專利名稱：調(diào)節(jié)通過miR-378實現(xiàn)的代謝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過施用調(diào)控微小RNA(miRNA)活性或表達的藥劑來治療和預(yù)防心臟和代謝病癥。具體而言，本發(fā)明提供了通過抑制受試者細胞中miR-378/miR-378*的表達或活性來治療或預(yù)防心臟和代謝病癥的方法。另外，本發(fā)明提供了通過使細胞與miR-378/miR-378*表達或活性的調(diào)控劑接觸來調(diào)節(jié)細胞中脂肪酸代謝的方法。
背景技術(shù)：
心臟病及其表現(xiàn)，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心臟肥大，清楚地呈現(xiàn)了美國當(dāng)今的一項重大健康風(fēng)險。診斷、治療和維持罹患這些疾病的患者的花費已經(jīng)達到數(shù)十億美元。心臟病的兩種特別嚴重的表現(xiàn)是心肌梗死和心臟肥大。心肌梗死，通常稱為心臟病發(fā)作，是由于突然和持續(xù)缺乏向心臟組織的血液流動(其通常是冠狀動脈狹窄或阻塞的結(jié)果)引起的。沒有足夠的供血，組織變得缺血，這導(dǎo)致心肌細胞(例如心臟肌肉細胞)和血管結(jié)構(gòu)的死亡。心肌細胞死亡產(chǎn)生的壞死組織一般被瘢痕組織替代，所述瘢痕組織沒有收縮性，無助于心臟功能，而且常常通過在心臟收縮期間擴張或通過增加心室的大小和有效半徑(例如變成肥大)而在心臟功能中發(fā)揮有害作用。心臟肥大是心臟對實際上所有形式心臟病(包括那些源自高血壓、機械負荷、心肌梗死、心臟心率失常、內(nèi)分泌病癥、和心臟收縮蛋白質(zhì)基因中的遺傳突變)的適應(yīng)性應(yīng)答。雖然肥大性應(yīng)答最初是提高心排血量的代償機制，但是持久的肥大能導(dǎo)致擴張性心肌病(DCM)、心力衰竭、和猝死。在美國，每年有大約50萬人診斷出心力衰竭，死亡率接近50%。眾多信號傳導(dǎo)途徑，尤其是那些牽涉異常鈣信號傳導(dǎo)的，推動心臟肥大和病理性重塑(Heineke和Molkentin, 2006)。響應(yīng)壓力而發(fā)生的肥大性生長涉及與響應(yīng)鍛煉而發(fā)生的生理性肥大不同的信號傳導(dǎo)途徑和基因表達樣式。應(yīng)激介導(dǎo)的心肌肥大是與眾多不良后果有關(guān)的復(fù)雜現(xiàn)象，其中獨特的分子和組織學(xué)特征引起心臟發(fā)生纖維組織形成、擴張和代償失調(diào)，這經(jīng)由心肌細胞變性和死亡，常常以心力衰竭達到極點。因此，對于解開根本的分子機制和為阻抑不良心臟生長及最終衰竭發(fā)現(xiàn)新的治療性靶物很感興趣。了解這些機制對于設(shè)計治療心臟肥大和心力衰竭的新療法是至關(guān)重要的。代謝綜合征是一種增加形成心血管疾病和糖尿病的風(fēng)險的醫(yī)學(xué)病癥組合。它影響著五分之一的人， 并且流行率隨年齡而增加。一些研究估計美國的流行率是人口的多至25%(Ford等(2002) JAMA，第287卷356-359)。罹患代謝綜合征的人一般是肥胖的，久坐的，而且具有某種程度的胰島素抗性。肥胖癥是一種主要的可預(yù)防的世界性死亡原因，在成人和兒童中流行率日益增加，并且官方將其視為21世紀最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一(Barness 等(2007) A m. J. Med. Genet. A,第 143A 卷:3016-34)。肥胖癥可以導(dǎo)致縮短的壽命預(yù)期和增加的健康問題，包括心臟病、2型糖尿病、睡眠呼吸暫停、某些類型的癌癥、和骨性關(guān)節(jié)炎。目前針對代謝綜合征和肥胖癥的療法聚焦于節(jié)食和鍛煉，可用的有效藥物干預(yù)非常少。飲食和鍛煉在改善這些狀況中的效率在患者間變化很大，并且趨向于僅提供中等程度的重量減輕和癥狀改善。因此，需要治療代謝病癥及預(yù)防隨后的心血管疾病和心力衰竭形成的新治療方法。最近提出微小RNA涉及多種生物學(xué)過程，包括對發(fā)育時機、凋亡、脂肪代謝、和造血細胞分化等的調(diào)節(jié)。微小RNA(miRNA)是長度為約18至約25個核苷酸的小的、非蛋白質(zhì)編碼RNA，其源自單獨的miRNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子、或經(jīng)常編碼多種緊密相關(guān)的miRNA的多順反子轉(zhuǎn)錄物。參見Carrington等人的綜述(Science,第301卷(5631) : 336-338, 2003)。miRNA通過促進靶mRNA的降解(在它們的序列完全互補時)，或者通過抑制翻譯(在它們的序列含有錯配時)來充當(dāng)其阻抑物。miRNA 通過 RNA 聚合酶 II (pol II)或 RNA 聚合酶 III (pol III;參見 Qi 等(2006)Cellular&Molecular Immunology,第3卷411_419)轉(zhuǎn)錄，并且產(chǎn)生一般長幾千個堿基的初始轉(zhuǎn)錄物，其稱作初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pr1-miRNA)。pri_miRNA在細胞核中被RNA酶Drosha加工成約70至約100個核苷酸的發(fā)夾形前體(pre_miRNA)。轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)后，發(fā)夾pre-miRNAb受到Dicer進一步加工以生成雙鏈miRNA。然后,成熟的miRNA鏈摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，在那里它通過堿基對互補性與其靶mRNA結(jié)合。在miRNA堿基與mRNA靶物完全配對的相對罕見的情況中，它促進mRNA降解。更通常地，miRNA與靶mRNA形成不完美的異雙鏈體，影響mRNA穩(wěn)定性或者抑制mRNA翻譯。