾病組成的組。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方式中，所述疾病選自由自身免疫性疾病、皮膚疾病、眼疾病、內分泌疾病、神經紊亂以及心血管疾病組成的組。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方式中，所述疾病是癌癥。在本發(fā)明方法的又一優(yōu)選實施方式中，所述癌癥是優(yōu)選選自結腸、胰腺、腦、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宮、肝、腎、脾、胸腺、甲狀腺、神經組織、上皮組織、淋巴結、骨、肌肉和皮膚的實體腫瘤癌癥。在本發(fā)明各方面的優(yōu)選實施方式中，自體免疫性疾病選自由下述疾病組成的組:胃酸缺乏自身免疫性主動慢性肝炎；急性播散性腦脊髓炎；急性出血性腦白質炎；阿狄森氏??；無丙種球蛋白血癥；斑禿；肌萎縮側索硬化癥；強直性脊柱炎；反GBM/TBM腎炎；抗磷脂綜合癥；抗合成酶綜合癥；多發(fā)性關節(jié)炎；特應性變態(tài)反應；特應性皮炎；自身免疫性再生障礙性貧血；自身免疫性心肌?。蛔陨砻庖咝阅c?。蛔陨砻庖咝匀苎载氀?；自身免疫性肝炎；自身免疫性內耳??；自身免疫性淋巴細胞增生性綜合癥；自身免疫性周圍神經病變；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性多內分泌腺綜合癥；自身免疫性黃體酮皮炎；自身免疫性血小板減少性紫癜；自身免疫性葡萄膜炎；巴洛疾病/巴洛同心硬化癥；白塞氏綜合癥；貝格爾氏疾病；比克斯塔夫腦炎；布勞綜合癥(Blau syndrome);大皰性類天皰瘡；卡斯爾曼疾病(Castleman’ s disease);脂瀉??；美洲錐蟲??；慢性疲勞免疫功能障礙綜合癥；慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經??；慢性復發(fā)性多灶性骨髓炎；慢性萊姆疾??；慢性阻塞性肺疾??；變應性肉芽腫性血管炎(Churg-Strauss syndrome);瘢痕性類天皰瘡；乳糜灣；耳蝸前庭綜合癥；冷凝集素疾?。谎a體成分2不足；顱動脈炎；CREST綜合癥；克羅恩氏疾??；庫欣氏綜合癥；皮膚白細胞破碎性血管炎；惡性萎縮性丘疹病(Dego’ s disease);德爾肯氏疾??；皰疹樣皮炎；皮肌炎；1型糖尿??；彌漫性皮膚全身性硬化癥；德雷斯勒綜合癥；盤狀紅斑狼瘡；濕疹；子宮內膜異位癥；起止點炎相關的關節(jié)炎；嗜酸性筋膜炎；嗜酸細胞性胃腸炎；獲得性大皰性表皮松解癥；結節(jié)性紅斑；特發(fā)性混合性冷球蛋白血癥；伊文氏綜合癥；進行性骨化性纖維增殖不良癥；纖維肌痛/纖維肌炎；纖維性肺泡炎(Fibrosingaveolitis);胃炎；胃腸道類天皰瘡；巨細胞動脈炎；腎小球腎炎；肺出血腎炎綜合癥；格雷夫斯氏疾??；吉蘭-巴雷綜合癥；橋本氏腦炎；橋本氏甲狀腺炎；溶血性貧血；過敏性紫癜；妊娠皰疹；化膿性汗腺炎；休斯綜合癥；低丙球蛋白血癥；特發(fā)性炎癥性脫髓鞘性疾?。惶匕l(fā)性肺纖維化；特發(fā)性血小板減少性紫癜；IgA腎??；包涵體肌炎；炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病變；間質性膀胱炎；腸易激綜合癥(IBS);幼年特發(fā)性關節(jié)炎；幼年類風濕關節(jié)炎；川崎??；蘭伯特-伊頓肌無力綜合癥；白細胞破碎性血管炎；扁平苔蘚；硬化性苔蘚；線性IgA疾??；盧伽雷氏??；狼瘡樣肝炎；紅斑狼瘡；馬吉德綜合癥；梅尼埃疾??；顯微鏡下多血管炎；米勒-費雪綜合癥；混合性結締組織疾??；硬斑疾?。荒緰?赫伯曼疾??；穆-韋二氏綜合癥；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性硬化癥；重癥肌無力；肌炎；發(fā)作性睡??；視神經脊髓炎；神經性肌強直；眼瘢痕性類天皰瘡；視性眼陣攣肌陣攣綜合癥；奧德甲狀腺炎；復發(fā)性風濕??；伴鏈球菌感染性小兒自身免疫性神經精神??；副腫瘤性小腦變性；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥；帕-羅二氏綜合癥；帕森-特納綜合癥(Parsonnage-Turner syndrome);睫狀體平坦部炎；天皰瘡；尋常型天皰瘡；惡性貧血；靜脈周圍性腦脊髓炎；P0EMS綜合癥；結節(jié)性多動脈炎；風濕性多肌痛；多發(fā)性肌炎；原發(fā)性膽汁性肝硬化；原發(fā)性硬化性膽管炎；進炎性病變；牛皮癬；銀屑病關節(jié)炎；壞疽性膿皮病；純紅細胞再生障礙；拉斯姆森腦炎；雷諾現(xiàn)象；復發(fā)性多軟骨炎；賴特爾氏綜合癥；下肢不寧綜合癥；腹膜后纖維化；類風濕關節(jié)炎；類風濕發(fā)熱；肉樣瘤??；精神分裂癥；施密特綜合癥；施尼茨勒綜合癥；鞏膜炎；硬皮??；干燥綜合癥；脊柱關節(jié)?。徽逞C合癥；斯提耳?。唤┤司C合癥；亞急性細菌性心內膜炎(SBE);蘇薩克綜合癥(Susac’ s syndrome);急性發(fā)熱性嗜中性皮膚病；西德哈姆舞蹈病；交感性眼炎；高安氏綜合癥；顳動脈炎；托洛薩-亨特綜合癥；橫貫性脊髓炎；潰瘍性結腸炎；未分化結締組織疾??；未分化脊柱關節(jié)病；血管炎；白癜風；韋格納肉芽腫??；威爾遜氏綜合癥和威斯科特-奧爾德里奇綜合癥。在本發(fā)明各方面的其他優(yōu)選實施方式中，皮膚疾病選自選自由下述疾病組成的組:痤瘡樣皮疹；自發(fā)性炎癥綜合癥；慢性起皰；粘膜疾??；皮膚附屬器疾?。黄は轮炯膊?；先天性異常；結締組織疾病(如真皮纖維和彈性組織異常)；真皮增長和皮下增長；皮炎(包括特應性皮炎、接觸性皮炎、濕疹、膿皰性皮炎和脂溢性皮炎)；色素沉著紊亂；藥疹；內分泌有關的皮膚疾病；嗜酸性粒細胞；表皮痣、贅生物、囊腫；紅斑；遺傳性皮膚病；感染相關的皮膚疾??；苔蘚皮疹；淋巴有關的皮膚疾?。缓谏丶毎牒唾樕?包括黑色素瘤)；單核細胞和巨噬細胞相關的皮膚疾??；粘蛋白增多癥(Mucinoses);神經皮膚；非感染性免疫缺陷相關的皮膚疾?。粻I養(yǎng)相關的皮膚疾?。磺鹫铟[屑性角化過度癥(包括掌跖角化病)；妊娠相關的皮膚疾??；瘙癢；銀屑??；反應性中性粒細胞；頑拗性掌跖皮疹；新陳代謝中錯誤導致的；物理因素(包括電離輻射誘導)導致的；蕁麻疹和血管性水腫；血管相關的皮膚疾病。在本發(fā)明各方面的其他優(yōu)選實施方式中，內分泌疾病選自由腎上腺紊亂；葡萄糖體內平衡失調；甲狀腺紊亂；鈣體內平衡失調和代謝性骨?。荒X垂體紊亂；和性激素紊亂組成的組。在本發(fā)明各方面的其他優(yōu)選實施方式中，眼疾病選自由下述疾病組成的組:H00-H06眼瞼、淚腺系統(tǒng)和眼眶疾?。籋10-H13結膜疾??；H15_H22鞏膜、角膜、虹膜和睫狀體疾??；H25-H28晶狀體疾??；H30-H36脈絡膜和視網(wǎng)膜疾病(包括H30脈絡膜視網(wǎng)膜炎癥、H31脈絡膜的其他疾病、H32分類在他處疾病中的脈絡膜視網(wǎng)膜紊亂、H33視網(wǎng)膜脫離和斷裂、H34視網(wǎng)膜血管閉塞、H35其他視網(wǎng)膜疾病，和H36分類在他處疾病中的視網(wǎng)膜疾病)；H40-H42青光眼；H43-H45玻璃體和眼球疾?。籋46_H48視神經和視覺通路疾?。籋49_H52眼球外肌、雙眼運動、調節(jié)和屈光疾?。籋53-H54.9視力障礙和失明；H55_H59眼和附器疾病。在本發(fā)明各方面的其他優(yōu)選實施方式中，神經疾病選自由下述疾病組成的組:辨重不能；獲得性癲癇性失語；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質營養(yǎng)不良；胼胝體發(fā)育不全；失認癥；艾卡迪綜合癥；亞歷山大病；異手綜合癥；感覺定側不能；阿爾珀斯疾病(Alpers^ disease);交替性偏癱；阿爾茨海默氏??；肌萎縮側索硬化癥(見運動神經元疾病);無腦畸形；安格曼綜合癥(Angelman syndrome);血管瘤；缺氧癥；失語癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿諾德-基亞里畸形；動靜脈畸形；共濟失調毛細血管擴張；注意缺陷多動障礙；聽覺處理障礙；植物神經功能紊亂；背疼痛；巴藤??；白塞氏??；貝爾麻痹；良性特發(fā)性眼瞼痙攣；良性顱內高壓；雙側額頂骨多小腦回；賓斯萬格氏??；眼瞼痙攣；布洛赫-蘇茲貝格綜合癥(Bloch-Sulzberger syndrome);臂叢神經損傷；腦膿腫；腦損害；腦損傷；腦腫瘤；布朗-賽爾卡綜合癥；卡納萬病??；腕管綜合癥；灼性神經痛；中樞性疼痛綜合癥；腦橋中央髓鞘溶解；中央核性肌?。活^部疾??；腦動脈瘤；腦動脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性麻痹；腦血管炎；頸椎椎管狹窄癥；腓骨肌萎縮癥；小腦扁桃體下疝畸形(Chiari malformation);舞蹈病；慢性疲勞綜合癥；慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病(CIDP);慢性疼痛；科-勒二氏綜合癥；昏迷；復雜區(qū)域疼痛綜合癥；嵌壓性神經??；先天性兩側面癱；皮質基底節(jié)變性；顱動脈炎；顱縫早閉；克羅伊茨費爾特-雅各布病；累積創(chuàng)傷失調；庫欣綜合癥；巨細胞包涵體病(CIBD);巨細胞病毒感染；丹迪-沃克綜合癥；道森疾?。坏履ξ靼＞C合癥(De Morsierj s syndrome);德熱里鈉-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumpke palsy);德熱里鈉-索塔斯?。凰邥r相延遲綜合癥；癡呆；皮肌炎；發(fā)育性運動障礙；糖尿病神經病變；彌漫性硬化癥；嬰兒嚴重肌陣攣性癲癇(Dravetsyndrome);家族性自主神經失調；計算障礙；書寫困難；誦讀困難；肌張力障礙；空蝶鞍綜合癥；腦炎；腦膨出；腦三叉神經血管瘤病；大便失禁；癲癇；新生兒臂叢神經損傷(Erb’ spalsy);紅斑性肢痛癥；特發(fā)性震顫；彌漫性體血管角質瘤；法爾綜合癥；昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性驚厥；費雪氏綜合癥；弗里德賴希氏共濟失調；纖維肌痛；高歇爾氏?。桓袼固芈暇C合癥；巨細胞動脈炎；巨細胞包涵體疾病；球形細胞腦白質營養(yǎng)不良；腦灰質異位癥；吉蘭-巴雷綜合癥；HTLV-1相關性脊髓病；哈勒沃登-施帕茨疾病；顱腦損傷；頭痛；半面痙攣；遺傳性痙攣性截癱；雷弗素姆氏病；耳帶狀皰疹；帶狀皰疹；平山郁夫綜合癥(Hirayama syndrome);前腦無裂畸形；亨廷頓氏??；積水性無腦；腦積水；皮質醇增多癥；缺氧；免疫介導性腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調癥；嬰幼兒植烷酸貯積疾??；嬰幼兒雷夫敘姆??；嬰兒痙攣癥；炎癥性肌??