專利名稱：：用于核酸等溫擴增的改進方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及等溫核酸擴增領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：近年來，用于核酸擴增和檢測擴增產(chǎn)物的方法的發(fā)展已經(jīng)推進了核酸序列的檢測、鑒定、定量和序列分析。核酸分析可用于檢測和鑒定病原體、檢測導(dǎo)致確定的表型的基因改變、診斷遺傳性疾病或?qū)膊〉囊赘行浴⒃u估在發(fā)育和疾病中的基因表達和對確定的刺激作出響應(yīng)的基因表達、以及各種基因組項目。核酸擴增方法的其它應(yīng)用為檢測稀少的細(xì)胞、檢測病原體和檢測惡性腫瘤中改變的基因表達等。核酸擴增有可能可用于定性分析例如檢測確定的核酸序列的存在，以及確定的基因序列的定量。后者可用于評估致病序列和確定致病序列的量以及確定基因重復(fù)或缺失，這些在正常細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化成惡性細(xì)胞類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化中是常見的。檢測核酸序列中的序列改變對于檢測突變基因型來說是重要的，所述突變基因型與遺傳分析、對導(dǎo)致耐藥性的突變的檢測、藥物基因組學(xué)等是有關(guān)的。用于檢測特異性突變的各種方法包括等位基因特異性引物延伸、等位基因特異性探針連接和差異探針雜交。盡管通過探針雜交可以檢測確定的核酸序列的存在以及進行序列分析，但是當(dāng)在測試樣品中存在少量核酸序列例如幾個分子時，該方法通常缺乏靈敏度。這個問題的一種解決方案是開發(fā)用于產(chǎn)生確定的核酸序列的多拷貝的方法，該多拷貝適合于進一步分析。用于產(chǎn)生特定核酸序列的多拷貝的方法通常被定義為祀擴增方法(targetamplificationmethod)。存在核酸擴增的多種變體，例如指數(shù)擴增、連鎖的線性擴增、基于連接的擴增和基于轉(zhuǎn)錄的擴增。指數(shù)核酸擴增方法的實例是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其已被公開于眾多出版物中(參見，例如，Mullis等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51:263-273(1986);MullisK.EP-B2201184;Mullis等，US4,582，788)?；谶B接的擴增的實例是Wu等在Genomics4:560(1989)中公開的連接擴增反應(yīng)(LAR)和公開在EP-B10320308中的連接酶鏈反應(yīng)。公開了多種基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法。最常用的靶擴增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其基于變性、兩個各自針對靶鏈的相反鏈的寡核苷酸引物的雜交、和由核苷酸聚合酶進行的引物延伸的多個循環(huán)，以產(chǎn)生靶序列的多重雙鏈拷貝。已經(jīng)描述了PCR的許多變體，并且所述方法正用于擴增DNA或RNA核酸序列、測序、突變分析等。還已經(jīng)描述了采用單個引物的基于熱循環(huán)的方法。其它依賴于熱循環(huán)的方法為連接酶鏈反應(yīng)(LCR)和有關(guān)的修復(fù)鏈反應(yīng)(RCR)。在基于熱循環(huán)的方法中，通過在多個溫度下孵育的多個循環(huán)來進行靶核酸擴增。盡管這些方法被廣泛使用，但是使用熱循環(huán)過程的擴增方法具有延隔時間長的缺點，延隔時間是熱循環(huán)模塊達到每個循環(huán)的“靶”溫度所需要的時間。因此，使用熱循環(huán)過程進行的擴增反應(yīng)需要大量時間來完成。等溫靶擴增方法不需要熱循環(huán)儀，并且因此更容易適應(yīng)常見的儀器平臺。然而，等溫靶擴增方法具有幾個缺點。等溫靶擴增方法易于出錯。除了擴增靶區(qū)域外，由于引物錯配而出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物。為了避免產(chǎn)生這些副產(chǎn)物，將反應(yīng)組分分開加熱并在在更高溫度下進行混合，例如將包含引物、探針和靶DNA的混合物與包含緩沖液、聚合酶、dNTP和解旋酶的另一混合物分開加熱至反應(yīng)溫度。這樣的方法費時費力并且復(fù)雜。因此，需要克服這些缺點的改進的核酸擴增方法。在此提供的本發(fā)明滿足這種需求并提供了另外的益處。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于核酸擴增的方法，所述方法包括以下步驟i)至少提供以下反應(yīng)組分a)用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶；b)一個或多個用于擴增靶核酸的引物；c)dNTP和/或NTP;d)至少一種用于在等溫條件下擴增核酸的酶的必要輔助因子和/或試劑；e)靶核酸；其中將反應(yīng)組分a)至e)中的至少一種包埋在基質(zhì)中，其中所述基質(zhì)在預(yù)定條件下崩解；ii)在導(dǎo)致所述基質(zhì)崩解的條件下孵育反應(yīng)組分，以便獲得反應(yīng)混合物；iii)在適用于等溫擴增反應(yīng)的條件下孵育反應(yīng)混合物。