最近，已經(jīng)鑒定出人和小鼠心臟病模型中與病理性心臟肥大、心力衰竭和心肌梗死有關(guān)的 miRNA 的標簽 (signature)表達樣式(van Rooij 等(2006)Proc. Natl. Acad.Sc1.,第 103 卷(48) : 18255-60; van Rooi j 等，(2007) Science,第 316 卷575-579)。小鼠中的功能獲得和失去研究已經(jīng)揭示了這些miRNA在心臟生物學(xué)的多個方面，包括控制肌細胞生長、收縮性、能量代謝、纖維化、和血管發(fā)生中的深遠且出乎意料的功能，暗示心臟病的新調(diào)節(jié)機制和潛在的治療性靶物。值得注意地，缺乏疾病誘導(dǎo)miRNA的敲除小鼠是正常的，但是展現(xiàn)出對心臟應(yīng)激的異常應(yīng)答，提示了這些miRNA對疾病相關(guān)過程，而不是體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的貢獻，而且指向其作為治療性靶物的潛力。如此，miRNA代表用于開發(fā)針對多種疾病，包括心血管疾病、肥胖癥、糖尿病、和其它代謝病癥的治療的潛在的新治療性靶物。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于如下的發(fā)現(xiàn)，即miR-378的表達在壓力過負荷后在心臟組織中下調(diào)，而且以心臟特異性方式過表達miR-378加重由應(yīng)激誘導(dǎo)的心臟肥大應(yīng)答。骨骼肌中miR-378/miR-378*的過表達產(chǎn)生增加的體重，其源自由脂肪細胞肥大和可能地脂肪細胞增生所致的附睪脂肪墊質(zhì)量增力口。如此，令人驚訝地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 miR-378/miR-378*調(diào)節(jié)不同組織，包括心臟和脂肪組織中的代謝過程。因而，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防心血管疾病和其它代謝病癥，諸如肥胖癥和糖尿病的方法，其通過在有此需要的受試者中調(diào)控細胞中miR-378和/或miR-378*的表達或活性來進行。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在有此需要的受試者中治療或預(yù)防病理性心臟肥大、心臟重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括對受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑。在某些實施方案中，在施用后miR-378和/或miR-378*的表達或活性在受試者的心臟細胞中降低。在其它實施方案中，在施用miR-378和/或miR-378*抑制劑后應(yīng)激誘導(dǎo)的從氧化至糖酵解代謝的代謝轉(zhuǎn)變在受試者的心臟細胞中得到預(yù)防或降低。本發(fā)明還包括在有此需要的受試者中治療或預(yù)防代謝病癥的方法。在一個實施方案中，所述方法包括對所述受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑，其中miR-378和/或miR-378*的表達或活性在施用后在受試者的細胞中降低。要治療的代謝病癥可以包括代謝綜合征、肥胖癥、糖尿病、糖尿病性腎病、胰島素抗性、動脈粥樣硬化、脂質(zhì)貯積病癥、糖原貯積病、中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、脂質(zhì)氧化、或異常葡萄糖攝取和/或利用。也可以用本發(fā)明的方法預(yù)防或治療這些代謝病癥導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病或狀況。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑來預(yù)防或治療肥胖癥導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病或病癥，諸如睡眠呼吸暫停、癌癥、和骨性關(guān)節(jié)炎的方法。適合于用于本發(fā)明方法的miR-378和miR-378*抑制劑可以是反義寡核苷酸。在一個實施方案中，反義寡核苷酸包含與miR-378或miR-378*的成熟序列至少部分互補的序列。在某些實施方案中，反義寡核苷酸包含一處或多處糖或主鏈修飾，諸如鎖定核酸、二環(huán)核苷、膦甲酸酯(phosphonoformate)、2’0_烴基修飾、和硫代磷酸酯連接。在其它實施方案中，miR-378或miR-378*抑制劑是長度為約7至約18個核苷酸的反義寡核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)細胞中脂肪酸代謝的方法，包括使所述細胞與miR-378和/或miR-378*表達或活性的調(diào)控劑接觸。所述調(diào)控劑可以是miR-378和/或miR-378*表達或活性的抑制 劑或激動劑。在某些實施方案中，與未暴露于抑制劑的細胞相比，脂肪酸代謝在與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸后的細胞中升高。在其它實施方案中，與未暴露于激動劑的細胞相比，脂肪酸代謝在與miR-378和/或miR-378*激動劑接觸后的細胞中降低。細胞可以是體外或體內(nèi)的。在一些實施方案中，細胞是心肌細胞、骨骼肌細胞、前脂肪細胞(preadipocyte)、脂肪細胞、肝細胞、或胰細胞。本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)心臟代謝的方法。在一個實施方案中，所述方法包括使心肌細胞與miR-378和/或miR-378*表達或活性的調(diào)控劑接觸。心肌細胞可以是體外或體內(nèi)的。在另一個實施方案中，碳水化合物代謝在與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸后的心肌細胞中降低。