；顱內囊腫；顱內壓增高；伯特綜合癥(Joubertsyndrome);卡拉克綜合癥(Karak syndrome);卡恩斯-塞爾綜合癥；肯尼迪?。唤鹚共剂旨{綜合癥；克利佩爾-費爾綜 合癥；克拉伯疾病；庫格爾貝格-韋蘭德疾??；苦魯??；拉福拉疾病；蘭伯特-伊頓肌無力綜合癥；獲得性癲癇失語(Landau-Kleffner syndrome);延髓外側綜合癥(瓦倫貝格綜合癥)；無學習能力；利氏病(Leigh’ s disease);肌陣攣性起立不能小發(fā)作(Lennox-Gastaut syndrome);萊施-奈恩綜合癥；腦白質營養(yǎng)不良；路易體癡呆；平腦癥；閉鎖綜合癥；盧伽雷氏病(見運動神經元疾病)；腰椎間盤疾病；腰椎管狹窄癥；萊姆病-神經系統(tǒng)后遺癥；馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)(脊髓小腦性共濟失調3型)；巨腦；視物顯大癥；巨腦畸形；梅-羅綜合癥狀(Melkersson-Rosenthalsyndrome);美尼爾氏病(Menieres disease);腦膜炎；門克斯??；異染性腦白質病變；小頭畸形；視物顯小癥；偏頭痛；米勒費雪綜合癥；小中風(短暫性腦缺血發(fā)作)；線粒體肌??；默比厄斯氏綜合癥；單肢性肌萎縮(Monomelic amyotrophy);運動神經元疾??；運動技能障礙；煙霧?。火ざ嗵遣?；多發(fā)性腦梗死性癡呆；多灶性運動神經?。欢喟l(fā)性硬化癥；多系統(tǒng)萎縮癥；肌營養(yǎng)不良癥；肌痛性腦脊髓炎；重癥肌無力；髓鞘破壞彌漫性硬化癥(Myelinoclastic diffuse sclerosis);嬰兒肌陣攣性腦??；肌陣攣；肌??；肌管性肌??；先天性肌強直癥；發(fā)作性睡病；神經纖維瘤?。簧窠涀铚盒跃C合癥；艾滋病的神經系統(tǒng)表現(xiàn)；狼瘡性神經系統(tǒng)后遺癥；神經性肌強直；神經元蠟樣脂褐質沉積癥；神經元遷移障礙；尼曼-皮克??；非24小時睡眠-覺醒綜合癥；非語言學習障礙；奧沙利文-麥克勞德綜合癥(O’ Sullivan-McLeod syndrome);枕神經痛；隱性脊柱神經管閉合不全序列癥；大田原綜合癥(Ohtahara syndrome);橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼陣攣肌陣攣綜合癥；視神經炎；直立位性低血壓；過度使用綜合癥；持續(xù)后像(Palinopsia);感覺異常；帕金森氏?。幌忍煨约娭辈?；腫瘤伴隨綜合癥；陣發(fā)性發(fā)作；帕-羅二氏綜合癥；佩利措伊斯-梅茨巴赫病病；周期性癱瘓；周圍神經病變；持續(xù)性生長狀態(tài)；廣泛性發(fā)育障礙；光噴嚏反射；植烷酸貯積?。黄た耸喜?；神經挾捏；垂體腫瘤；PMG ;脊髓灰質炎；多小腦回(Polymicrogyria);多發(fā)性肌炎；腦穿通畸形；脊髓灰質炎后綜合癥；皰疫后神經痛(PHN);感染后腦脊髓炎；體位性低血壓；普拉德-威利綜合癥；原發(fā)性側索硬化癥；朊病毒疾??；進行性半面萎縮；進行性多灶性腦白質?。贿M行性核上性麻痹；進行性核上性麻痹；狂犬??；拉姆齊-亨特綜合癥(I型和II型)；拉斯姆森腦炎(Rasmussen’ sencephalitis);反射神經血管營養(yǎng)不良；雷夫敘姆??；重復運動失調；重復性壓力損傷；下肢不寧綜合癥；逆轉錄酶病毒相關的脊髓??；瑞特氏綜合癥(Rett syndrome);雷氏綜合癥；節(jié)律性運動障礙；羅姆伯格氏綜合癥；圣維圖斯舞蹈病(Saint Vitus dance) ；GM2神經節(jié)苷脂忙積癥變異型0(SandhofT disease);精神分裂癥；彌漫性軸周性腦炎；腦裂畸形；感覺統(tǒng)合失調；視隔發(fā)育不良；嬰兒搖晃綜合癥；帶狀皰疹；夏伊-德雷格綜合癥(Shy-Drager syndrome);干燥綜合癥；睡眠呼吸暫停；昏睡??；飽食(Snatiation);索托斯綜合癥(Sotos syndrome);痙攣狀態(tài)；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓腫瘤；脊髓性肌萎縮；脊髓小腦性共濟失調；斯蒂爾-理查德森-歐斯祖斯基綜合癥(Steele-Richardson-Olszewskisyndrome);僵人綜合癥；中風；斯-韋綜合癥；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動脈硬化性腦??；淺鐵質沉著癥；西德哈姆舞蹈??；暈厥；聯(lián)覺；脊髓空洞癥；跗管綜合癥；遲發(fā)性運動障礙；骶管囊腫(Tarlov cyst);泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease);顳動脈炎；破傷風；脊髓栓系綜合癥；肌強直性白內障；胸廓出口綜合癥；三叉神經痛；托德癱瘓；拉塔綜合癥；中毒性腦??；短暫性腦缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦??；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經痛；熱帶痙攣性癱瘓；錐蟲病；結節(jié)性腦硬化；希林二氏?。煌魉箍颇X脊髓炎(Viliuisk Encephalomyelitis);瓦倫伯格氏綜合癥；韋德尼希-霍夫曼?。豁f斯特綜合癥；頸椎(Whiplash);威廉斯綜合癥；威爾遜氏癥和腦肝腎綜合癥。在本發(fā)明各方面的其他優(yōu)選實施方式中，心血管疾病選自由動脈瘤；心絞痛；動脈粥樣硬化；腦血管意外(中風)；腦血管疾??；充血性心力衰竭；冠心??；心肌梗死(心臟病發(fā)作)以及周圍血管疾病組成的組。另一方面，本發(fā)明提供一種使用根據(jù)本發(fā)明的血樣分析方法診斷受試者疾病的方法。因此，在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的分析血樣的所述方法是診斷受試者疾病方法的一部分，并且其中，所述無核血細胞提取的核酸片段中所述疾病標記物的存在表明所述受試者患有所述疾病。另一方面，本發(fā)明提供一種用于確定受試者疾病治療的療效的方法，該方法包括下述步驟:使用根據(jù)本發(fā)明的分析血樣的方法在第一時間點分析受試者血樣中疾病標記物的存在，由此以提供所述受試者中所述疾病標記物的含量的第一值；使用根據(jù)本發(fā)明的分析血樣的方法在早于或晚于，優(yōu)選晚于所述第一時間點的第二時間點分析所述受試者血樣中疾病標記物的存在，由此以提供所述受試者中所述疾病標記物的含量的第二值，其中，所述受試者已經在所述第一時間點和所述第二時間點之間接受過疾病治療；以及比較所述第一值和所述第二值以確定所述受試者的所述疾病治療的療效。本領域技術人員將理解，所述第一時間點之前的治療和隨后在稍后的第二時間點的測量(在所述時間點之間沒有進行任何疾病治療)包括在本發(fā)明的用于確定疾病治療的療效的各方面中。另一方面，本發(fā)明提供一種用于確定疾病階段的方法。為了確定疾病階段，將通過本發(fā)明方法確定的疾病標記物的值與疾病階段關聯(lián)起來是有利的。疾病標記物的單個測量然后可與一個或多個參考值比較以得到疾病階段的指示。另一方面，本發(fā)明提供一種用于確定受試者的疾病階段的方法，該方法包括下述步驟:使用根據(jù)本發(fā)明的分析受試者血樣中疾病標記物的存在的方法分析血樣中疾病標記物的存在，由此以提供所述受試者中所述疾病標記物的含量的測試值；提供所述疾病標記物的含量的參考值，其中，所述參考值與疾病的特定階段相關；以及比較所述測試值和所述參考值以確定所述受試者的疾病階段。又一方面，本發(fā)明提供一種適于實施如本文上述的本發(fā)明方法的部件(part)的試劑盒，包括包裝材料的所述試劑盒包括下述至少之一:用于盛放從血樣中分離的無核血細胞，優(yōu)選凝血細胞的容器；用于從所述無核血細胞中提取核酸的試劑；用于由提取自所述無核血細胞的所述核酸選擇性擴增如本文上述的疾病特異標記物的試劑，例如通過反轉錄酶聚合酶鏈反應擴增，所述疾病特異標記物例如為受試者的有核細胞的基因中的疾病特異突變，或來自所述受試者有核細胞的核酸的疾病特異表達譜；以及用于實施如本文上述本發(fā)明方法的印刷操作指南或電子操作指南，所述試劑盒還包括:所述疾病標記物的參考標準，其中，所述參考標準表明所述無核血細胞提取核酸片段中所述疾病標記物的存在或不存在。
在根據(jù)本發(fā)明試劑盒的優(yōu)選實施方式中，所述參考標準是健康的對照受試者或患有疾病的對照受試者的無核血細胞中包括所述疾病特異突變的核酸的含量的參考值，或其中所述參考標準是參考表達譜，例如來自健康的對照受試者或患有疾病的對照受試者的無核血細胞中的多個mRNA。在根據(jù)本發(fā)明試劑盒的另一優(yōu)選實施方式中，所述試劑或操作指南選自粒子(particle)或突光標記物標記的抗無核血細胞抗體(優(yōu)選突光標記物標記的抗凝血細胞抗體)、用于基于微珠(bead-based)的無核血細胞分離(優(yōu)選凝血細胞分離)的操作指南、用于無核血細胞(優(yōu)選凝血細胞的)FACS分選的操作指南、用于通過離心回收無核血細胞(優(yōu)選凝血細胞)的操作指南，或用于非無核血細胞成分(優(yōu)選非凝血細胞成分)的負選擇的操作指南。在又一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷疾病的器件，所述器件包括支撐體和用于具體確定受試者無核血細胞樣品中至少一種核酸突變體的含量和/或活性的至少一種試齊U，以及具有用于實施如上文所述本發(fā)明方法的計算機可執(zhí)行指令的計算機可讀介質。所述試劑附著于所述支撐體。在根據(jù)本發(fā)明器件的優(yōu)選實施方式中，所述至少一種試劑是寡核苷酸探針或測序引物。在根據(jù)本發(fā)明器件的優(yōu)選實施方式中，所述器件包括用于進行無核血細胞提取的核酸和至少一種核酸突變特異擴增引物或寡核苷酸探針之間，或無核血細胞提取的核酸和多個基因特異擴增引物或寡核苷酸探針之間的核酸雜交反應的橫向流動設備(lateralflow device)、浸量尺或套筒，用于提供疾病特異基因表達譜。