本發(fā)明還涉及用于核酸等溫擴增的試劑盒，所述試劑盒包含-用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶，-在預(yù)定條件下崩解的基質(zhì)；其中至少一種對于核酸等溫擴增必要的組分被包埋在所述基質(zhì)中。本發(fā)明還涉及組合物，其包含-在預(yù)定條件下崩解的基質(zhì)；和-用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶。本發(fā)明還包括包埋用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶的方法，其包括以下步驟i)提供溶解的基質(zhì)；ii)將所述基質(zhì)與包含至少一種用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶的溶液混合以獲得基質(zhì)-酶混合物；iii)在允許基質(zhì)固化的條件下孵育基質(zhì)-酶混合物以獲得包埋的嗜中溫酶。具體實施例方式在此處，“嗜中溫”是指酶的最適溫度為70°C以下。在優(yōu)選的實施方式中，所述至少一種用于擴增核酸的嗜中溫酶的最適溫度為20°C至70°C，優(yōu)選30°C至65°C，更優(yōu)選37°C至60°C。在大部分情況下，嗜中溫酶不是熱穩(wěn)定的，即它們在高溫下孵育后不可逆地失活。在實施方式中，本發(fā)明的嗜中溫酶不是熱穩(wěn)定的。在上下文中，嗜中溫酶在高溫下不可逆失活是指在高于酶的最適溫度的溫度下孵育該酶。在一個實施方式中，在高溫下孵育是指在至少50°C的溫度下、優(yōu)選在至少60°C的溫度下、更優(yōu)選在至少70°C的溫度下孵育?！安豢赡媸Щ睢笔侵敢欢ǔ潭鹊拿富钚詥适?。此外，所述失活并不必然是完全失活，即在高溫下孵育嗜中溫酶后可觀察到70%以下、優(yōu)選40%以下、更優(yōu)選10%以下的剩余酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，嗜中溫酶在高溫下的失活可取決于孵育進行的時間。因此，在優(yōu)選的實施方式中，在高溫下孵育至少30秒、優(yōu)選至少I分鐘、更優(yōu)選至少5分鐘、甚至更優(yōu)選至少15分鐘之后，嗜中溫酶不可逆地失活。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的方法允許確定等溫擴增反應(yīng)的起點。因為該反應(yīng)的必要組分例如酶被包埋在所述基質(zhì)中，因此，它與反應(yīng)緩沖液中的其它反應(yīng)化合物例如模板核酸分開。這允許確定隨著基質(zhì)崩解而開始反應(yīng)的時間點和/或條件。本發(fā)明的基質(zhì)在預(yù)定條件下崩解，即當(dāng)轉(zhuǎn)變成所述條件時，它釋放出包埋的化合物。所述基質(zhì)可以被例如酶崩解、化學(xué)崩解或物理崩解。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述基質(zhì)通過pH的轉(zhuǎn)變而崩解。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，通過PH的變化來改變所述基質(zhì)的靜電荷，導(dǎo)致釋放出包埋的等溫擴增反應(yīng)的必要組分。在優(yōu)選的實施方式中，通過擴散釋放出至少一種包埋在所述基質(zhì)中的反應(yīng)組分。這允許恒定釋放所述至少一種包埋的反應(yīng)組分。此外，通過所述基質(zhì)的酶崩解，可實現(xiàn)所述至少一種包埋的反應(yīng)組分的恒定釋放。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，通過添加選自膠原酶、透明質(zhì)酸酶、瓊脂酶、褐藻酸酶和淀粉酶的酶使所述基質(zhì)崩解。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述基質(zhì)在預(yù)定溫度下崩解。在優(yōu)選的實施方式中，所述基質(zhì)在50°C以上、優(yōu)選60°C以上、更優(yōu)選65°C以上的溫度下崩解。特別優(yōu)選地，所述基質(zhì)崩解的預(yù)定溫度高于至少一個引物、優(yōu)選所有引物的退火溫度即大約Tm。這允許熱啟動等溫擴增反應(yīng)，因為在引物與非靶序列非特異性結(jié)合的溫度下，反應(yīng)沒有開始。由此減少了非特異性擴增產(chǎn)物。退火溫度是寡核苷酸引物和DNA模板在超過該溫度時熔融或解離的溫度。退火溫度可以隨模板和引物之間的序列同源性以及引物與模板的長度和GC含量而變化?？