在又一個實施方案中，脂肪酸代謝在與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸后的心肌細胞中升高。本發(fā)明涵蓋藥物組合物，其包含本文中所描述的miR-378和miR-378*抑制劑和激動劑和藥學(xué)可接受載體。在一個實施方案中，藥物組合物包含miR-378和/或miR-378*的抑制劑和藥學(xué)可接受載體，其中所述抑制劑是反義寡核苷酸。在某些實施方案中，反義寡核苷酸包含至少一處糖和/或主鏈修飾。在其它實施方案中，反義寡核苷酸的長度是約7至約18個核苷酸。附圖簡述圖LA. miR-378在宿主基因PPARGCie內(nèi)的基因組位置(頂部)。UCSC基因組瀏覽器顯示在miR-378周圍的基因組區(qū)的保守性(底部)。B.定量實時PCR分析顯示miR-378、miR-378*、和PPARGC1 β (PGC-1 β )，即miR-378/miR_378*的宿主基因在心臟、骨骼肌和褐色脂肪組織中特異性表達。c. miR-378在心肌細胞中比在心臟成纖維細胞中更高度表達。D. miR-378表達在用硬脂酸處理HIBlB細胞后降低。E.誘導(dǎo)脂肪細胞分化期間的miR-378和PPARGC1 β (PGC-1 β )表達。CMC :心肌細胞，BAT :褐色脂肪組織，WAT 白色脂肪組織。圖2· A.與未處理的心臟(假對照)相比，miR-378在胸主動脈環(huán)束術(shù)(thoracicaortic banding, TAB)后在心臟中下調(diào)，如通過定量實時PCR顯示的。B. miR-378的心肌過表達在TAB后誘導(dǎo)加重的肥大應(yīng)答。圖3.骨骼肌中miR-378的過表達導(dǎo)致增加的體重和附睪脂肪質(zhì)量。頂部小圖顯示對來自野生型(WT)小鼠和在MCK啟動子控制下過表達miR-378的小鼠(MCK_miR-378Tg)的白色脂肪組織的組織學(xué)分析。突變體動物展現(xiàn)出肥大脂肪細胞。下部小圖顯示了與野生型小鼠相比，MCK-miR-378轉(zhuǎn)基因小鼠中增加的體重和增加的白色脂肪質(zhì)量。圖4. 3T3-L1細胞中miR-378的過表達增強脂肪生成和脂質(zhì)生成。將3T3-L1細胞誘導(dǎo)4天以分化成成熟的脂肪細胞。miR-378的轉(zhuǎn)染提高細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累，如通過油紅O染色證明的。圖5. MCK-miR-378轉(zhuǎn)基因小鼠展現(xiàn)出降低的葡萄糖耐量。在禁食16小時后給在肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子控制下表達miR-378的小鼠(Tg)或野生型同窩出生仔(wt)1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的時間點時評估血糖水平。圖6.在MCK-miR-378轉(zhuǎn)基因小鼠中注射antimiR-378改善葡萄糖清除。連續(xù)三天給在肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子控制下表達miR-378的小鼠(Tg)1. V.注射10mg/kg具有與miR-378成熟序列互補的序列的反義寡核苷酸(antmiR)。給野生型(wt)小鼠注射鹽水。隨后，在禁食16小時后給Tg和wt小鼠兩者1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的時間點時評估血糖水平(左側(cè)小圖)。對注射antimiR-378或鹽水的Tg和wt小鼠中miR-378表達的實時PCR分析(右側(cè)小圖)。
`
圖7. ob/ob小鼠中注射antimiR-378改善葡萄糖清除。連續(xù)三天給肥胖小鼠(ob/ob)1. V.注射10mg/kg具有與miR-378成熟序列互補的序列的反義寡核苷酸(antmiR)。在禁食16小時后,給未處理的和經(jīng)antimiR處理的ob/ob小鼠1. p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的時間點時評估血糖水平。圖8. A. miR-378靶向策略。將靶向構(gòu)建體導(dǎo)入基因組miR-378基因座中，產(chǎn)生同源重組。B.對野生型(WT)和靶定的ES細胞(MUT)的Southern印跡分析。C.使用來自野生型(+/+)、雜合子(+/_)、和敲除(-/_)小鼠的總RNA實施的Northern印跡分析顯示miR-378表達(箭頭)在生成的突變體小鼠系中得到消除。H :心臟，BAT :褐色脂肪組織，Sk. M :骨骼肌。D.對自WT和miR-378敲除(KO)小鼠分離的心臟組織的實時PCR(左側(cè)小圖)和Western印跡分析(右側(cè)小圖)顯示了 miR-378宿主基因PPARGC1 β (PGC-1 β )的表達在miR-378敲除動物中沒有顯著改變。圖9. miR-378敲除動物展現(xiàn)出響應(yīng)胸主動脈環(huán)束術(shù)(TAB)的心臟肥大降低。

圖10.在胸主動脈環(huán)束術(shù)(TAB)后21天對野生型(WT)和miR-378敲除(KO)小鼠實施超聲心動圖顯象以測定分數(shù)縮短(A)、射血分數(shù)(B)、收縮期直徑(systolicdiameter) (C)、和舒張期-收縮期直徑(DD-SD) (D)。圖11.在胸主動脈環(huán)束術(shù)(TAB)后野生型(WT)和miR-378敲除(KO)小鼠的心臟組織中應(yīng)激誘導(dǎo)的基因BNP (A)、Myh7 (B)、和Myh6 (C)的表達，如通過實時PCR評估的。