圖1示出使用安捷倫生物分析儀皮可芯片(Agilent Bioanalyzer Picochip)(安捷倫科技公司)分析的RNA譜，X-軸為RNA的長度(以核苷酸數(shù)目的形式)，以及Y-軸為RNA的量(以熒光單位的形式)。這里描述，源自血清部分中的微泡的RNA(左)，源自血漿部分中的微泡的RNA(中)或源自凝血細胞的RNA(右)。結果表明，I)在血清和血漿的微泡中以及在凝血細胞中存在RNA，2)從血漿樣品中分離的微泡比從血清樣品中分離的微泡包含較少的RNA，以及3)從血漿樣品中分離的凝血細胞包含多種尺寸的RNA，包括相對長的RNA鏈(> 200個核苷酸(nt)，并且甚至> 1000個核苷酸)的重要片段。圖2示出從腦腫瘤患者的凝血細胞中發(fā)現(xiàn)的源于腫瘤的遺傳物質的結果。從患者(P1-14)中取血樣(全血管(血清(S))和抗凝血劑-EDTA血液(血漿(P))。從血漿管中通過離心實驗規(guī)程收集凝血細胞(T)。作為對照，從健康個體(C1-6)中收集凝血細胞。一些患者缺乏血清樣品，在圖2中用X表示，以及一些患者有混合的血清(pooled serum)和血漿樣品，在圖2中用SP表示。使用用于RNA檢測的巢式PCR，15個患者中的4個膠質母細胞瘤患者(27% ) (P4、P5、P9、P10)的凝血細胞中能檢測出突變體EGFRvIII (V3)。這符合發(fā)表的文獻，在20%的高等級神經膠質瘤中發(fā)現(xiàn)突變體EGFRvIII (Liu等，2005年)。這些實驗確實提供了通過識別源于腫瘤的核酸，凝血細胞能用作診斷癌癥的生物標記物源的原理的證據(jù)。圖3:(A)用PKH67綠色熒光染料標記并且用分離的血小板培養(yǎng)U87源于神經膠質瘤的微泡。在存在和不存在微泡下培養(yǎng)15分鐘和60分鐘后，洗滌血小板，并進行PKH67熒光的FACS分析。此外，將血小板染色，并通過共聚焦顯微鏡分析以確定微泡吸收。從在不同條件下用微泡培養(yǎng)后的RNA酶處理過的血小板中分離RNA。進行RT-PCR以檢測EGFRvIIIRNA。MV/MVEGFRvII1:從U87/U87_EGFRvIII細胞中分離的微泡。(B)從健康的對照受試者或神經膠質瘤患者的血小板中分離RNA并且進行RT-PCR分析。相應的神經膠質瘤組織的活組織檢查作為對照。PC = U87-EGFRvIII RNA ；NC = H20 ；nd =沒有確定；*表示正信號。(C)對(B)中的RNA進行基因表達陣列。前30個神經膠質瘤的生物標記物的熱圖(heatmap)示于左側。前10個RNA各自的表達水平描述在右側。虛線=BG (背景)。圖4:從健康的對照受試者(n = 8)和前列腺癌癥患者(n = 12)的血小板中分離RNA并且進行PCA3、PSA和GAPDH RT-PCR分析。*表示弱正信號。圖5示出用于檢測圖3C中顯示的基因的探針序列。
具體實施例方式如本文使用的術語“癌癥”指由瘤原性轉化細胞的增殖導致的疾病或病癥。采用“癌癥”以包括廣泛的良性腫瘤或惡性腫瘤中的任何一種或多種，包括能夠經過人體或動物體或他們的一部分(例如:通過淋巴系統(tǒng)和/或血液)蔓延性生長和轉移的那些。盡管本發(fā)明特別針對惡性腫瘤和實體癌癥的診斷或檢測，如本文使用，術語“腫瘤”包括良性腫瘤和惡性腫瘤或實體生長物。癌癥還包括但不限于癌(carcinomas)、淋巴瘤，或肉瘤，例如卵巢癌、結腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宮癌、急性淋巴性白血病、霍奇金病、肺的小細胞癌、黑色素瘤、成神經細胞瘤、神經膠質瘤(例如成膠質細胞瘤)、軟組織肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌。在本發(fā)明各方面的優(yōu)選實施方式中，不要求凝血細胞癌癥。如本文使用的術語“源于癌癥的”指始發(fā)于癌癥或癌癥細胞。采用術語“源于癌癥的核酸”以表示具體表明受試者癌癥的任何核酸，并且在最優(yōu)選的實施方式中，表示突變體DNA或RNA，表明癌癥中突變體基因存在的突變體DNA或RNA由受試者的癌癥細胞表達或存在于受試者的癌癥細胞中，相對于健康的對照受試者的正?；?，該突變體基因的核酸序列改變。還采用術語“源于癌癥的核酸”以包括(i)由癌癥細胞而不是正常的健康(非癌性)細胞產生的或表達的核酸，或在癌癥細胞而不是在正常的健康(非癌性)細胞中存在的核酸，或相較于正常細胞，由癌癥細胞或在癌癥細胞中改變(提高或降低)其產生或表達的核酸；或(ii)由正常細胞而不是癌癥細胞產生的或表達的核酸，或在正常細胞中而不是在癌癥細胞中存在的核酸。因此，該核酸不必須是具有變異序列的突變體核酸而可能是具有野生型(非癌癥)序列的正常核酸，但相對于正常的細胞其譜和表達水平在癌癥細胞中改變。在一個優(yōu)選實施方式中，源于癌癥的核酸是對癌癥特異的突變體核酸(DNA、cDNA或RNA)，優(yōu)選RNA轉錄物。如本文中詳細說明，在另一非常優(yōu)選的實施方式中，源于癌癥的核酸是表明源于癌癥的或癌癥特異的核酸表達譜。本文使用的術語“癌癥標記物”具體指癌癥標記物基因或癌癥標記物基因表達譜。本文使用的術語“癌癥標記物基因”指其單獨或與其他基因組合的序列或表達水平與癌癥或癌癥的預后相關的基因。該相關性可涉及由從凝血細胞中得到的核酸片段中的所述基因的RNA表達產物存在的增加或降低反映的基因表達的增加或降低。例如，基因的表達可表明癌癥，或缺乏基因的表達可與癌癥患者的不良預后相關。在前列腺癌癥AMACR的情況下，PCA3和PSA是合適的癌癥標記物。在結直腸癌癥的情況下，KRAS突變是合適的癌癥標記物。在肺癌的情況下，EGFR突變是合適的癌癥標記物。在黑色素瘤的情況下，BRAF突變是合適的癌癥標記物。在神經膠質瘤的情況下，EGFRvIII突變是合適的癌癥標記物。其它合適的癌癥標記物可來自本文提供的表I和表2，或來自實施例或附圖。本領域技術人員將明白許多其他癌癥標記物可應用于本發(fā)明的方面和實施例中。如本文使用，術語“癌癥階段”指癌癥發(fā)展程度的定性或定量評估。采用的確定癌癥階段的標準包括但不限于腫瘤的大小，腫瘤是否已擴散到身體的其他部分以及癌癥已經擴散到何處(例如，在身體的相同的器官或區(qū)域內或擴散到其他器官)。在術語“源于癌癥的”、“癌癥標記物”、“癌癥標記物基因”和/或“癌癥階段”中的術語“癌癥”可以概括為術語“疾病”，因為癌癥的定義通常適用于本文指出的所有疾病。如本文使用的術語“源于疾病的”指始發(fā)于疾病或患病的細胞。采用術語“源于疾病的核酸”以表示具體表明受試者疾病的任何核酸，并且在最優(yōu)選的實施方式中，表示表明突變體基因疾病的存在的突變體DNA或RNA，該突變體基因由受試者的患病細胞表達或在受試者的患病細胞中存在，其中相對于健康的對照受試者的正?；颍蛔凅w基因的核酸序列改變。還采用術語“源于疾病的核酸”以包括(i)由患病細胞而不是正常的健康(非癌性)細胞產生的或表達的的核酸，或在患病細胞而不是在正常的健康(非疾病)細胞中存在的核酸，或相較于正常細胞，由患病細胞或在患病細胞中改變(提高或降低)其產生或表達的核酸；或(ii)由正常細胞而不是患病細胞產生的或表達的核酸，或在正常細胞中而不是在患病細胞中存在的核酸。因此，該核酸不必須是具有變異序列的突變體核酸而可能是具有野生型(非癌癥)序列的正常核酸，但相對于正常的細胞其譜和表達水平在患病細胞中改變。在一個優(yōu)選實施方式中，源于疾病的核酸是對該疾病特異的突變體核酸(DNA、cDNA或RNA)，優(yōu)選RNA轉錄物。如本文中詳細說明，在另一非常優(yōu)選實施方式中，源于疾病的核酸是表明源于疾病的或疾病特異的核酸表達譜。本文使用的術語“疾病標記物”具體指疾病標記物基因或疾病標記物基因表達譜。本文使用的術語“疾病標記物基因”指其單獨或與其他基因組合的序列或表達水平與疾病或該疾病的預后相關的基因。該相關性可涉及由從凝血細胞中得到的核酸片段中的所述基因的RNA表達產物存在的增加或降低反映的基因表達的增加或降低。例如，基因的表達可表明疾病，或缺乏基因的表達可與患者的不良預后相關。如本文使用，術語“疾病階段”指疾病發(fā)展程度的定性或定量評估。采用的確定疾病階段的標準包括但不限于疾病是否已擴散到身體的其他部分以及疾病已經擴散到何處(例如，在身體的相同的器官或區(qū)域內或擴散到其他器官)。本文使用的術語疾病指癌癥、自身免疫性疾病、皮膚疾病、眼疾病、內分泌疾病、神經紊亂以及心血管疾病。因此，除癌癥外能使用本發(fā)明的手段和方法檢測的疾病包括例如下列自身免疫性疾病:胃酸缺乏自身免疫性主動慢性肝炎；急性播散性腦脊髓炎；急性出血性腦白質炎；阿狄森氏??；無丙種球蛋白血癥；斑禿；肌萎縮側索硬化癥；強直性脊柱炎；反GBM/TBM腎炎；抗磷脂綜合癥；抗合成酶綜合癥；多發(fā)性關節(jié)炎；特應性變態(tài)反應；特應性皮炎；自身免疫性再生障礙性貧血；自身免疫性心肌??；自身免疫性腸病；自身免疫性溶血性貧血；自身免疫性肝炎；自身免疫性內耳??；自身免疫性淋巴細胞增生性綜合癥；自身免疫性周圍神經病變；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性多內分泌腺綜合癥；自身免疫性黃體酮皮炎；自身免疫性血小板減少性紫癜；自身免疫性葡萄膜炎；巴洛疾病/巴洛同心硬化癥；白塞氏綜合癥；貝格爾氏疾??；比克斯塔夫腦炎；布勞綜合癥(Blau syndrome);大皰性類天皰瘡；卡斯爾曼疾病(Castleman’ s disease);脂灣病；美洲錐蟲??；慢性疲勞免疫功能障礙綜合癥；慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病；慢性復發(fā)性多灶性骨髓炎；慢性萊姆疾?。宦宰枞苑渭膊。蛔儜匀庋磕[性血管炎(Churg-Strauss syndrome);瘢痕性類天皰瘡；乳糜瀉；耳蝸前庭綜合癥；冷凝集素疾?。谎a體成分2不足；顱動脈炎；CREST綜合癥；克羅恩氏疾??；庫欣氏綜合癥；皮膚白細胞破碎性血管炎；惡性萎縮性丘疹病(Dego’s disease) ’德爾肯氏疾??；皰疹樣皮炎；皮肌炎；1型糖尿??；彌漫性皮膚全身性硬化癥；德雷斯勒綜合癥；盤狀紅斑狼瘡；濕疹；子宮內膜異位癥；起止點炎相關的關節(jié)炎；嗜酸性筋膜炎；嗜酸細胞性胃腸炎；獲得性大皰性表皮松解癥；結節(jié)性紅斑；特發(fā)性混合性冷球蛋白血癥；伊文氏綜合癥；進行性骨化性纖維增殖不良癥；纖維肌痛/纖維肌炎；纖維性肺泡炎(Fibrosingaveolitis);胃炎；胃腸道類天皰瘡；巨細胞動脈炎；腎小球腎炎；肺出血腎炎綜合癥；格雷夫斯氏疾?。患m-巴雷綜合癥；橋本氏腦炎；橋本氏甲狀腺炎；溶血性貧血；過敏性紫癜；妊娠皰疹；化膿性汗腺炎；休斯綜合癥；低丙球蛋白血癥；特發(fā)性炎癥性脫髓鞘性疾病；特發(fā)性肺纖維化；特發(fā)性血小板減少性紫癜；IgA腎?。话w肌炎；炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病變；間質性膀胱炎；腸易激綜合癥(IBS);幼年特發(fā)性關節(jié)炎；幼年類風濕關節(jié)炎；川崎??；蘭伯特-伊頓肌無力綜合癥；白細胞破碎性血管炎；扁平苔蘚；硬化性苔蘚；線性IgA疾?。槐R伽雷 氏??；狼瘡樣肝炎；紅斑狼瘡；馬吉德綜合癥；梅尼埃疾病；顯微鏡下多血管炎；米勒-費雪綜合癥；混合性結締組織疾病；硬斑疾??；木柵-赫伯曼疾病；穆-韋二氏綜合癥；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性硬化癥；重癥肌無力；肌炎；發(fā)作性睡病；視神經脊髓炎；神經性肌強直；眼瘢痕性類天皰瘡；視性眼陣攣肌陣攣綜合癥；奧德甲狀腺炎；復發(fā)性風濕病；伴鏈球菌感染性小兒自身免疫性神經精神?。桓蹦[瘤性小腦變性；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥；帕-羅二氏綜合癥；帕森-特納綜合癥(Parsonnage-Turner syndrome);睫狀體平坦部炎；天皰瘡；尋常型天皰瘡；惡性貧血；靜脈周圍性腦脊髓炎；P0EMS綜合癥；結節(jié)性多動脈炎；風濕性多肌痛；多發(fā)性肌炎；原發(fā)性膽汁性肝硬化；原發(fā)性硬化性膽管炎；進炎性病變；牛皮癬；銀屑病關節(jié)炎；壞疽性膿皮??