捎嬎?0%引物退火至其模板上時的退火溫度，以及特定反應(yīng)的最適退火溫度，例如如Rychlik等，NucleicAcidsResearch,18:6401-6412,1990中所述的。優(yōu)選的引物的退火溫度在約50°C至75°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選在55°C和65°C之間，更優(yōu)選在55°C和60°C之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適合于本發(fā)明的基質(zhì)。在優(yōu)選的實施方式中，所述基質(zhì)選自多糖、蛋白質(zhì)、蠟和合成聚合物。在更進一步優(yōu)選的實施方式中，所述基質(zhì)選自瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、果膠、直鏈淀粉、瓊脂、黃原膠、卡拉膠、瓜爾膠、卡如賓糖(carubin)、菊粉、葡聚糖、明膠、纖維狀蛋白質(zhì)(例如膠原蛋白)、聚乙烯醇、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素)。在優(yōu)選的實施方式中，所述基質(zhì)是瓊脂糖(包括低熔點瓊脂糖)。具有不同熔點的不同瓊脂糖是可商購的。低熔點瓊脂糖在約高于60°C的溫度下熔融或崩解。高熔點瓊脂糖在約高于90°C的溫度下崩解。表現(xiàn)出的熔點在50°C和95°C之間的其它形式的瓊脂糖是可商購的(例如，德國SigmaAldrichGmbH)。通過改變瓊脂糖的類型和/或特定類型的瓊脂糖的濃度，可實現(xiàn)多種特定的崩解溫度，例如崩解溫度為50°C以上、優(yōu)選60°C以上、更優(yōu)選65°C以上的組合物。為了實現(xiàn)瓊脂糖組合物的希望的崩解溫度，選擇熔點在希望的崩解溫度范圍內(nèi)的瓊脂糖類型。例如，如果希望的崩解溫度為約63°C，則選擇熔點為65°C的低熔點瓊脂糖。在水性溶液例如水或緩沖液中制備多種濃度(例如0.1%至2.5%)的瓊脂糖溶液，在反應(yīng)管中將其加熱至熔融并冷卻至膠凝點。然后重新加熱瓊脂糖反應(yīng)管，并且可確定崩解溫度。以這種方式，可選擇合適的瓊脂糖和它的濃度。這種選擇方法可用于選擇特定的基質(zhì)類型和濃度，以實現(xiàn)所希望的本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，所述基質(zhì)是包含0.1%至4%(w/v)、優(yōu)選0.5%至3%(w/v)、更優(yōu)選1.0%至2%(w/v)瓊脂糖的水凝膠。在所述基質(zhì)崩解后，它優(yōu)選溶解于反應(yīng)介質(zhì)內(nèi)，即溶解于反應(yīng)緩沖液中。在優(yōu)選的實施方式中，所述基質(zhì)形成水凝膠。水凝膠(也稱為水性凝膠)是通過共價鍵和/或離子相互作用互連的水不溶性聚合物鏈的網(wǎng)狀物。所述聚合物包含親水性化合物。因此，在水存在下，該聚合物吸收水，在不失去所述聚合物網(wǎng)狀物的完整性的情況下導(dǎo)致體積膨脹。水凝膠是高吸收性的天然聚合物或合成聚合物，其水含量為50%以上，優(yōu)選70%以上，更優(yōu)選80%以上，甚至更優(yōu)選90%以上。在一個實施方式中，在使用水或緩沖液作為分散介質(zhì)的情況下，所述基質(zhì)在預(yù)定條件下崩解并形成膠態(tài)凝膠。在另外的實施方式中，通過熔融使所述基質(zhì)崩解。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對上述方案進行變化。例如，所述基質(zhì)可由多種材料、聚合物等形成，條件是所述基質(zhì)在預(yù)定條件下崩解并且所述基質(zhì)不干擾等溫擴增反應(yīng)。為了測試基質(zhì)的相容性，使用可能的基質(zhì)材料和/或在不同的基質(zhì)濃度范圍內(nèi)實施本發(fā)明的方法。監(jiān)測該方法的與不含基質(zhì)的對照相比的干擾性。本發(fā)明的方法、試劑盒或組合物中所使用的至少一種酶是嗜中溫酶。然而，其中包埋有至少一種必要化合物的基質(zhì)在相對高的溫度下崩解。嗜中溫酶在高于其最適溫度的溫度下通常不可逆地失活。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明的方法有可能實現(xiàn)熱啟動過程。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，在步驟ii)下的孵育溫度比步驟iii)的孵育溫度高1°C至50°C，優(yōu)選高5°C至25°C，更優(yōu)選高10°C至20°C。然而，在本發(fā)明的另外的實施方式中，本發(fā)明擴增方法的步驟ii)和步驟iii)的溫度是相同的。在本發(fā)明上下文中，“等溫擴增反應(yīng)”是指在反應(yīng)期間溫度沒有顯著變化。在優(yōu)選的實施方式中，等溫擴增反應(yīng)的溫度偏離不超過10°c，優(yōu)選不超過5°C，甚至更優(yōu)選不超過2。。。取決于核酸等溫擴增方法，對于擴增反應(yīng)需要不同的酶。