圖12.將肥胖小鼠(ob/ob)與miR-378敲除動物雜交以獲得缺乏miR-378表達的肥胖小鼠(ob/ob K0)。在禁食16小時后，給肥胖小鼠和ob/ob KO小鼠1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的時間點時評估血糖水平。圖13. A. MiR-378敲除(KO)小鼠在進行高脂肪飲食幾周后比野生型(WT)動物展現(xiàn)出更小的體重增加。B.在進行高脂肪飲食5周后，在禁食16小時后，給miR-378敲除和野生型小鼠兩者1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的時間點時評估血糖水平。圖14. MiR-378敲除(KO)小鼠在進行高脂肪飲食6周后比野生型(WT)動物具有降低的脂肪墊和肝脂質(zhì)積累。WAT :白色脂肪組織。圖15.與野生型(WT)動物相比，MiR-378敲除(KO)小鼠在進行高脂肪飲食6周后具有降低的脂肪質(zhì)量。BAT :褐色脂肪組織；WAT :白色脂肪組織。圖16.在高脂肪飲食方案6周后對來自野生型(WT)小鼠和miR-378敲除(KO)小鼠的白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)、和肝的組織學(xué)分析。放大率40X。圖17.在α -肌球蛋白重鏈啟動子控制下在心臟組織中過表達miR-378/miR_378*的小鼠(α-MHC TG)具有增加的體重(A)，而且進行高脂肪飲食，與野生型(WT)同窩出生仔相比展現(xiàn)出更大的體重增加(B和C)。圖18. A.在禁食后6小時對自野生型(WT)和miR-378敲除(KO)分離的褐色脂肪組織的Western印跡分析。用對AMPK和AKT的磷酸化的和非磷酸化的形式特異性的抗體探查印跡。使用a-微管蛋白作為對照。B.示意圖顯示調(diào)節(jié)通過AMPK和AKT信號傳導(dǎo)途徑的代謝。 圖19. A.MED133’ UTR的示意圖，其描繪了 miR-378/miR_378*的推定結(jié)合位點。B.野生型(WT)、在a MHC啟動子控制下過表達miR-378的miR-378轉(zhuǎn)基因者(a MHC Tg)、和miR-378敲除(KO)動物中MED13的表達水平。C.與miR-378和對照miRNA的表達質(zhì)粒一起用MED133’UTR螢光素酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染COSl細胞。顯示的數(shù)值是與單獨的報告物相比螢光素酶表達的倍數(shù)變化(土SEM)。發(fā)明詳述對心臟的長期和短期應(yīng)激導(dǎo)致病理學(xué)重塑應(yīng)答，其伴有肥大、纖維化、肌細胞凋亡及最后由泵衰竭和心律失常所致的死亡。雖然經(jīng)典的藥理學(xué)治療策略(例如，β_阻斷劑和ACE抑制劑)可以延長心力衰竭患者的存活，但是這些療法最終在防止疾病進展中是無效的，從而強調(diào)對新的機械論識別力(mechanistic insights)和治療方法的需要。心力衰竭是一種進行性的長期疾病，其影響著估計570萬美國人，伴隨著增加的相關(guān)健康護理成本(Lloyd-Jones 等(2009) Circulation,第 119 卷21-181)。最近,miRNA已經(jīng)作為心臟中肥大和重塑中的重要分子組分出現(xiàn)，如此代表心臟病的預(yù)防和治療中有希望的靶物。因為單個miRNA經(jīng)常調(diào)節(jié)具有相關(guān)功能的多種靶基因的表達，所以調(diào)控單一miRNA的表達原則上可以影響整個基因網(wǎng)絡(luò)，由此修飾復(fù)雜的疾病表型。本發(fā)明部分基于miRNA的發(fā)現(xiàn)，所述miRNA在心臟、骨骼肌、和褐色脂肪的富含線粒體的組織中高度表達，并且在各種心臟疾病狀況中受到調(diào)節(jié)。特別地，令人驚訝地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 miR-378及其對應(yīng)物次要序列(minor sequence)miR-378*是全局代謝的調(diào)節(jié)物。miR-378在應(yīng)激誘導(dǎo)的心臟肥大應(yīng)答中經(jīng)由調(diào)節(jié)心臟代謝而發(fā)揮作用，并且牽涉骨骼肌中的葡萄糖利用和脂肪酸代謝。因而，本發(fā)明提供了一種在受試者中預(yù)防或治療各種心臟和代謝病癥的方法，其通過抑制受試者細胞中miR-378和/或miR-378*的表達或活性來進行。如本文中所使用的，術(shù)語“受試者”或“患者”指任何脊椎動物，包括但不限于人和其它靈長類(例如，黑猩猩和其它猿和猴物種)、家畜(例如，牛、綿羊、豬、山羊和馬)、家養(yǎng)哺乳動物(例如，犬和貓)、實驗室動物(例如，嚙齒類諸如小鼠、大鼠和豚鼠)、和禽類(例如，家養(yǎng)的、野生的和獵禽諸如雞、火雞及其它家禽、鴨、鵝等)。在一些實施方案中，受試者是哺乳動物。在其它實施方案中，受:試者是人。miR-378在鼠染色體18上在過氧化物酶體增殖子激活受體Y共活化物l-β (PPARGCie)基因的第一內(nèi)含子內(nèi)編碼。在人中，miR-378 (先前稱作miR-422b)自染色體5上PPARGC1 β基因的第一內(nèi)含子表達。miR-378的pre_miRNA序列加工成成熟的序列和星號(即，次要)序列。星號序列自莖環(huán)結(jié)構(gòu)的另一條臂加工而來。下文給出了小鼠和人miR-378的pre-miRNA(例如莖環(huán)序列)、成熟序列、和星號序列人成熟miR-378 (SEQ ID NO:1)5， -ACUGGACUUG GAGUCAGAAG G-3，人miR-378*(SEQ ID NO:2)5， -CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU-3，人pre-miR-378(SEQID NO:3)5’ -AGGGCUCCUG ACUCCAGGUC CUGUGUGUUA CCUAGAAAUAGCACUGGACU UGGAGUCAGAAGGCCUI’小鼠 成熟miR-378 (SEQ ID NO: 4)5， -ACUGGACUUG GAGUCAGAAG G_3，小鼠miR-378* (SEQ ID NO: 5)5， -CUCCUGACUC CAGGUCCUGU ⑶-3’小鼠pre-miR-378 (SEQ ID NO: 6)5， -AGGGCUCCUG ACUCCAGGUC CUGUGUGUUA CCUCGAAAUAGCACUGGACU UGGAGUCAGAAGGCCUI’應(yīng)當(dāng)理解，可以通過用胸苷堿基替換序列中的尿苷堿基來將本文中所公開的所有核糖核酸序列轉(zhuǎn)換為脫氧核糖核酸序列。