；純紅細胞再生障礙；拉斯姆森腦炎；雷諾現(xiàn)象；復發(fā)性多軟骨炎；賴特爾氏綜合癥；下肢不寧綜合癥；腹膜后纖維化；類風濕關節(jié)炎；類風濕發(fā)熱；肉樣瘤??；精神分裂癥；施密特綜合癥；施尼茨勒綜合癥；鞏膜炎；硬皮?。桓稍锞C合癥；脊柱關節(jié)?。徽逞C合癥；斯提耳??；僵人綜合癥；亞急性細菌性心內膜炎(SBE);蘇薩克綜合癥(Susac’ s syndrome);急性發(fā)熱性嗜中性皮膚??；西德哈姆舞蹈?。唤桓行匝垩?；高安氏綜合癥；顳動脈炎；托洛薩-亨特綜合癥；橫貫性脊髓炎；潰瘍性結腸炎；未分化結締組織疾?。晃捶只怪P節(jié)?。谎苎?；白癜風；韋格納肉芽腫病；威爾遜氏綜合癥和威斯科特-奧爾德里奇綜合癥。除上述疾病外，本發(fā)明的方面還適用于下列皮膚疾病的預后和診斷:痤瘡樣皮疹；自發(fā)性炎癥綜合癥；慢性起皰；粘膜疾病；皮膚附屬器疾病；皮下脂肪疾??；先天性異常；結締組織疾病(如真皮纖維和彈性組織異常)；真皮增長和皮下增長；皮炎(包括特應性皮炎、接觸性皮炎、濕疹、膿皰性皮炎和脂溢性皮炎)；色素沉著紊亂；藥疹；內分泌有關的皮膚疾病；嗜酸性粒細胞；表皮痣、贅生物、囊腫；紅斑；遺傳性皮膚病；感染相關的皮膚疾?。惶μ\皮疹；淋巴有關的皮膚疾??；黑色素細胞痣和贅生物(包括黑色素瘤)；單核細胞和巨噬細胞相關的皮膚疾?。徽车鞍自龆喟Y(Mucinoses);神經皮膚；非感染性免疫缺陷相關的皮膚疾病；營養(yǎng)相關的皮膚疾??；丘疹鱗屑性角化過度癥(包括掌跖角化病)；妊娠相關的皮膚疾病；瘙癢；銀屑??；反應性中性粒細胞；頑拗性掌跖皮疹；新陳代謝中錯誤導致的；物理因素(包括電離輻射誘導)導致的；蕁麻疹和血管性水腫；血管相關的皮膚疾病。除上述疾病外，本發(fā)明的方面還適用于下列內分泌疾病的預后和診斷:腎上腺紊亂；葡萄糖體內平衡失調；甲狀腺紊亂；鈣體內平衡失調和代謝性骨??；腦垂體紊亂；和性激素紊亂。除上述疾病外，本發(fā)明的方面還適用于下列眼疾病的預后和診斷:H00-H06眼瞼、淚腺系統(tǒng)和眼眶疾??；H10-H13結膜疾病；H15-H22鞏膜、角膜、虹膜和睫狀體疾?。籋25_H28晶狀體疾??；H30-H36脈絡膜和視網(wǎng)膜疾病(包括H30脈絡膜視網(wǎng)膜炎癥、H31脈絡膜的其他疾病、H32分類在他處疾病中的脈絡膜視網(wǎng)膜紊亂、H33視網(wǎng)膜脫離和斷裂、H34視網(wǎng)膜血管閉塞、H35其他視網(wǎng)膜疾病，和H36分類在他處疾病中的視網(wǎng)膜疾病);H40-H42青光眼；H43-H45玻璃體和眼球疾??；H46-H48視神經和視覺通路疾病；H49_H52眼球外肌、雙眼運動、調節(jié)和屈光疾??； H53-H54.9視力障礙和失明；H55_H59眼和附器疾病。除上述疾病外，本發(fā)明的方面還適用于下列神經紊亂的預后和診斷:辨重不能；獲得性癲癇性失語；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質營養(yǎng)不良；胼胝體發(fā)育不全；失認癥；艾卡迪綜合癥；亞歷山大?。划愂志C合癥；感覺定側不能；阿爾珀斯疾病(Alpers^ disease);交替性偏癱；阿爾茨海默氏病；肌萎縮側索硬化癥(見運動神經元疾病);無腦畸形；安格曼綜合癥(Angelman syndrome);血管瘤；缺氧癥；失語癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿諾德-基亞里畸形；動靜脈畸形；共濟失調毛細血管擴張；注意缺陷多動障礙；聽覺處理障礙；植物神經功能紊亂；背疼痛；巴藤??；白塞氏病；貝爾麻痹；良性特發(fā)性眼瞼痙攣；良性顱內高壓；雙側額頂骨多小腦回；賓斯萬格氏??；眼瞼痙攣；布洛赫-蘇茲貝格綜合癥(Bloch-Sulzberger syndrome);臂叢神經損傷；腦膿腫；腦損害；腦損傷；腦腫瘤；布朗-賽爾卡綜合癥；卡納萬病病；腕管綜合癥；灼性神經痛；中樞性疼痛綜合癥；腦橋中央髓鞘溶解；中央核性肌病；頭部疾??；腦動脈瘤；腦動脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性麻痹；腦血管炎；頸椎椎管狹窄癥；腓骨肌萎縮癥；小腦扁桃體下疝畸形(Chiari malformation);舞蹈?。宦云诰C合癥；慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病(CIDP);慢性疼痛；科-勒二氏綜合癥；昏迷；復雜區(qū)域疼痛綜合癥；嵌壓性神經?。幌忍煨詢蓚让姘c；皮質基底節(jié)變性；顱動脈炎；顱縫早閉；克羅伊茨費爾特-雅各布?。焕鄯e創(chuàng)傷失調；庫欣綜合癥；巨細胞包涵體病(CIBD);巨細胞病毒感染；丹迪-沃克綜合癥；道森疾??；德摩西埃綜合癥(De Morsierj s syndrome);德熱里鈉-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumpke palsy);德熱里鈉-索塔斯病；睡眠時相延遲綜合癥；癡呆；皮肌炎；發(fā)育性運動障礙；糖尿病神經病變；彌漫性硬化癥；嬰兒嚴重肌陣攣性癲癇(Dravetsyndrome);家族性自主神經失調；計算障礙；書寫困難；誦讀困難；肌張力障礙；空蝶鞍綜合癥；腦炎；腦膨出；腦三叉神經血管瘤??；大便失禁；癲癇；新生兒臂叢神經損傷(Erb’ spalsy);紅斑性肢痛癥；特發(fā)性震顫；彌漫性體血管角質瘤；法爾綜合癥；昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性驚厥；費雪氏綜合癥；弗里德賴希氏共濟失調；纖維肌痛；高歇爾氏??；格斯特曼氏綜合癥；巨細胞動脈炎；巨細胞包涵體疾病；球形細胞腦白質營養(yǎng)不良；腦灰質異位癥；吉蘭-巴雷綜合癥；HTLV-1相關性脊髓??；哈勒沃登-施帕茨疾?。伙B腦損傷；頭痛；半面痙攣；遺傳性痙攣性截癱；雷弗素姆氏病；耳帶狀皰疹；帶狀皰疹；平山郁夫綜合癥(Hirayama syndrome);前腦無裂畸形；亨廷頓氏?。环e水性無腦；腦積水；皮質醇增多癥；缺氧；免疫介導性腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調癥；嬰幼兒植烷酸貯積疾病；嬰幼兒雷夫敘姆??；嬰兒痙攣癥；炎癥性肌??；顱內囊腫；顱內壓增高；伯特綜合癥(Joubertsyndrome);卡拉克綜合癥(Karak syndrome);卡恩斯-塞爾綜合癥；肯尼迪?。唤鹚共剂旨{綜合癥；克利佩爾-費爾綜合癥；克拉伯疾?。粠旄駹栘惛?韋蘭德疾??；苦魯?。焕＠膊。惶m伯特-伊頓肌無力綜合癥；獲得性癲癇失語(Landau-Kleffner syndrome);延髓外側綜合癥(瓦倫貝格綜合癥)；無學習能力；利氏病(Leigh’ s disease);肌陣攣性起立不能小發(fā)作(Lennox-Gastaut syndrome);萊施-奈恩綜合癥；腦白質營養(yǎng)不良；路易體癡呆；平腦癥；閉鎖綜合癥；盧伽雷氏病(見運動神經元疾病)；腰椎間盤疾??；腰椎管狹窄癥；萊姆病-神經系統(tǒng)后遺癥；馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)(脊髓小腦性共濟失調3型)；巨腦；視物顯大癥；巨腦畸形；梅-羅綜合癥狀(Melkersson-Rosenthalsyndrome);美尼爾氏病(Menieres disease);腦膜炎；門克斯??；異染性腦白質病變；小頭畸形；視物顯小癥；偏頭痛；米勒費雪綜合癥；小中風(短暫性腦缺血發(fā)作)；線粒體肌?。荒榷蛩故暇C合癥；單肢性肌萎縮(Monomelic amyotrophy);運動神經元疾病；運動技能障礙；煙霧?。火ざ嗵遣。欢喟l(fā)性腦梗死性癡呆；多灶性運動神經??；多發(fā)性硬化癥；多系統(tǒng)萎縮癥；肌營養(yǎng)不良癥；肌痛性腦脊髓炎；重癥肌無力；髓鞘破壞彌漫性硬化癥(Myelinoclastic diffuse sclerosis);嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣攣；肌??；肌管性肌??；先天性肌強直癥；發(fā)作性睡?。簧窠浝w維瘤?。簧窠涀铚盒跃C合癥；艾滋病的神經系統(tǒng)表現(xiàn)；狼瘡性神經系統(tǒng)后遺癥；神經性肌強直；神經元蠟樣脂褐質沉積癥；神經元遷移障礙；尼曼-皮克病；非24小時睡眠-覺醒綜合癥；非語言學習障礙；奧沙利文-麥克勞德綜合癥(O’ Sullivan-McLeod syndrome);枕神經痛；隱性脊柱神經管閉合不全序列癥；大田原綜合癥(Ohtahara syndrome);橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼陣攣肌陣攣綜合癥；視神經炎；直立位性低血壓；過度使用綜合癥；持續(xù)后像(Palinopsia);感覺異常；帕金森氏病；先天性肌強直??；腫瘤伴隨綜合癥；陣發(fā)性發(fā)作；帕-羅二氏綜合癥；佩利措伊斯-梅茨巴赫病?。恢芷谛园c瘓；周圍神經病變；持續(xù)性生長狀態(tài)；廣泛性發(fā)育障礙；光噴嚏反射；植烷酸貯積?。黄た耸喜?；神經挾捏；垂體腫瘤；PMG ;脊髓灰質炎；多小腦回(Polymicrogyria);多發(fā)性肌炎；腦穿通畸形；脊髓灰質炎后綜合癥；皰疫后神經痛(PHN);感染后腦脊髓炎；體位性低血壓；普拉德-威利綜合癥；原發(fā)性側索硬化癥；朊病毒疾?。贿M行性半面萎縮；進行性多灶性腦白質?。贿M行性核上性麻痹；真腦瘤；狂犬??；拉姆齊-亨特綜合癥(I型和II型)；拉斯姆森腦炎(Rasmussen’ s encephalitis);反射神經血管營養(yǎng)不良；雷夫敘姆??；重復運動失調；重復性壓力損傷；下肢不寧綜合癥；逆轉錄酶病毒相關的脊髓病；瑞特氏綜合癥(Rett syndrome);雷氏綜合癥；節(jié)律性運動障礙；羅姆伯格氏綜合癥；圣維圖斯舞蹈病(Saint Vitus dance) ;GM2神經節(jié)苷脂忙積癥變異型0(Sandhoff disease);精神分裂癥；彌漫性軸周性腦炎；腦裂畸形；感覺統(tǒng)合失調；視隔發(fā)育不良；嬰兒搖晃綜合癥；帶狀皰疫；夏伊-德雷格綜合癥(Shy-Drager syndrome);干燥綜合癥；睡眠呼吸暫停；昏睡病；飽食(Snatiation);索托斯綜合癥(Sotos syndrome)；痙攣狀態(tài)；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓腫瘤；脊髓性肌萎縮；脊髓小腦性共濟失調；斯蒂爾-理查德森-歐斯祖斯基綜合癥(Steele-Richardson-Olszewski syndrome);僵人綜合癥；中風；斯-韋綜合癥；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動脈硬化性腦?。粶\鐵質沉著癥；西德哈姆舞蹈?。