用于核酸擴增的已知的等溫方法例如為解旋酶依賴性擴增(HDA)(Vincent等；“解旋酶依賴性等溫DNA擴增(Helicase-dependentisothermalDNAamplification)，，，EMBOreports5(8)795-800(2004))，熱穩(wěn)定的HDA(tHDA)(An等，“熱穩(wěn)定UvrD解旋酶的表征及其在解旋酶依賴性擴增中的參與(CharacterizationofaThermostableUvrDHelicaseandItsParticipationinHelicase-dependentAmplification)，，，Jour.Biol.Chem.280(32)28952-28958(2005))，鏈置換擴增(SDA)(Walker等，“鏈置換擴增——等溫的體外DNA擴增技術(shù)(Stranddisplacementamplification—anisothermal,invitroDNAamplificationtechnique)”，NucleicAcidsRes.20(7):1691-6(1992)),多重置換擴增(MDA)[Dean等，“使用多重置換擴增進行全面的人基因組擴增(Comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification)，，，PNAS99(8)5261-5266(2002))，滾環(huán)擴增(Liu等，“滾環(huán)DNA合成小的環(huán)形寡核苷酸作為DNA聚合酶的有效模板(RollingcircleDNAsynthesisSmalIcircularoligonucleotidesasefficienttemplatesforDNApolymerases)，，，J.Am.Chem.Soc.118:1587-1594(1996)),單引物等溫擴增(SPIA)[Dafforn等,“從低至5ng的總RNA進行線性mRNA擴增以供總體基因表達分析(LinearmRNAamplificationfromaslittleas5ngtotalRNAforglobalgeneexpressionanalysis)，，，Biotechniques37(5):854-7(2004)),限制性輔助RCA(restrictionaidedRCA)[Wang等,“耐受樣品降解的DNA擴增方法(DNAamplificationmethodtoleranttosampledegradation)，，，GenomeRes.14:2357-2366(2004)],轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)[Vuorinen等，“通過Gen-Probe的擴增結(jié)核分枝桿菌直接試驗和羅氏AmplicorPCR結(jié)核分枝桿菌試驗來直接檢測呼吸道標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(DirectdetectionofMycobacteriumtuberculosiscomplexinrespiratoryspecimensbyGen-ProbeAmplifiedMycobacteriumTuberculosisDirectTestandRocheAmplicorPCRMycobacteriumTuberculosisTest)，，J.Clin.Microbiol.33:1856-1859(1995)]，基于核酸序列的擴增(NASBA)[Kievits等，“NASBA，為診斷HIV-1感染而優(yōu)化的等溫酶體外核酸擴增(NASBA,isothermalenzymaticinvitronucleicacidamplificationoptimizedforthediagnosisofHIV-linfection)，，J.Virol.Methods35:273-286(1991)]和使用切口酶的擴增反應(yīng)切口酶擴增反應(yīng)(NEAR)[Maples等，“用于核酸指數(shù)擴增的切口和延伸擴增反應(yīng)(Nickingandextensionamplificationreactionfortheexponentialamplificationofnucleicacids)，，，US2009017453],使用重組蛋白的擴增反應(yīng)重組酶聚合酶擴增(RPA)[Piepenburg等,“使用重組蛋白的DNA檢測(DNADetectionUsingRecombinationProteins)”，PLoSBiol.4(7)e204(2004)],和環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)[Notomi等，“環(huán)介導(dǎo)的DNA等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA)”，NAR28(12):e63(2000)],其中至少一種用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶選自解旋酶、嗜中溫聚合酶、具有鏈置換活性的嗜中溫聚合酶、切口酶、重組蛋白、連接酶、糖基化酶和核酸酶。“解旋酶”對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。