同樣地，可以通過用尿苷堿基替換序列中的胸苷堿基來將本文中所公開的所有脫氧核糖核酸序列轉(zhuǎn)換為核糖核酸序列。本發(fā)明中包括本文中公開的所有序列的脫氧核糖核酸序列、核糖核酸序列、和含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸混合物的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在有此需要的受試者中治療或預(yù)防病理性心臟肥大、心臟重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括對受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑。在一些實施方案中，miR-378和/或miR-378*的表達或活性在施用抑制劑后在受試者的心肌細胞中降低。如本文中所使用的，“心臟細胞”包括心肌細胞、心臟成纖維細胞、和心臟內(nèi)皮細胞。在一個具體的實施方案中，miR-378和/或miR-378*的表達或活性在施用miR-378和/或miR-378*抑制劑后在受試者的心肌細胞中降低。在另一個實施方案中，有此需要的受試者可能有形成病理性心臟肥大、心臟重塑、心力衰竭、或心肌梗死的風(fēng)險。此類受試者可能展現(xiàn)出一種或多種風(fēng)險因素，包括但不限于長期不受控制的高血壓、肺動脈高血壓、未矯正的瓣膜疾病、慢性咽峽炎、新近的心肌梗死、心臟病或病理性肥大的先天性素因。有風(fēng)險的受試者可能診斷為具有心臟肥大的遺傳素因或者可能具有心臟肥大的家族史。在一些實施方案中，有風(fēng)險的受試者可能診斷為肥胖癥、II型糖尿病、高脂血癥(hyperlipidemia)、或代謝綜合征。優(yōu)選地，對受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑導(dǎo)致受試者中心臟肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一種或多種癥狀的改善，或者自心臟肥大至心力衰竭的轉(zhuǎn)變的延遲。一種或多種改善的癥狀可以是例如增加的運動能力、增加的心臟射血體積、降低的左心室舒張期末壓、降低的肺毛細血管楔壓、增加的心排血量、增加的心指數(shù)、降低的肺動脈壓、降低的左心室收縮期和舒張期末內(nèi)徑、降低的心臟纖維化、心肌中降低的膠原沉積、降低的左和右心室壁應(yīng)力、降低的壁張力、升高的生命質(zhì)量、和降低的疾病相關(guān)發(fā)病率或死亡率。本發(fā)明還包括在有此需要的受試者中治療或預(yù)防代謝病癥的方法。在一個實施方案中，所述方法包括對受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑，其中miR-378和/或miR-378*的表達或活性在施用后在受試者的細胞中降低。可以用本發(fā)明的方法治療的代謝病癥包括但不限于代謝綜合征、肥胖癥、糖尿病、糖尿病性腎病、胰島素抗性、動脈粥樣硬化、脂質(zhì)忙積病癥(例如，尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、高歇氏病(Gaucher’sdisease)、法勃氏病(Farber disease)、法布里病(Fabry disease)、沃爾曼病(Wolmandisease)、和膽固醇酯忙積病(cholesteryl ester storage disease))、多囊卵巢綜合征(PCOS)、或異常葡萄糖攝取和/或利用。在一個實施方案中，代謝病癥是糖原貯積病(GSD)。例如，本發(fā)明的方法提供了在有此需要的受試者中治療或預(yù)防任何類型的GSD(例如，GSDO型和GSD I型至GSD XIII型)，其通過對受試者施用miR-378和/或miR-378*抑制劑來進行。GSD包括但不限于馮吉爾克氏病(vonGierke’s disease)、蓬佩病(Pompe’s disease)、柯里氏病(Cori ’ s disease)或福貝斯氏病(Forbes’ disease)、安德森病(Andersendisease)、麥卡德爾病(McArdle disease)、赫斯氏病(Hers’disease)、塔里氏病(Tarui’sdisease)、Fanconi_Bickel綜合征、和紅細胞醒縮酶缺乏。在另一個實施方案中，代謝病癥是中鏈?；o酶A脫氫酶(MCAD)缺乏?；加蠱CAD缺乏的個體展現(xiàn)出可以致命的脂肪酸氧化損傷。在本發(fā)明的一個實施方案中，脂肪酸代謝在施用miR-378和/或miR-378*抑制劑后在患有MCAD缺乏的受試者中升聞。
本發(fā)明還包括預(yù)防或治療源自代謝病癥的繼發(fā)性疾病或狀況，諸如糖尿病和肥胖癥的方法，其通過對有此需要的受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑來進行。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療睡眠呼吸暫停的方法，包括對有此需要的受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療癌癥的方法，其通過對有此需要的受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑來進行。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療骨性關(guān)節(jié)炎的方法，其通過對有此需要的受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑來進行。在另一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋在有此需要的受試者中增加葡萄糖攝取和/或利用的方法，包括對受試者施用miR-378和/或miR-378*活性或表達的抑制劑。