粫炟?；聯(lián)覺；脊髓空洞癥；跗管綜合癥；遲發(fā)性運動障礙；骶管囊腫(Tarlov cyst);泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease);顳動脈炎；破傷風；脊髓栓系綜合癥；肌強直性白內障；胸廓出口綜合癥；三叉神經痛；托德癱瘓；拉塔綜合癥；中毒性腦??；短暫性腦缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦??；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經痛；熱帶痙攣性癱瘓；錐蟲??；結節(jié)性腦硬化；希林二氏?。煌魉箍颇X脊髓炎(ViliuiskEncephalomyelitis);瓦倫伯格氏綜合癥；韋德尼希-霍夫曼病；韋斯特綜合癥；頸椎(Whiplash);威廉斯綜合癥；威爾遜氏癥和腦肝腎綜合癥。除上述疾病外，本發(fā)明的方面還適用于下列心血管疾病的預后和診斷:動脈瘤；心絞痛；動脈粥樣硬化；腦血管意外(中風)；腦血管疾??；充血性心力衰竭；冠心??；心肌梗死(心臟病發(fā)作)以及周圍血管疾病。如本文使用，“核酸”包括對單鏈形式或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的引用，并且除非另有限定，還包括具有天然核苷酸基本性質的已知的類似物，因為它們以類似于天然存在的核苷酸(例如，肽核酸)的方式雜交到單鏈核酸。術語“RNA”指核糖核酸，編碼蛋白質產物或不編碼蛋白質產物(如miRNA，但不排除其他非編碼RNA)的RNA分子。RNA從DNA模板轉錄而來。本文使用的術語“突變體”指由天然野生型(native wild type)編碼序列或其亞基的突變產生的核酸化合物、蛋白質、分子、載體或細胞。本文使用的術語“突變”是指改變天然編碼序列的，通過置換、添加、缺失、插入、交聯(lián)或其他破壞或取代天然編碼序列的一個或多個核苷酸的任何變化，包括天然發(fā)生的剪接變體。具體地，上述突變提供使細胞成為癌癥細胞的基因。這些突變包括腫瘤抑制基因和/或癌基因的遺傳突變和后天突變?！皵U增”是指使用至少一個核酸序列作為模板構建多份核酸序列或多份互補的核酸序列。擴增系統(tǒng)包括聚合酶鏈反應(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈反應(LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴增(NASBA, Cangene公司，米西索加,安大略湖)、Q-0復制酶系統(tǒng)、基于轉錄的擴增系統(tǒng)(TAS)和鏈置換擴增(SDA)。參見例如Diagnostic Molecular Microbiology.Principlesand Applications, D.H.Persing et al., Ed., American Society for Microbiology,Washington, D.C.(1993)。擴增的產物稱為擴增子。術語“雜交”指由互補核苷酸之間的氫鍵形成的雙鏈核酸分子或雙螺旋核酸分子。術語“使雜交”或“使退火”指單鏈核酸序列通過互補核苷酸之間的氫鍵形成雙螺旋節(jié)段(segment)的過程。術語“寡核苷酸”指通過含磷的連接體(例如，磷酸二酯、烷基磷酸酯和芳基磷酸酯、硫代磷酸酯)，或不含磷的連接體(例如，肽、氨基磺酸鹽等)連接的短序列核苷酸單體(通常為6 100個核苷酸)。寡核苷酸可包含具有修飾的堿基(例如，5-甲基胞嘧啶)和修飾的糖基(如，2’ -0-甲基核糖、2’ -0-甲氧基乙基核糖、2’ -氟核糖、2’ -氨基核糖等)的修飾的核苷酸。寡核苷酸可以是具有環(huán)形、支鏈或直鏈形狀并且可選地包括能形成穩(wěn)定二級結構(例如，莖-環(huán)結構和環(huán)-莖-環(huán)結構)的域(domain)的雙鏈DNA和單鏈DNA以及雙鏈RNA和單鏈RNA的天然存在或合成的分子。本文使用的術語“引物”指寡核苷酸，當放在誘導作為核酸鏈互補物的引物延伸產物的合成條件下，即在核苷酸和聚合試劑例如DNA聚合酶存在下并在合適的溫度和pH值下，其能使擴增目標退火，使DNA聚合酶附著在其上作為DNA合成的引發(fā)點。為了最大的擴增效率，(擴增)引物優(yōu)選為單鏈。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長，以在聚合試劑存在下指引延伸產物的合成。引物的確切長度將取決于許多因素，包括溫度和弓I物來源。本文使用的“雙向引物對”，指在DNA擴增技術例如PCR擴增中通常使用的一個正向引物和一個反向引物。術語“探針”指單鏈寡核苷酸序列，該序列將識別目標核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互補序列并與其形成氫鍵雙螺旋。術語“嚴格性”或“嚴格的雜交條件”指影響雜交種的穩(wěn)定性的雜交條件，例如，溫度、鹽濃度、PH值、甲酰胺濃度等。憑經驗優(yōu)化這些條件以最大化引物或探針與目標核酸序列的特定結合，并最小化引物或探針與目標核酸序列的非特定結合。使用這些術語包括對下述條件的引用:探針或引物將雜交到其目標序列以至比其他序列具有能檢測的更大程度(例如，超過背景的至少2倍)的條件。嚴格的條件是取決于序列的，并且在不同環(huán)境下會有所不同。較長的序列具體在較高的溫度下雜交。一般而言，嚴格的條件選擇為，在限定的離子強度和PH值下，比特定序列的熱力學熔點(Tm)低約5°C。Tm是50%的互補目標序列雜交到完全匹配的探針或引物的溫度(在限定的離子強度和PH值下)。通常，嚴格的條件將是下述條件:pH為7.0 8.3下，鹽濃度小于約1.0M的Na+離子，通常為約0.01 1.0M的Na+離子濃度(或其他鹽)，并且對于短探針或引物(例如，10 50個核苷酸)溫度為至少約30°C以及對于長探針或引物(例如，大于50個核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴格的條件還可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺獲得。示例性低嚴格的條件下或“降低嚴格性的條件”包括在37°C下用30%甲酰胺、IM NaClU% SDS的緩沖液雜交，并且在40°C下在2XSSC中清洗。示例性高嚴格的條件包括在37°C下在50%甲酰胺、IMNaClU% SDS中雜交，并在60°C下在0.1XSSC中清洗。雜交過程是本領域中公知的并描述在例如Ausubel et al, CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons Inc.，1994。本文使用的“受試者”包括但不限于哺乳動物，包括例如人、非人類靈長動物、小鼠、豬、牛、山羊、貓、兔、大鼠、豚鼠、倉鼠、八齒鼠、馬、猴、綿羊，或其他非人類哺乳動物；以及非哺乳動物，包括例如非哺乳類脊椎動物，例如鳥(例如雞或鴨)或魚，和無脊椎動物。受試者可以是接受常規(guī)健康檢查的健康的動物受試者或人受試者。另外，受試者可以是具有疾病危險的受試者[例如，遺傳性易患病的受試者；具有癌癥醫(yī)療和/或家族病史的受試者；已接觸過致癌物、職業(yè)危害，環(huán)境危害的受試者]和/或表現(xiàn)出疾病的可疑臨床跡象的受試者[如便中有血或黑糞癥、不明原因的疼痛、出汗、不明原因的發(fā)熱、不明原因的體重減輕直至厭食、大便習慣改變(便秘和/或腹瀉)、里急后重(不完全的排便感，特別是直腸癌癥)、貧血和/或全身無力]。根據(jù)另一實施方式，受試者可以是診斷患有疾病并在治療之間正在進行常規(guī)檢查的患者。本文使用的術語“凝血細胞”指血液血小板，即不具有包含DNA的細胞核的小不規(guī)則形狀的細胞碎片，并且在哺乳動物的血液中循環(huán)。凝血細胞直徑是2 3 y m，并且源自前體巨核細胞的碎片。凝血細胞的平均壽命是5 9天。凝血細胞參與止血并在其中發(fā)揮著重要作用，致使血凝塊的形成。本文使用的術語“血液”指全血(包括血漿和細胞)并且包括動脈血液、毛細血管血液和靜脈血液。本文使用的術語“有核細胞”優(yōu)選指巴多林腺細胞；唾腺粘液細胞；唾腺漿液細胞；艾伯納腺細胞；乳腺細胞；淚腺細胞；耵聹腺細胞；排泄汗腺細胞；大汗腺細胞；睫毛腺細胞(Gland of Moll cell);皮脂腺細胞；嗅腺細胞；十二指腸腺細胞；精囊細胞；前列腺細胞；尿道球腺細胞；尿道腺細胞；子宮子宮內膜細胞；孤立杯狀細胞；胃襯粘液細胞；胃腺產酶細胞；胃腺壁細胞；胰腺腺細胞；潘納斯細胞型肺細胞；克拉拉細胞；垂體前葉細胞；中間垂體細胞；大細胞神經分泌細胞；甲狀腺細胞；甲狀旁腺細胞；腎上腺細胞；間質細胞；卵泡內膜細胞；黃體細胞；球旁細胞；致密斑細胞；極周細胞(Peripolar cell)；系膜細胞；血管和淋巴血管內皮有孔細胞；血管和淋巴血管內皮連續(xù)細胞；血管和淋巴血管內皮脾細胞；滑膜細胞；漿膜細胞；鱗狀細胞；柱狀細胞；暗細胞；前庭膜細胞；血管紋基底細胞；血管紋邊緣細胞；克勞狄烏斯細胞；伯特歇爾細胞；脈絡叢細胞；軟膜蛛網(wǎng)膜鱗狀細胞；色素睫狀體上皮細胞；無色素睫狀體上皮細胞；角膜內皮細胞；閏細胞；呼吸道纖毛細胞；輸卵管纖毛細胞；子宮內膜纖毛細胞；睪丸網(wǎng)纖毛細胞；輸出小管纖毛細胞；纖毛室管膜細胞；表皮角化細胞；表皮基底細胞；角化細胞；指甲床基底細胞；髓質毛干細胞；皮層毛干細胞；角質層毛干細胞；角質層毛根鞘細胞；外毛根鞘細胞；毛母質細胞；表面上皮細胞；基底細胞；尿路上皮細胞；聽內毛細胞；聽外毛細胞；初級感覺神經元；梅克爾細胞；嗅覺受體神經元；光感受器細胞；頸動脈體細胞(血液PH傳感器)；毛細胞；味蕾細胞；膽堿能神經細胞；腎上腺素能神經細胞；肽能神經細胞；內柱細胞；外柱細胞；內指狀細胞；外指狀細胞；邊緣細胞；漢森細胞(Hensen cell);前庭器官支持細胞；味蕾支持細胞；嗅覺上皮支持細胞；神經膜細胞；衛(wèi)星細胞；腸神經膠質細胞；星形膠質細胞；神經元細胞；少突細胞；紡錘體神經元；前晶狀體上皮細胞；含晶體蛋白晶狀體纖維細胞；肝細胞；脂肪細胞；肝脂肪細胞；腎小球壁細胞；腎小球足細胞；腎近曲小管刷狀緣細胞；海氏套細段細胞(Loop of Henle thin segment cell);腎遠端小管細胞；腎集尿管細胞；肺泡；胰管細胞；無橫紋管細胞；管細胞；腸刷狀緣細胞；外分泌腺紋狀管細胞；膽囊上皮細胞；輸出小管道無纖毛細胞；附睪主細胞；附睪基底細胞；成釉上皮細胞；半月平面上皮細胞(Planumsemilunatum epithelial cell);哥蒂氏齒間上皮細胞；疏松結締組織成纖維細胞；角膜成纖維細胞；腱成纖維細胞；骨髓網(wǎng)狀組織成纖維細胞；其他非上皮成纖維細胞；周細胞；髓核細胞；成牙骨質細胞/牙骨質細胞；成牙質細胞/牙質細胞(odontocyte);透明軟骨軟骨細胞；纖維軟骨軟骨細胞；彈性軟骨軟骨細胞；成骨細胞/骨細胞；骨原細胞；玻璃體細胞；星狀細胞；肝星狀細胞；胰腺形狀細胞(Pancreatic stelle cell);骨骼肌細胞；衛(wèi)星細胞；心肌細胞；平滑肌細胞；肌上皮細胞；巨核細胞；單核細胞；結締組織巨噬細胞；表皮郎格罕斯細胞；破骨細胞；樹突細胞；小神經膠質細胞；嗜中性粒細胞；嗜酸性粒細胞；嗜堿性粒細胞；肥大細胞；輔助性T細胞；抑制性T細胞；細胞毒性T細胞；自然殺傷T細胞；B細胞；自然殺傷細胞；網(wǎng)織紅細胞；黑素細胞；視網(wǎng)膜色素上皮細胞；卵原細胞/卵母細胞；精子細胞；精母細胞；精原細胞；精子；卵泡細胞；塞爾托利細胞；胸腺上皮細胞和間質腎細胞。