它們是沿著核酸的磷酸二酯骨架方向移動的蛋白質(zhì)，使用源自于NTP或dNTP水解、優(yōu)選ATP或dATP水解的能量將兩條退火的核酸鏈(例如DNA、RNA或RNA-DNA雜交物)分開?；诖嬖诖_定的解旋酶基序，可將解旋酶活性歸因于給定的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的具有解旋酶活性的酶以用于本發(fā)明的方法。在優(yōu)選的實施方式中，所述解旋酶選自來自不同家族的解旋酶(超家族I解旋酶(例如dda、pcrA、F質(zhì)粒tral蛋白質(zhì)解旋酶、uvrD),超家族II解旋酶(例如recQ、NS3解旋酶)，超家族III解旋酶(例如AAVrep解旋酶))、來自類dnaB超家族的解旋酶(例如17噬菌體解旋酶)或來自類rhci超家族的解旋酶。在優(yōu)選的實施方式中，所述嗜中溫聚合酶選自phi29聚合酶、Bst聚合酶、Gst聚合酶、PyroPhage聚合酶、Klenow聚合酶、DisplaceAce聚合酶。例如可以通過去除核酸酶活性或化學(xué)修飾對所有酶進行改性。在本發(fā)明上下文中，“重組蛋白”是對于DNA重組和修復(fù)過程重要的蛋白質(zhì)，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，它們可以選自SSB、T4gp32、recA、單鏈DNA轉(zhuǎn)位酶、雙鏈DNA轉(zhuǎn)位酶、核酸酶、解旋酶、聚合酶、連接酶和它們的來自不同生物體的同源物。在本發(fā)明上下文中，“糖基化酶”是從DNA鏈中去除堿基的酶。在優(yōu)選的實施方式中，糖基化酶是尿嘧啶-N-糖基化酶并且從DNA鏈中去除尿嘧啶。在本發(fā)明上下文中，“切口酶”是在被稱為限制性位點的特定的識別核苷酸序列處水解(剪切)雙鏈核酸中的一條鏈的酶。切口酶僅剪切雙鏈核酸中的一條鏈，并不切割雙鏈。切口酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以例如選自Nb.BbvC1、Nb.Bsm1、Nb.BsrD1、Nb.Bts1、Nt.Alw1、Nt.BbvC1、Nt.BsmA1、Nt.BspQ1、Nt.BstNB1、Nt.CviPII?！版溨脫Q活性”是指酶能夠分開雙鏈核酸的鏈。在優(yōu)選的實施方式中，所述嗜中溫酶是具有鏈置換活性的聚合酶，即該聚合酶能夠置換模板鏈的互補鏈，并且由此允許新鏈的連續(xù)聚合。數(shù)種具有鏈置換活性的聚合酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，具有鏈置換活性的聚合酶選自噬菌體的聚合酶或選自聚合酶Bst聚合酶、Gst聚合酶、PyroPhage聚合酶、Vent聚合酶、Deep-Vent聚合酶、Klenow聚合酶、DisplaceAce聚合酶，所述噬菌體選自phi29、Cp-1、PRD-1、Phi15、Phi21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、SF5、GA-1、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722和17。通過改性(例如通過去除5'-3'核酸外切酶活性)可以提高聚合酶的置換活性。在本發(fā)明上下文中，“連接酶”是能夠?qū)蓚€分開的核酸分子在其糖骨架處共價連接的酶，即它們將第一核酸分子的3’端OH與第二核酸分子的5’端磷酸酯基團共價連接以形成磷酸二酯，并且由此形成連續(xù)的核酸鏈。連接酶可連接單鏈核酸以及雙鏈核酸。此外，連接酶可閉合例如由切口酶產(chǎn)生的雙鏈核酸的單鏈斷裂。連接酶可以選自DNA連接酶和RNA連接酶。合適的連接酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可例如選自T4連接酶、RNA連接酶和熱穩(wěn)定聚合酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本發(fā)明的上下文中，所使用的上述酶中的至少一種是嗜中溫的，即所述方法中使用的其它酶可以是嗜熱的，只要至少一種在所述擴增反應(yīng)中涉及的酶不是嗜熱的即可。例如，嗜熱聚合酶可以與解旋酶一起使用。在這種情況下，該解旋酶是所述至少一種嗜中溫酶。本發(fā)明的方法令人驚訝地非常適合于不同的等溫擴增方法。通過將等溫擴增反應(yīng)的必要組分包埋在基質(zhì)中，本發(fā)明提供了用于擴增核酸的改進方法，其克服了現(xiàn)有技術(shù)方法的上述缺點。本發(fā)明的方法可以適用于所希望的等溫擴增方法。