在一些實施方案中，所述受試者診斷為胰島素抗性或糖尿病。在一個實施方案中，與在施用抑制劑前受試者的血糖水平相比，受試者的血糖水平在施用miR-378和/或miR-378*抑制劑后降低。在另一個實施方案中，受試者的血糖水平在施用miR-378和/或miR-378*抑制劑后降低至正常水平內(nèi)，如通過口服葡萄糖耐量測定測量的。例如，在某些實施方案中，受試者的禁食血糖水平小于約110mg/dl。在其它實施方案中，葡萄糖攝入后2小時的受試者血糖水平小于約140mg/dl。本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)細胞中脂肪酸代謝的方法。在一個實施方案中，所述方法包括使細胞與miR-378和/或miR-378*表達或活性的調(diào)控劑接觸。如本文中所使用的，“調(diào)控劑”是一種調(diào)節(jié)miR-378和/或miR-378*的表達或活性的分子。調(diào)控劑可以是miR-378和/或miR-378*功能的激動劑(即，增強miR-378或miR-378*的活性或表達)或者它們可以是miR-378和/或miR-378*功能的抑制劑(即，降低miR-378或miR-378*的活性或表達)。調(diào)控劑可以包括蛋白質(zhì)、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸、或小分子。miR-378和/或miR-378*表達或活性的調(diào)控劑包括miR-378和/或miR-378*抑制劑和激動劑，如本文中所描述的。在某些實施方案中，調(diào)控劑是miR-378和/或miR-378*表達或活性的抑制劑，并且與未暴露于該抑制劑的細胞相比，脂肪酸代謝在與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸后的細胞中升高。在其它實施方案中，調(diào)控劑是miR-378和/或miR-378*表達或活性的激動劑，并且與未暴露于該激動劑的細胞相比，脂肪酸代謝在與miR-378和/或miR-378*激動劑接觸后的細胞中降低。細胞可以是體外或體內(nèi)的。在一些實施方案中，細胞是但不限于心肌細胞、骨骼肌細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、或胰細胞。在一個具體的實施方案中，細胞是心肌細胞。如此，本發(fā)明還涵蓋調(diào)節(jié)心臟代謝的方法，其通過使心肌細胞與miR-378和/或miR-378*表達或活性的調(diào)控劑接觸來進行。在一個實施方案中，使心肌細胞與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸防止或降低由應(yīng)激物誘導(dǎo)的自氧化代謝至糖酵解代謝的代謝轉(zhuǎn)變。在另一個實施方案中，使心肌細胞與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸降低心肌細胞中的碳水化合物代謝。在又一個實施方案中，使心肌細胞與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸提高心肌細胞中的脂肪酸代謝。心肌細胞可以是體外或體內(nèi)的。在另一方面，本發(fā) 明涵蓋調(diào)節(jié)細胞中線粒體功能障礙的方法，其通過使細胞與miR-378和/或miR-378*表達或活性的調(diào)控劑接觸來進行。在一個實施方案中，與未處理的細胞相比，使細胞與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸提高細胞中的線粒體生物發(fā)生。在另一個實施方案中，與未處理的細胞相比，使細胞與miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸增強細胞中的線粒體脂肪酸氧化。在又一個實施方案中，與未處理的細胞相比，使細胞與miR-378和/或miR-378*激動劑接觸增強細胞中的脂肪生成。在又一個實施方案中，與未處理的細胞相比，使細胞與miR-378和/或miR-378*激動劑接觸增強細胞中的葡萄糖代謝。細胞可以是體外或體內(nèi)的。在某些實施方案中，細胞是但不限于心肌細胞、骨骼肌細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞、肝細胞、或胰細胞。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療與糖酵解或脂肪酸代謝缺乏有關(guān)的病癥或疾病的方法。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在有此需要的受試者中預(yù)防或治療低血糖癥或高胰島素血癥的方法，其通過對受試者施用miR-378和/或miR-378*激動劑來進行。有風(fēng)險形成低血糖癥或高胰島素血癥的受試者包括過度服用胰島素或某些糖尿病藥物(例如，氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、醋酸己脲(acetohexamide)、格列卩比嗪(glipizide)、或甲苯磺丁脲(tolbutamide))的糖尿病患者、患有胰島素分泌型腫瘤(胰島素瘤)的受試者、診斷為患有引起高胰島素血癥的肝病或遺傳狀況的患者?？捎胢iR-378和/或miR-378*的激動劑治療或預(yù)防的其它病癥或狀況是那些如下的，其中患者具有維持正常體重的困難或者經(jīng)歷無意的重量減輕。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包括在有此需要的受試者中治療或預(yù)防甲狀腺功能允進(hyperthyroidism)(格雷夫斯氏病(GravesOisease))的方法，其通過對受試者施用miR-378和/或miR-378*激動劑來進行。在一些實施方案中，miR-378和/或miR-378*的抑制劑是反義寡核苷酸。反義寡核苷酸可以包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其組合。優(yōu)選地，反義寡核苷酸具有至少一處化學(xué)修飾(例如，糖或主鏈修飾)。