目標治療和個性化醫(yī)療非常依賴于對疾病的剖析(profi I ing)和伴隨診斷(companion diagnostic)的發(fā)展。在源于疾病的核酸中的突變能高度預測目標治療的響應。然而，容易地獲得高質量的核酸仍然是重要的發(fā)展障礙。血液一般包含150000 350000個凝血細胞(血小板)每毫升，為研究和臨床使用提供高度可用的生物標記物源。此外，凝血細胞分離相對簡單并且在血庫/血液學實驗室里是標準過程。因為血小板不包含細胞核，它們的RNA轉錄-維持功能需要的-在凝血細胞產生期間來自骨髓巨核細胞?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，凝血細胞可在通過多種傳輸機制的循環(huán)過程中吸收RNA。腫瘤細胞釋放大量的遺傳物質積聚物(collection)，其中的一些由突變RNA形式的微泡分泌。在血液循環(huán)過程中，凝血細胞吸收由癌癥細胞及其他患病細胞分泌的遺傳物質，用作個性化醫(yī)療背景下上述癌癥和其他疾病的伴隨診斷的有吸引力的平臺。在下面的實施例中，表明從健康的人對照受試者中分離的血小板具有從來自人腦腫瘤細胞(神經膠質瘤)的包含RNA的微泡中吸收RNA的能力，之后，它們包含腫瘤相關的RNA,在神經膠質瘤患者的情況下包括例如突變體EGFRvIII mRNA。因此，確定從神經膠質瘤患者中分離的循環(huán)的血小板包含RNA生物標記物。使用RT-PCR以證實在凝血細胞中發(fā)現(xiàn)的突變體EGFRvIII mRNA反映了神經膠質瘤組織的存在。腫瘤標記物信息的存在不是神經膠質瘤患者的血小板獨有的，而更普遍地適用于本文確定的廣泛的疾病。編碼前列腺癌癥標記物PCA3和PSA的信使RNA可在前列腺癌患者的血小板中顯示，而這些標記物在健康對照受試者的血小板中不存在。除檢測與癌癥或其他疾病相關的基因突變外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，能使用基因表達陣列以分類患有特定類型(實體瘤)癌癥或其他疾病的受試者的凝血細胞核酸樣品。已證實用從健康的對照受試者分離的血小板中提取的核酸或從神經膠質瘤患者分離的血小板中提取的核酸得到mRNA表達譜明顯不同。如圖3C中示出的前30個點擊(hit),得到了不同的mRNA表達譜，并且能檢測到最小的神經膠質瘤生物標記物簽名(biomarkersignature)。圖3C中示出的不同譜包括下列基因的表達的明顯增加:WFDC1、KremenUDEF4A、ARG1、FKBP5、ACRC、ENST0328043、A_32_P167111、MAP2、ECTL8、UNC13B、TP53I3、FDXR、BXl19718、S0RT1、PFN4、C1QTNF5、A_24_P237896、PGLYRP1、SEC14L2、BC018626、MA0B、TCNl、AM0TL1、TSP50、CD109、A_24_P927015、THC2325987、C18orfl 和 LIN28 (這些基因名稱中一些參考微陣列編號(Microarray Accession number),例如安捷倫芯片(Agilent Chip)的寡核苷酸探針)。將理解的是，該譜不限制本發(fā)明的范圍，因為通常本領域技術人員清楚地知道如何使用本發(fā)明的方法獲得其他癌癥和其他疾病的其他合適的基因表達譜。本發(fā)明人現(xiàn)已經發(fā)現(xiàn)，血液中的血小板包含源于腫瘤的或腫瘤相關的或源于疾病的核酸或核酸表達譜形式的癌癥標記物和疾病標記物，并且發(fā)現(xiàn)這些血小板可用作本文限定的癌癥和其他疾病的分子剖析的診斷平臺。這在個性化醫(yī)療的背景下非常有用。本發(fā)明提供一種新的且易于使用的方法以分離用于遺傳分析的循環(huán)的源于疾病的物質(例如本文使用的疾病標記物)。本發(fā)明人從循環(huán)的凝血細胞中分離源于腫瘤的RNA，產生純RNA，并由此提供一種簡單的方式以從少量血液中提取高質量的RNA。凝血細胞核酸(NA)的分離和隨后的分析顯示血液中循環(huán)NA的診斷靈敏度顯著增加。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在患病的患者體內循環(huán)凝血細胞包含顯著量的源于疾病的RNA。該源于疾病的RNA顯示關于疾病的獨特的遺傳信息，其可用于確定疾病的類型、疾病的程度、疾病對治療可能的感受性。分析凝血細胞RNA中特定源于疾病的RNA的存在，如本文表明的源于神經膠質瘤腫瘤的EGFRvIII突變體RNA。本發(fā)明描述一種方法，該方法用于發(fā)現(xiàn)源于從血液中提取的無核血細胞例如凝血細胞內的疾病起源的有核細胞的特定轉錄。該方法是耐用(robust)且容易的。這歸因于快速和直通(straight forward)的提取過程和提取的NA的質量。在臨床使用情況下,凝血細胞提取(從血樣中)已經在一般的生物樣品采集中實施，因此預見實施到臨床上是相對容易的。本發(fā)明提供一種用于分析受試者血液中源于疾病的核酸的存在的通用方法以及一種使用所述通用方法診斷受試者疾病的方法。當本文引用本發(fā)明方法時，指的是兩類實施方式。本發(fā)明方法能在包括無核血細胞的任何合適的體樣品(body sample)上實施,例如包括血液的組織樣品，但優(yōu)選所述樣品是全血。受試者血樣能通過任何標準的方法獲得，例如通過靜脈提取。需要的血液量沒有特別的限制。根據(jù)采用的方法，本領域技術人員將能確定實施本發(fā)明方法的各個步驟需要的樣品量，并獲得用于遺傳分析的足夠的NA。通常，這些量將包括0.01 ii I IOOml范圍的體積。體樣品可在樣品采集后立即分析?；蛘撸鶕?jù)本發(fā)明方法的分析能在儲存的體樣品上或在儲存的其無核血細胞的部分優(yōu)選凝血細胞上實施。用于測試的體樣品或其無核血細胞的部分能使用本領域公知的方法和裝置保藏。在采集的無核血細胞部分中，凝血細胞優(yōu)選保持在非活性狀態(tài)(即處于非激活狀態(tài))。以這種方式，最好地保藏細胞的完整性和源于疾病的核酸。假如無核血細胞的部分是凝血細胞部分，該血小板分離部分優(yōu)選不包括貧血小板的血漿或富含血小板的血漿(PRP)。優(yōu)選進一步分離血小板以得到最佳分辨率。體樣品可適當?shù)赜闷渌绞教幚恚?，它可被純化，或消化，或可從中提取特定化合物。根?jù)表征所述樣品的無核血細胞中存在的NA的方法(該方法優(yōu)選包括RT-PCR)，通過本領域技術人員已知的方法可從樣品中提取無核血細胞，并轉移到分析方法需要的適于從中提取NA的任何合適的介質中。為防止早期破壞核酸，可處理接受受試者的體樣品以從中除去大量的核酸降解酶(如核糖核酸酶、DNA酶)。自受試者的體樣品中提取凝血細胞可包括任何可提供的方法。在輸血醫(yī)學中，凝血細胞經常通過單血液成分法采集，單血液成分法是一種醫(yī)療技術，其中捐贈者或患者的血液經過一種分離出一種特定的成分并將剩余部分返回循環(huán)的裝置。各個血液成分的分離用專業(yè)離心機完成。血小板分離置換法(Plateletpheresis)(也稱為血小板分離法(thrombopheresis)或血小板提取法(thrombocytapheresis))是采集凝血細胞的單血液成分采集過程?，F(xiàn)代自動血小板分離置換法允許獻血者捐出他們的凝血細胞的一部分，同時保持他們的紅血細胞和血漿的至少一部分。雖然可能通過單血液成分法提供本文想像的包括凝血細胞的體樣品，但采集全血并通過離心從中分離凝血細胞部分通常更容易。一般來說，在這樣的實驗規(guī)程中，通過室溫下約120 Xg的離心步驟約20分鐘，凝血細胞首先與其他血細胞分離從而得到富含血小板的血漿(PRP)部分。然后清洗上述凝血細胞(例如，在PBS-EDTA中)以除去血漿蛋白質并且富集凝血細胞。清洗步驟通常在室溫下在850 IOOOXg下進行約10分鐘。能進行進一步的富集以產生更純的凝血細胞部分。
血小板分尚一般包括在含有抗凝血劑朽1檬酸葡萄糖(例如，36暈升朽1檬酸、5暈摩爾/升KC1、90毫摩爾/升NaCl、5毫摩爾/升葡萄糖、10毫摩爾/升EDTApH6.8)的真空采血試管(Vacutainer tube)中的血樣采集。用于血小板分離的合適的實驗規(guī)程描述在Ferretti 等(J Clin Endocrinol Metab2002 ;87:2180 2184)。該方法包括初步離心步驟(1300rpm每10分鐘)以得到富含血小板的血漿(PRP)。然后在抗聚集緩沖液(Tris-HCllO毫摩爾/升；NaC1150毫摩爾/升；EDTA1毫摩爾/升；葡萄糖5毫摩爾/升；pH7.4)中清洗血小板三次,并如上所述離心以避免被血漿蛋白質的任何污染并除去任何殘余的紅細胞。然后，可在4000rpm下進行最后的離心20分鐘以分離血小板?？汕逑囱“孱w粒(pellet)(例如，在磷酸鹽緩沖鹽水中)。為用于疾病標記物含量的定量確定，能將血小板細胞膜的蛋白質濃度用作內部參照。該蛋白質濃度可使用血清白蛋白作為標準，通過布拉德福德法(method of Bradford)確定(Anal Biocheml976 ；72:248 254)。提供受試者的體樣品并且從中提取無核血細胞后，檢測受試者無核血細胞中疾病特異的核酸的存在。如果在受試者無核血細胞中遇到疾病特異的核酸，或如果在受試者無核血細胞中比在對照受試者的未受影響的血樣的無核血細胞中遇到更高含量的疾病特異的核酸，認為該疾病特異的核酸源自存在于受試者中的患病細胞或疾病組織，則所述受試者被診斷為患有本文限定的疾病。疾病特異的核酸(RNA和/或DNA疾病標記物)限定為源自包含與上述疾病相關的或該疾病特異的核酸序列中的突變或無突變的疾病細胞，并且還包括與來自健康獻血者無核血細胞中的核酸相比上調或下調的源于疾病的無核血細胞的核酸。因此，本文中術語“疾病特異的核酸”和“源于疾病的核酸”互換使用。將理解的是，未突變的基因能被識別并能用于疾病診斷。如果某些基因在某些疾病中被過度表達，這些核酸可轉移到無核血細胞。然而，如果這些核酸已經在健康受試者的無核血細胞中存在，人們能期望在這些患病的患者的無核血細胞中核酸份數(shù)增加。因此，在本發(fā)明方面的某些實施方式中，無核血細胞中某些基因的份數(shù)(或微陣列，例如通過定量PCR)的定量可有益于檢測過度表達這些基因的疾病的存在。本發(fā)明方法的再一步驟是提供無核血細胞提取的核酸片段。該核酸片段隨后用于其中疾病標記物的檢測。該無核血細胞提取的核酸片段可通過任何可提供的NA提取方法獲得。通常通過使用離液劑(chaotropic reagent)進行RNA提取。從細胞或組織中分離總RNA的第一步驟是在變性條件下破開細胞。