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，用于核酸等溫擴增的方法選自解旋酶依賴性擴增(HDA)、熱穩(wěn)定的HDA(tHDA)、鏈置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)、滾環(huán)擴增、單引物等溫擴增(SPIA)、限制性輔助RCA、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、和使用切口酶的擴增反應(yīng)切口酶擴增反應(yīng)(NEAR)、使用重組蛋白的擴增反應(yīng)重組酶聚合酶擴增(RPA)、反轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的上下文中，特定類型的核酸可以是RNA、DNA、cDNA(互補DNA)、LNA(鎖核酸)、mRNA(信使RNA)、mtRNA(線粒體RNA)、rRNA(核糖體RNA)、tRNA(轉(zhuǎn)運RNA)、nRNA(核RNA)、siRNA(小干擾RNA)、snRNA(核小RNA)、snoRNA(核仁小RNA)、scaRNA(小卡哈爾體特異性RNA(SmallCajalBodyspecificRNA))、microRNA、dsRNA(雙鏈RNA)、核酶、核糖開關(guān)、病毒RNA、dsDNA(雙鏈DNA)、ssDNA(單鏈DNA)、質(zhì)粒DNA、粘粒DNA、染色體DNA、病毒DNA、mtDNA(線粒體DNA)、nDNA(核DNA)、或snDNA(核小DNA)等，或者任何其它類型或子類的核酸，其可與樣品中的主體核酸相區(qū)分。可以使用任何合適的方法來制備寡核苷酸引物，所述方法例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動實施方式。在一個這樣的自動實施方式中，二乙基亞磷酰胺被用作起始材料，并且可以如Beaucage等，TetrahedronLetters,22:1859-1862(1981)所述的進行合成。在美國專利No.4,458,006中描述了一種用于在改性固體載體上合成寡核苷酸的方法。還可以使用從生物來源分離的引物(例如限制性核酸內(nèi)切酶消化)。優(yōu)選的引物的長度為約6至100個堿基，更優(yōu)選約20至50個堿基，最優(yōu)選約20至40個堿基。在本文中使用時，術(shù)語“dNTP”是指脫氧核苷三磷酸。此類dNTP的非限制性實例為dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其還可以以例如包含熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記的標(biāo)記衍生物的形式存在。還包括具有改性核苷酸堿基的dNTP，其中所述核苷酸堿基例如為次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤核苷(xanthin0Sine)、7-甲基鳥苷、5，6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基胞苷。此外，在本發(fā)明中包括上述分子的ddNTP。在本文中使用時，術(shù)語“NTP”是指核苷三磷酸。此類NTP的非限制性實例為ATP、GTP、CTP、TTP、UTP，其還可以以例如包含熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記的標(biāo)記衍生物的形式存在。等溫擴增反應(yīng)的必要輔助因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且取決于使用的酶。它們可以是有機或無機化合物。無機化合物例如可以選自金屬離子Mg、Mn、Ca、Fe、Cu、Ni。有機輔助因子可以選自維生素、蛋白質(zhì)、生物素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、和核苷酸例如ATP。在本發(fā)明的試劑盒內(nèi)，包含所述至少一種必要組分的基質(zhì)可以被提供為不同的形式。例如，它可以被提供為珠粒，或者所述基質(zhì)可以被包含在其中將發(fā)生反應(yīng)的反應(yīng)容器內(nèi)，例如反應(yīng)容器的底部。在本發(fā)明的一個實施方式中，將包含所述至少一種用于等溫擴增的必要組分的基質(zhì)凍干?？梢詫Π竦氖戎袦孛傅幕|(zhì)進行進一步改性，以例如調(diào)節(jié)所述嗜中溫酶的釋放速率。例如，所述基質(zhì)可涂覆有一種或多種另外的基質(zhì)，例如崩解溫度更低的基質(zhì)，從而得到多層基質(zhì)。因此，在一個實施方式中，包含至少一種用于等溫擴增反應(yīng)的必要組分的基質(zhì)涂覆有第二基質(zhì)。在另外的實施方式中，將等溫擴增反應(yīng)的其他必要組分包埋于第二基質(zhì)中。這允許發(fā)生多步驟的等溫擴增反應(yīng)。例如，首先在使第二基質(zhì)崩解的條件下處理包含所述多層基質(zhì)的反應(yīng)混合物，導(dǎo)致釋放出包埋在其中的等溫擴增反應(yīng)的必要組分，例如第一對引物。之后，在允許通過使用第一對引物來擴增靶核酸的條件下處理該反應(yīng)混合物。在適當(dāng)時間之后，可以將所述混合物轉(zhuǎn)移至使第一基質(zhì)崩解并釋放出包埋在其中的必要組分例如第二對引物(巢式引物)的條件下，然后在用于等溫擴增反應(yīng)的條件下進行孵育。由此，本發(fā)明提供了用于順序等溫擴增的方法，而不需要重新打開反應(yīng)容器以添加不同擴增步驟的組分例如巢式引物。