例如，合適的反義寡核苷酸可以由一個或多個“構(gòu)象約束性”或二環(huán)糖核苷修飾(BSN)構(gòu)成，所述修飾對含有BSN的寡核苷酸與其互補微小RNA靶標鏈間形成的復(fù)合物賦予增強的熱穩(wěn)定性。例如，在一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個“鎖定核酸”。鎖定核酸(LNA)含有2’-0，4’-C-亞甲基核糖核苷(結(jié)構(gòu)A)，其中核糖糖模塊為“鎖定”構(gòu)象。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個2’，4’ -C-橋接的2’脫氧核糖核苷(CDNA,結(jié)構(gòu)B)。參見例如美國專利No. 6，403，566和Wang等(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,第 9 卷1147-1150,通過提及而將這兩篇都完整收入本文。在又一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個經(jīng)修飾的核苷，其具有結(jié)構(gòu)C中所顯示的結(jié)構(gòu)。靶向miR-378的反義寡核苷酸可以含有BSN(LNA、⑶NA等)或
其它經(jīng)修飾的核苷酸和核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的組合。
權(quán)利要求
1.一種在有此需要的受試者中治療或預(yù)防病理性心臟肥大、心臟重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括對所述受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中miR-378和/或miR-378*的表達或活性在施用所述抑制劑后在所述受試者的心臟細胞中降低。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制劑是反義寡核苷酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述反義寡核苷酸包含與miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互補的序列。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包含與SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2至少部分互補的序列。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包含至少一處糖和/或主鏈修飾。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述糖修飾是鎖定核酸。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述主鏈修飾是硫代磷酸酯連接。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度是約7至約18個核苷酸。
10.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸具有選自下組的序列SEQID NO: 7,SEQID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21JPSEQ ID NO:22。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是人。
12.權(quán)利要求1的方法，其中通過皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用路徑或者通過直接注射入心臟組織中來對所述受試者施用所述抑制劑。
13.一種在有此需要的受試者中治療或預(yù)防代謝病癥的方法，包括對所述受試者施用miR-378和/或miR-378*的抑制劑，其中miR-378和/或miR-378*的表達或活性在施用后在所述受試者的細胞中降低。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述代謝病癥是代謝綜合征、肥胖癥、糖尿病、糖尿病性腎病、胰島素抗性、動脈粥樣硬化、脂質(zhì)貯積病癥、糖原貯積病、中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏、或異常葡萄糖攝取和/或利用。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述脂質(zhì)貯積病癥選自下組尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、高歇氏病(Gaucher，s disease)、法勃氏病(Farber disease)、法布里病(Fabry disease)、沃爾曼病(Wolman disease)、和膽固醇酯忙積病。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制劑是反義寡核苷酸。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述反義寡核苷酸包含與miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互補的序列。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述反義寡核苷酸包含與SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2至少部分互補的序列。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述反義寡核苷酸包含至少一處糖和/或主鏈修飾。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述糖修飾是鎖定核酸。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述主鏈修飾是硫代磷酸酯連接。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度是約7至約18個核苷酸。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述反義寡核苷酸具有選自下組的序列SEQID N0:7、SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和 SEQ ID NO:22。