1979年，Chirgwin等(Biochemistry, 18 [24]:5294 9，1979)發(fā)明了一種通過在具有0.1M2-巰基乙醇的4M的強效蛋白變性劑硫氰酸胍溶液中均質化以破壞蛋白質二硫鍵的有效分離總RNA的方法。然后通過乙醇提取或通過氯化銫超速離心來分離 RNA。1987 年,Chomczynski 和 Sacchi (Analytical Biochemistry,162[1]:156 9，1987)修改該方法，從而發(fā)明了使用硫氰酸胍和苯酚-氯仿混合物的快速單步提取過程，一種對于處理大量樣品或對于從少量細胞或組織中分離RNA特別有用的方法。任何商業(yè)試劑盒也能用于RNA的提取，其非限制性實例包括Ambion’s RNAqueousTM系統(tǒng)、BiolOl’s RNaid Plus 試劑盒、Bioline Ltd.’s RNAce 試劑盒、CL0NTECH’s NucleoSpin RNA II 和 Nucleo Trap mRNA 試劑盒、Invitrogen Corp.’ s S.N.A.P.全 RNA 分離試劑盒以及QIAGEN’ s RNeasy試劑盒。提取的核酸樣品中的源于疾病的核酸的檢測，可通過適合用于檢測疾病特異的核酸中的核酸序列突變或表達譜的任何可提供的遺傳分析技術進行。通常，通過選擇性核酸雜交能容易地檢測該序列突變，該選擇性核酸雜交包括通過兩個單鏈核酸序列彼此選擇性雜交形成的雙螺旋核酸結構的形成。選擇性雜交包括對下述雜交的引用:在嚴格的雜交條件下，核酸序列雜交到指定的核酸目標序列以至比其雜交到非目標核酸序列以及基本排除的非目標核酸更大的能檢測的程度(例如，超過背景的至少2倍)。選擇性雜交的序列彼此通常具有約至少80%的序列一致性，優(yōu)選90%的序列一致性，并且最優(yōu)選100%的序列一致性(即，互補)?；蛘?，源于疾病的核酸的檢測可通過測序技術例如DNA測序和RNA測序進行。當檢測RNA中的序列突變或RNA的表達譜時，優(yōu)選在檢測其序列突變或定量表達量前將RNA轉錄成cDNA。使用RNA依賴性DNA聚合酶，例如來自病毒、反轉錄轉座子、細菌等的反轉錄酶，能將RNA反轉錄成cDNA。這些聚合酶能具有核糖核酸酶H活性，或能使用如此突變以至于反轉錄酶的核糖核酸酶H活性受到限制或不存在(例如，MMLV-RT核糖核酸酶H-)的反轉錄酶。RNA依賴性DNA的合成(反轉錄)也能通過下述酶進行，經過突變該酶顯示出更改的核酸依賴性或改變的反應條件，并由此獲得RNA依賴性DNA聚合酶的功能。將RNA反轉錄成cDNA的商業(yè)試劑盒是可提供的。 一旦將RNA反轉錄成cDNA,使用例如上述選擇性核酸雜交,能分析該DNA序列中癌癥特異突變的存在或能分析表達譜。這些技術是本領域眾所周知的，并且可包括使用對將被檢測的突變特異的擴增引物的選擇性擴增，或使用mRNA特異探針選擇性雜交到核酸陣列?；蛘?，一般的引物能用于擴增DNA，該DNA包括可疑突變，然后使用對該突變特異的探針通過選擇性核酸雜交能在擴增子中檢測該突變。表達譜通常使用在本領域很好地描述的定量雜交法得到，其示例描述在實施例中。本發(fā)明方法原則上能通過使用任何核酸擴增方法實施，例如聚合酶鏈反應(PCR ;Mullisl987，美國專利號4683195,4683202,4800159)，或通過使用擴增反應，如連接酶鏈反應(LCR ；Barany1991, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:189 193;歐洲專利申請?zhí)?320308)，自主序列復制(3SR ；Guatelli et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874 1878)，鏈置換擴增(SDA，美國專利號5270184、5455166)，轉錄擴增系統(tǒng)(TAS ；Kwoh et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173 1177), Q-0 復制酶(Lizardi etal., 1988, Bio/Technology6:1197),滾環(huán)擴增(Rolling Circle Amplification) (RCA,美國專利號5871921)，基于核酸序列的擴增(NASBA)，裂解酶碎片長度多態(tài)性(CleavaseFragment Length Polymorphism)(美國專利號5719028),等溫和嵌合引物引發(fā)的核酸的擴增(ICAN),分枝延伸擴增法(Ramification-extension Amplification Method) (RAM,美國專利號5719028和5942391)，或其他合適的擴增DNA的方法。為了將具有少數(shù)失配的DNA擴增至一個或多個擴增引物，擴增反應可在降低嚴格性的條件下進行(例如使用退火溫度為38°C或在3.5mM MgCl2存在下的PCR擴增)。本領域技術人員將能夠選擇合適嚴格性的條件。本文的引物選擇為“基本上”與它們在將被放大的每個特定序列的不同鏈上存在的目標區(qū)域互補(即至少65%，更優(yōu)選至少80%完全互補)?？赡苁褂冒缂〈細埢蚰：龎A基的弓I物序列或甚至使用當與目標序列相比時，包含一個或多個失配的引物。一般而言，認為表現(xiàn)出與目標DNA寡核苷酸序列至少65%，更優(yōu)選至少80%的同源性的序列適用于本發(fā)明方法。當使用低嚴格性雜交條件時，序列失配也不是關鍵的。原則上擴增產物的檢測能通過本領域已知的任何合適的方法完成。檢測的碎片(fragment)可用放射性標記物、抗體、發(fā)光染料、突光染料,或酶試劑直接染色或標記。直接的DNA染色劑包括例如嵌入性染料(intercalating dye),例如卩丫唳橙、溴化乙錠、溴化乙錠單疊氮化物或赫克斯特染料(Hoechst dye)?；蛘?，上述DNA碎片可通過將標記的dNTP堿基并入到合成的DNA碎片中檢測?？膳c核苷酸堿基相關的檢測標記包括，例如熒光素、花菁染料或溴脫氧尿苷(BrdUrd)。當使用基于探針的檢測系統(tǒng)時，在本發(fā)明中使用的合適的檢測過程可包括例如酶免疫測定(EIA)形式(Jacobs et al.，1997，J.Clin.Microbiol.35，791795)。為實施通過EIA過程的檢測，擴增反應中使用的正向引物或反向引物可包括捕獲基(capturinggroup)，例如用于將目標DNAPCR擴增子固定在例如鏈霉親和素涂覆的微量滴定板的孔(well)上的生物素基，用于隨后的目標DNA擴增子序列EIA的檢測(見下文)。本領域技術人員將理解，可采用將目標DNA PCR擴增子固定為EIA形式的其他基團。本文公開的對目標DNA的檢測有用的探針優(yōu)選只結合到通過DNA擴增過程擴增的DNA序列區(qū)域的至少一部分。如本文描述，基于目標DNA的核苷酸序列，本領域技術人員能制備合適的用于檢測的探針，而無需過多的實驗。此外，目標DNA的互補序列可適當?shù)赜米鞅景l(fā)明方法中的檢測探針，只要該互補鏈在采用的擴增反應中被擴增。本文使用的合適的檢測過程可包括擴增子的固定并通過例如DNA印跡法探測其DNA序列。其他形式可包括上述EIA形式。為便于結合的檢測，特異的擴增子檢測探針可包括標記部分，如熒光團、生色團、酶或放射性標記物，以便于監(jiān)測探針結合到擴增反應的反應產物。這些標記是本領域技術人員眾所周`知的并包括例如，異硫氰酸熒光素(FITC)、
半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、鏈霉親和素、生物素、異羥基洋地黃毒甙元、35S或1251。其他實例對于本領域技術人員將是顯而易見的。檢測還可通過例如由Van den Brule 等描述的(2002, J.Clin.Microbiol.40,779787)所謂的反向線印跡(RLB)陣列實施。為此，RLB探針優(yōu)選用5’氨基合成，用以隨后固定在例如羧基涂覆的尼龍膜上。RLB形式的優(yōu)點是該系統(tǒng)的簡易性和其速度，從而允許高通過量樣品處理。用于檢測DNA碎片的核酸探針的使用在本領域是眾所周知的。大部分這些過程包括目標DNA與探針的雜交，隨后是雜交后清洗。特異性通常是雜交后清洗的功能，關鍵因素是最后清洗溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm(熱力學熔點，即在限定的離子強度和PH值下，50%的互補目標序列雜交到完全匹配的探針的溫度)能由 Meinkoth 和 Wahl 方程(Anal.Biochem.，138:267 284 (1984))估算:Tm =81.5°C +16.6 (1gM) +0.41(% GC) -0.61 (%甲酰胺)-500/L，其中，M是單價陽離子的摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，以及L是堿基對中雜交體的長度。每I %失配Tm降低約I°C;因此，能調節(jié)雜交和/或清洗條件以雜交到所需一致性的序列。例如，如果追求具有> 90%—致性的序列Tm能降低10°C。一般而言，對于特定的序列及其互補序列，在限定的離子強度和pH值下，嚴格的條件選擇為比Tm低約5°C。然而，非常嚴格的條件能利用比1 低11:、21:、31:或41:下的雜交和/或清洗；中等嚴格的條件能利用比Tm低6°C、7°C、8°C、9°C或10°C下的雜交和/或清洗；低嚴格的條件能利用比Tm低11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C下的雜交和/或清洗。使用上述方程，雜交和清洗組合物，以及所需Tm，本領域普通技術人員將理解本質上描述了嚴格的雜交和/或清洗溶液的嚴格性的變型。如果所需的失配程度致使低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，優(yōu)選增加SSC濃度從而能使用更高的溫度。核酸雜交的詳盡的指南在 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter2 “Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，，，Elsevier.New York(1993)以及 Current Protocols in Molecular Bio logy, Chapter2,Ausubel,et al.,Eds.,Greene Publishing and ffiley-1nterscience,New York(1995)中找到。檢測探針優(yōu)選選擇為“基本上”與由本發(fā)明方法的擴增反應產生的雙鏈DNA擴增子的鏈中的一個鏈互補。優(yōu)選上述探針基本上與由目標DNA產生的擴增子的可固定的(例如生物素標記的)反義鏈互補。檢測探針包含與它們的目標序列一個或多個失配是允許的。一般而言，認為表現(xiàn)出與目標DNA寡核苷酸序列至少65%，更優(yōu)選至少80%的同源性的序列適用于本發(fā)明方法。分析無核血細胞提取的核酸片段中疾病標記物的存在的步驟因此能通過標準的核酸分析技術進行。相對于未受影響的血樣，確定所述核酸片段中所述核酸標記物的含量是否有改變的步驟，將包括無核血細胞中疾病標記物的量的(半)定量測量。