然而，可以根據(jù)需要選擇所述包埋在基質(zhì)中的至少一種組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在包埋的等溫擴增反應(yīng)的必要組分方面調(diào)整本發(fā)明。例如，他可以選擇將對室溫不敏感的必要組分包埋于基質(zhì)中。這將允許在室溫下儲存所述基質(zhì)。然而，在優(yōu)選的實施方式中，在基質(zhì)中的必要組分選自所述用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶、dNTP和/或NTP、必要輔助因子和至少一個用于擴增靶核酸的引物。在用于包埋嗜中溫酶的方法的優(yōu)選實施方式中，通過在至少40°C、優(yōu)選至少50°C、更優(yōu)選至少65°C的溫度下孵育使所述基質(zhì)溶解。本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)，可在相對高的溫度例如65°C下使所述基質(zhì)溶解，但是可以在較低的溫度下與所述包含至少一種嗜中溫酶的溶液進行混合，條件是所述基質(zhì)材料不固化。在優(yōu)選的實施方式中，在40°C至70°C之間的溫度下進行所述混合。在適當(dāng)?shù)幕旌现?，所述基質(zhì)和所述包含至少一種嗜中溫酶的溶液將形成均勻的混合物。此后，在所述混合物內(nèi)的基質(zhì)將固化。因此，在允許所述基質(zhì)固化的條件下孵育所述基質(zhì)-酶混合物以獲得包埋的嗜中溫酶。在優(yōu)選的實施方式中，在50°C以下、優(yōu)選40°C以下、更優(yōu)選30°C以下、甚至更優(yōu)選20°C以下的溫度下孵育所述基質(zhì)-酶混合物。在包埋嗜中溫酶之后，可以進一步處理所述基質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述包埋方法還包括將包埋的嗜中溫酶凍干的步驟。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的組合物和/或試劑盒在選自以下的方法中的應(yīng)用等溫核酸擴增、解旋酶依賴性擴增(HDA)、熱穩(wěn)定的HDA(tHDA)、鏈置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)、滾環(huán)擴增、單引物等溫擴增(SPIA)、限制性輔助RCA、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、和切口酶擴增反應(yīng)(NEAR)、以及本發(fā)明的方法。實施例實施例1:通過將引物包埋在基質(zhì)中來減少非特異性產(chǎn)物將包含2.0%低熔點瓊脂糖(德國SigmaAldrichGmbH)的溶液與沙眼衣原體(Clamydiatrachomatis)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoea)的特異性引物和探針(淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoea)特異性引物NGopaDvFl,NGopaDvR;沙眼衣原體(C.trachomatis)特異性引物CT_plF9,CT-plR17;FAM標(biāo)記的沙眼衣原體(C.trachomatis)特異性探針CT_plp6FAM；TEX標(biāo)記的淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoea)特異性探針NGopaDblTEX)混合。隨后將該混合物加熱至65°C以獲得熔融的瓊脂糖/引物/探針混合物。將15Ul熔融的瓊脂糖/引物/探針混合物施加到反應(yīng)容器中并將其冷卻。由此在該容器的底部上形成了包含引物和探針的水凝膠。基質(zhì)的最終瓊脂糖濃度為1.0%。含有上述引物和探針而不含有瓊脂糖的反應(yīng)容器用作參照。表1:引物和探針序列權(quán)利要求1.用于核酸等溫擴增的方法，所述方法包括以下步驟i)至少提供以下反應(yīng)組分a)用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶；b)一個或多個用于擴增靶核酸的引物；c)dNTP和/或NTP；d)用于在等溫條件下擴增核酸的酶的必要輔助因子和/或試劑；e)至少一種祀核酸；其中將反應(yīng)組分a)至e)中的至少一種包埋在基質(zhì)中，其中所述基質(zhì)在60°C以上、優(yōu)選65°C以上的溫度下崩解；ii)在導(dǎo)致所述基質(zhì)崩解的條件下孵育反應(yīng)組分，以便獲得反應(yīng)混合物；iii)在適用于等溫擴增反應(yīng)的條件下孵育反應(yīng)混合物；其中在步驟ii)下的孵育溫度比步驟iii)的孵育溫度高1°C至50°C，優(yōu)選高5°C至25°C，更優(yōu)選高10°C至20°C。2.權(quán)利要求1的方法，其中用于擴增核酸的嗜中溫酶的最適溫度為20°C至70°C，優(yōu)選30°C至65°C，更優(yōu)選37°C至60°C。3.權(quán)利要求1至2的方法，其中基質(zhì)形成水凝膠。4.