24.權(quán)利要求13的方法，其中所述受試者是人。
25.權(quán)利要求13的方法，其中通過皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用路徑來對所述受試者施用所述抑制劑。
26.—種調(diào)節(jié)細胞中脂肪酸代謝的方法，包括使所述細胞與miR-378和/或miR-378*表達或活性的調(diào)控劑接觸。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述調(diào)控劑是miR-378和/或miR-378*表達或活性的抑制劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中與未暴露于所述抑制劑的細胞相比，在與所述miR-378和/或miR-378*抑制劑接觸后的細胞中的脂肪酸代謝升高。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制劑是反義寡核苷酸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述反義寡核苷酸包含與miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互補的序列。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述反義寡核苷酸包含至少一處糖和/或主鏈修飾。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述糖修飾是鎖定核酸。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述主鏈修飾是硫代磷酸酯連接。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度是約7至約18個核苷酸。
35.權(quán)利要求26的方法，其中所述調(diào)控劑是miR-378和/或miR-378*表達或活性的激動劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中與未暴露于所述激動劑的細胞相比，在與所述miR-378和/或miR-378*激動劑接觸后的細胞中的脂肪酸代謝降低。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述激動劑是包含miR-378和/或miR-378*的成熟序列的多核苷酸。
38.權(quán)利要求26的方法，其中所述細胞是心肌細胞、骨骼肌細胞、前脂肪細胞、或脂肪細胞。
39.權(quán)利要求26的方法，其中所述細胞是體外或體內(nèi)的。
40.一種藥物組合物，其包含miR-378和/或miR-378*的抑制劑和藥學(xué)可接受載體。
41.權(quán)利要求40的組合物，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制劑是反義寡核苷酸。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述反義寡核苷酸包含與miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互補的序列。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中所述反義寡核苷酸包含與SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2至少部分互補的序列。
44.權(quán)利要求42的組合物，其中所述反義寡核苷酸包含至少一處糖和/或主鏈修飾。
45.權(quán)利要求44的組合物，其中所述糖修飾是鎖定核酸。
46.權(quán)利要求44的組合物，其中所述主鏈修飾是硫代磷酸酯連接。
47.權(quán)利要求42的組合物，其中所述反義寡核苷酸的長度是約7至約18個核苷酸。
48.權(quán)利要求42的組合物，其中所述反義寡核苷酸具有選自下組的序列SEQID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID N0:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和 SEQ ID NO:22。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)細胞中脂肪酸代謝的方法，其通過使細胞與miR-378和/或miR-378*活性或表達的調(diào)控劑接觸來進行。本發(fā)明還提供了一種在受試者中治療或預(yù)防代謝病癥，諸如肥胖癥、糖尿病、或代謝綜合征的方法，其通過對受試者施用miR-378和/或miR-378*表達或活性的抑制劑來進行。還公開了在受試者中治療或預(yù)防病理性心臟肥大、心臟重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，其通過抑制受試者中miR-378和/或miR-378*的表達或活性來進行。
文檔編號C12N15/113GK103038349SQ201180038263
公開日2013年4月10日 申請日期2011年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者E.N.奧爾森, M.卡雷爾 申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會