因此，從無核血細胞中分離的核酸中檢測疾病特異標記物的非常優(yōu)選的實驗規(guī)程是定量反轉錄PCR(qRT-PCR)(Freeman et al., Bio Techniques26:112 125(1999))。上述“未受影響的血樣”指健康的對照受試者或來自疾病初現(xiàn)之前的同一受試者的無核血細胞中疾病標記物的含量。因為無核血細胞的特性和無核血細胞成分的數(shù)量除其他外取決于物種和年齡，優(yōu)選未患病的對照無核血細胞來自相同物種，相同年齡的受試者以及來自相同的子人群(如吸煙者/不吸煙者)?；蛘?，對照數(shù)據(jù)可取自數(shù)據(jù)庫和文獻。將理解的是，為分析疾病的進展對照樣品也可取自特定時間點的疾病受試者。疾病標記物包括癌癥/特異突變并且癌癥-結合突變可包括多種已知的與癌癥相關的突變。多種癌癥突變實例的非限制性列表提供在http://www.sanRer.ac.uk/genetics/CGP/Census/以及本文的表中。本發(fā)明進一步提供一種用于在受試者中診斷疾病的試劑盒，包括包裝材料的所述試劑盒包括用于具體確定受試者無核血細胞樣品中至少一種核酸突變體的含量和/或活性和/或核酸譜的至少一種試劑。如本文使用，術語“診斷”指確定疾病的存在，分類疾病，確定疾病的嚴重性(等級或階段)，監(jiān)測疾病的進展，預測疾病的結果和/或恢復的前景。將理解的是，檢測源于疾病的核酸必需的工具可提供為試劑盒，如FDA批準的試劑盒，其可包括含用于通過本發(fā)明方法檢測無核血細胞中源于疾病的核酸的活性組分的一個或多個單位劑量形式?；蛘?，上述試劑盒可包括用于采集樣品的裝置和單獨包裝的特異擴增引物和/或檢測引物。
上述試劑盒可伴隨有用于實施本發(fā)明方法的操作指南。例如，上述試劑盒可包括在諸如浸量尺或套筒的器件中，(可選地包括在外殼中)，對該器件可應用血樣，或分離的和/或擴增的無核血細胞核酸樣品，并且該器件檢測所述樣品中源于疾病的核酸或疾病特異的核酸或核酸譜。該器件可包括能具體檢測源于疾病的核酸的任何試劑。例如，該器件可包括固定的突變特異的雜交探針(其結合源于疾病的核酸)和用于檢測結合的指示劑中的一種或其組合。在本發(fā)明實施方式中，在上述器件中提供雜交探針可除去地或固定地附著在其上的支撐體。根據(jù)一種實施方式，上述器件可以是包括入口裝置的橫向流動設備，其用于使血樣或分離的和/或擴增的無核血細胞核酸樣品流動至與能檢測源于疾病的核酸的試劑接觸。測試器件還能包括用于保證測試正常進行的流量控制裝置。作為證實合適流量的樣品流體經過測試器件的手段，該流量控制裝置能包括結合到載體上的對照核酸，該核酸捕獲添加到樣品中的檢測探針?；蛘?，上述流量控制裝置能包括在控制區(qū)域中的捕獲探針，其捕獲在所述樣品中天然存在的對照核酸或添加到其中作為對照的核酸，再次指示上述器件內合適的流量通過。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明器件的用途，該用途為使用本文上述任一方法診斷受試者中疾病。用于使用本文上述任一方法診斷受試者中疾病的非常合適的器件包括例如Nagalla&Bray (2010)Bloodl 15 (I):2 3 和 Gnatenko et al.Bloodll5 (I):7 14 中描述的血小板RNA芯片。本發(fā)明現(xiàn)將通過以下非限制性實施例例示。實施例實施例1通過離心步驟，從4個膠質母細胞瘤患者和4個健康獻血者的血樣中分離凝血細胞。然后使用Trizol RNA分離法，對凝血細胞進行RNA提取。純化的血小板RNA樣品然后轉化成cDNA,并使用標準的微陣列實驗規(guī)程通過Agilent4X44K表達微陣列分析。這使得在不同的凝血細胞制劑中剖析mRNA。來自健康獻血者的血小板中約8500個RNA轉錄物通過表達微陣列不能檢測到。來自健康獻血者的凝血細胞中，這些轉錄物以低于Agilent4X44K芯片檢出限的含量存在。因此，這些RNA可全是潛在的用于癌癥診斷的生物標記物。來自健康獻血者的凝血細胞中通過表達微陣列不能檢測到的RNA中，相當量的RNA在來自膠質母細胞瘤患者的凝血細胞中檢測到。表I總結了在來自膠質母細胞瘤患者的凝血細胞中而不是在來自健康獻血者的凝血細胞中通過表達微陣列檢測到的獨特的血小板RNA轉錄物。在4/4患者樣品中(表1A)或3/4患者樣品(表1B)中但不是在四個對照樣品任一個中檢測到的獨特的RNA轉錄物總結在表I中。表I在來自膠質母細胞瘤患者的凝血細胞中而不是來自健康獻血者的凝血細胞中通過表達微陣列檢測到的獨特的血小板RNA轉錄物IA在四個患者樣品的四個中的凝血細胞中檢測到而在來自對照樣品的凝血細胞
中未檢測到的轉錄物
權利要求
1.一種分析受試者血樣中疾病標記物的存在的方法，所述方法包括下述步驟: a)從所述血樣的無核血細胞，優(yōu)選凝血細胞中提取核酸，以提供無核血細胞提取的核酸片段；以及 b)分析所述無核血細胞提取的核酸片段中疾病標記物的存在； 其中，所述疾病標記物是所述受試者的有核細胞的基因中的疾病特異突變；或 其中，所述疾病標記物是所述受試者的有核細胞的基因的疾病特異表達譜。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述無核血細胞是凝血細胞或紅細胞，優(yōu)選凝血細胞。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，所述疾病選自癌癥、自身免疫性疾病、皮膚疾病、眼疾病、內分泌疾病、神經紊亂以及心血管疾病組成的組。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述疾病是癌癥，優(yōu)選其中所述癌癥是優(yōu)選選自結腸、胰腺、腦、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宮、肝、腎、脾、胸腺、甲狀腺、神經組織、上皮組織、淋巴結、骨、肌肉和皮膚的實體腫瘤癌癥。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述疾病特異突變發(fā)生在染色體基因內，或其中，所述疾病特異表達譜是染色體基因的表達譜。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述核酸是核糖核酸(RNA)，優(yōu)選mRNAo
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，分析所述無核血細胞提取的核酸片段中疾病標記物的存在的所述步驟b)包括選擇性擴增: i)所述突變，使用至少一種核酸突變特異擴增引物或探針，通過反轉錄酶聚合酶鏈反應擴增，或 ii)多個mRNA，通過反轉錄酶聚合酶鏈反應擴增，以確定編碼所述mRNA的染色體基因的表達水平，由此以提供所述基因的表達譜，并將所述表達譜與參考譜進行比較。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述方法是診斷受試者所述疾病方法的一部分，并且其中，所述無核血細胞提取的核酸片段中所述疾病標記物的存在表明所述受試者患有所述疾病。
9.一種用于確定受試者的疾病階段或疾病治療的療效的方法，包括下述步驟: 使用根據(jù)權利要求1 8中任一項所述的方法在第一時間點分析受試者血樣中疾病標記物的存在，由此提供所述受試者中所述疾病標記物的含量的第一值； 使用根據(jù)權利要求1 8中任一項所述的方法在第二時間點分析所述受試者血樣中疾病標記物的存在，由此提供所述受試者中所述疾病標記物的含量的第二值，其中，所述受試者已經在所述第一時間點和所述第二時間點之間接受過疾病治療；以及 比較所述第一值和所述第二值以確定所述受試者的所述疾病治療的療效。
10.一種用于確定受試者的疾病階段的方法，包括下述步驟: 使用根據(jù)權利要求1 8中任一項所述的方法分析受試者血樣中疾病標記物的存在，由此提供所述受試者中所述疾病標記物的含量的測試值； 提供所述疾病標記物的含量的參考值，其中，所述參考值與疾病的特定階段相關；以及 比較所述測試值和所述參考值以確定所述受試者的疾病階段。
11.一種適于實施根據(jù)權利要求1 10中任一項所述的方法的部件的試劑盒，包括包裝材料的所述試劑盒包括下述至少之一: 用于盛放從受試者血樣中分離的無核血細胞的容器； 用于從所述無核血細胞中提取核酸的試劑； 用于通過反轉錄酶聚合酶鏈反應擴增由提取自所述無核血細胞的所述核酸選擇性擴增所述受試者的有核細胞的基因中的疾病特異突變的試劑；以及 用于實施根據(jù)權利要求1 10中任一項所述的方法的印刷操作指南或電子操作指南， 所述試劑盒還包括: 所述疾病標記物的參考標準，其中，所述參考標準指示出所述無核血細胞提取的核酸片段中所述疾病標記物的存在或不存在。
12.根據(jù)權利要求11所述的試劑盒， 其中，所述參考標準是健康的對照受試者或患有所述疾病的對照受試者的凝血細胞中包括所述疾病特異突變的核酸的含量的參考值，或 其中，所述參考標準是來自健康的對照受試者或患有所述疾病的對照受試者的無核血細胞中的所述多個mRNA的參考表達譜。
13.根據(jù)權利要求11或12所述的試劑盒，所述試劑選自粒子或熒光標記物標記的抗無核血細胞抗體，或其中所述操作指南選自用于基于微珠的無核血細胞分離的操作指南、用于無核血細胞FACS分選的操作指南、用于通過離心回收無核血細胞的操作指南或用于非無核血細胞成分的負選擇的操作指南。
14.一種用于診斷疾病的器件，所述器件包括支撐體和附著于所述支撐體的用于具體確定受試者無核血細胞樣品中至少一種核酸突變體的含量和/或活性的至少一種試劑，以及 具有用于實施根據(jù)權利要求1 10中任一項所述的方法的計算機可執(zhí)行指令的計算機可讀介質。
15.根據(jù)權利要求14所述的器件，其中，所述至少一種試劑是寡核苷酸探針或測序引物。
16.根據(jù)權利要求14或15所述的器件，包括橫向流動設備、浸量尺或套筒，它們用于進行: 無核血細胞提取的核酸和至少一種核酸突變特異擴增引物或寡核苷酸探針之間的核酸雜交反應，其中，所述核酸突變特異擴增引物或寡核苷酸探針對疾病特異突變是特異性的；或 無核血細胞提取的核酸和多種基因特異擴增引物或寡核苷酸探針之間用于提供疾病特異基因表達譜的核酸雜交反應 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分析受試者血樣中疾病標記物的存在的方法。所述方法包括下述步驟a)從所述血樣的無核血細胞中提取核酸以提供無核血細胞提取的核酸片段，以及b)分析所述無核血細胞提取的核酸片段中疾病標記物的存在，其中，所述疾病標記物是所述受試者細胞的基因中的疾病特異突變，或其中所述疾病標記物是所述受試者的細胞的基因的疾病特異表達譜。
文檔編號G01N33/48GK103168235SQ201180044900
公開日2013年6月19日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權日2010年7月16日
發(fā)明者托馬斯·武丁格爾, 羅爾夫·喬納斯·尼爾松 申請人:阿姆斯特丹自由大學及阿姆斯特丹自由大學醫(yī)療中心基金會