權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中基質(zhì)選自多糖(瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、果膠、直鏈淀粉、瓊脂、黃原膠、卡拉膠、羧甲基纖維素、瓜爾膠、卡如賓糖、菊粉、葡聚糖)、蛋白質(zhì)(明膠、纖維狀蛋白質(zhì))、蠟和合成聚合物(聚乙烯醇、纖維素衍生物)。5.權(quán)利要求1至4任一項的方法，其中至少一種用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶選自解旋酶、嗜中溫聚合酶、具有鏈置換活性的嗜中溫聚合酶、切□酶、重組蛋白、連接酶、糖基化酶和核酸酶。6.權(quán)利要求1至5任一項的方法，其中用于核酸等溫擴增的方法選自解旋酶依賴性擴增(HDA)、熱穩(wěn)定的HDA(tHDA)、鏈置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)、滾環(huán)擴增、單引物等溫擴增(SPIA)、限制性輔助RCA、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、和使用切口酶的擴增反應(yīng)切口酶擴增反應(yīng)(NEAR)、使用重組蛋白的擴增反應(yīng)重組酶聚合酶擴增(RPA)。7.用于核酸等溫擴增的試劑盒，所述試劑盒包含-用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶，-在預(yù)定條件下崩解的基質(zhì)；其中至少一種對于核酸等溫擴增必要的組分被包埋在所述基質(zhì)中。8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中被包埋在所述基質(zhì)中的組分選自所述用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶、dNTP和/或NTP、必要輔助因子、和一個或多個用于擴增靶核酸的引物。9.權(quán)利要求7或8的試劑盒，其中用于擴增核酸的嗜中溫酶選自解旋酶、嗜中溫聚合酶、具有鏈置換活性的嗜中溫聚合酶、切口酶、重組蛋白、連接酶、核酸酶和糖基化酶。10.組合物，其包含-在預(yù)定條件下崩解的基質(zhì)；和-至少一種用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶。11.權(quán)利要求10的組合物，其中基質(zhì)在至少40°C、優(yōu)選至少50°C、更優(yōu)選至少65°C的溫度下崩解。12.權(quán)利要求10或11的組合物，其中基質(zhì)選自多糖(瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、果膠、直鏈淀粉、瓊脂、黃原膠、卡拉膠、羧甲基纖維素、瓜爾膠、卡如賓糖、菊粉、葡聚糖)、蛋白質(zhì)(明膠、纖維狀蛋白質(zhì))和合成聚合物(聚乙烯醇、纖維素衍生物)。13.權(quán)利要求10至12任一項的組合物，其中用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶選自解旋酶、嗜中溫聚合酶、具有鏈置換活性的嗜中溫聚合酶、切口酶、重組蛋白、連接酶、核酸酶和糖基化酶。14.包埋用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶的方法，其包括以下步驟i)提供溶解的基質(zhì)；ii)將所述基質(zhì)與包含用于在等溫條件下擴增核酸的嗜中溫酶的溶液混合以獲得基質(zhì)-酶混合物；iii)在允許基質(zhì)固化的條件下孵育基質(zhì)-酶混合物以獲得包埋的嗜中溫酶。15.權(quán)利要求14的方法，其還包括將包埋的嗜中溫酶凍干的步驟。16.權(quán)利要求10至13任一項的組合物和/或權(quán)利要求7至9任一項的試劑盒在選自以下的方法中的應(yīng)用等溫核酸擴增、解旋酶依賴性擴增(HDA)、熱穩(wěn)定的HDA(tHDA)、鏈置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)、滾環(huán)擴增、單引物等溫擴增(SPIA)、限制性輔助RCA、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、和切口酶擴增反應(yīng)(NEAR)、以及權(quán)利要求1至6中任一項的方法。全文摘要本發(fā)明公開了用于改進的核酸等溫擴增的方法，所述方法包括在預(yù)定條件下從基質(zhì)釋放出必要組分的步驟。此外，本發(fā)明涉及試劑盒，所述試劑盒包含嗜中溫酶和包埋有用于等溫擴增的必要組分的基質(zhì)。本發(fā)明還公開了包含基質(zhì)和嗜中溫酶的組合物，和用于包埋嗜中溫酶的方法。文檔編號C12Q1/68GK103025892SQ201180035890公開日2013年4月3日申請日期2011年8月9日優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日發(fā)明者克里斯蒂安·科哈格申請人:凱杰有限公司