專利名稱：具有因子vii活性的融合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有因子VII (FVII)活性的融合蛋白質(zhì)；以及，更特別地，涉及包含F(xiàn)VII和轉(zhuǎn)鐵蛋白并且與未融合天然型FVII相比具有0.7或更高的FVII比活性(specificactivity)的融合蛋白質(zhì)、為其編碼的DNA、包含所述DNA的重組載體、以及包含所述重組載體的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
多種出血性疾病由缺乏凝血因子引發(fā)。最常見(jiàn)的疾病是分別由凝血因子VIII和IX缺乏或異常引發(fā)的血友病A和B。血友病A是由有缺陷的因子VIII基因的X連鎖隱性特征(X-1inkedrecessivetrait)所引起的遺傳性出血性疾病。血漿源性或重組的因子VIII的濃縮物已被用于治療血友病A。血友病B是由因子IX缺乏或功能不良而引起的，通過(guò)使用血漿源性或重組的因子IX的濃縮物對(duì)其進(jìn)行治療。但是，出現(xiàn)針對(duì)替代因子(replacement factor)的同種抗體仍是血友病A和B的治療中嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。在高至30%的血友病A患者中產(chǎn)生針對(duì)因子VIII的抗體。盡管針對(duì)因子IX的抗體產(chǎn)生的較少，但它們對(duì)免疫耐受誘導(dǎo)治療較不敏感,導(dǎo)致更嚴(yán)重的結(jié)果。凝血由血管壁損傷之后暴露于循環(huán)血液的組織因子與激活形式的因子VII(FVIIa)之間形成復(fù)合物而引發(fā)。這樣的復(fù)合物激活因子IX和因子X(jué)，并且所產(chǎn)生的因子X(jué)a產(chǎn)生有限量的凝血酶。 在正反饋環(huán)中，凝血酶激活凝血級(jí)聯(lián)的多種因子(例如，因子VII1、因子V、因子X(jué)I等)，并且所激活的因子構(gòu)成因子X(jué)酶復(fù)合物(factor Xase complex)或前凝血素酶復(fù)合物。這些復(fù)合物還擴(kuò)增其自身的生成并且產(chǎn)生凝血酶。這種被稱為“凝血酶爆發(fā)(thrombin burst) ”的足夠量的凝血酶將出血部位的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，從而實(shí)現(xiàn)完全止血。但是，在具有針對(duì)因子VIII或因子IX的高濃度中和抗體的血友病患者的情況中，因?yàn)椴荒墚a(chǎn)生上述因子X(jué)酶復(fù)合物，所以達(dá)不到足夠的止血。FVIIa已用作主要的治療劑，用于具有針對(duì)因子VIII或因子IX的中和抗體的患者，因?yàn)镕VIIa可激活因子X(jué)(甚至在不存在因子VIII和因子IX時(shí))，從而最終產(chǎn)生足夠量的凝血酶以實(shí)現(xiàn)期望的治療效果。FVII是由406個(gè)氨基酸組成的單鏈糖蛋白，分子量為50kDa，并且作為酶原而被分泌到血流中。FVII由四個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，即，氨基末端-羧基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域、以及絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Hagen FS等，Proc. Natl. Acad.Sc1. USA, 83 (8) =2412-2416,1986)。經(jīng)過(guò)蛋白水解位于Argl52_Ilel53的單個(gè)肽鍵，通過(guò)形成由二硫鍵連接的兩個(gè)多肽鏈(即，N末端輕鏈(24kDa)和C末端重鏈(28kDa))，F(xiàn)VII被轉(zhuǎn)化為其激活形式FVIIa。FVII以500ng/mL的濃度存在于血漿中，并且1% (即，5ng/mL)的FVII作為FVIIa而存在。同時(shí)，已報(bào)道血漿中FVII的半衰期為約4小時(shí)(3 6小時(shí))，而FVIIa的半衰期為約2. 5小時(shí)。由于半衰期短，需要通過(guò)多次靜脈內(nèi)注射或連續(xù)注射來(lái)施用FVIIa。然而，就高治療費(fèi)用和使患者不適而言，這會(huì)限制FVIIa的治療應(yīng)用。為了克服這些問(wèn)題，已提供方法用于制備包含F(xiàn)VII以及與其相連的融合伴侶的融合蛋白質(zhì)，但是所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有喪失其生物活性的問(wèn)題，盡管與非融合蛋白質(zhì)相比，較短的體內(nèi)半衰期有所提高。因此，有需要提供和獲得具有提高的體內(nèi)半衰期同時(shí)保持天然型FVII的生物活性的FVII融合蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有天然型FVII的生物活性的融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼所述融合蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含所述基因的重組載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含所述重組載體的宿主細(xì)胞。問(wèn)題的解決方案根據(jù)本發(fā)明的 一個(gè)方面，提供了包含因子VII (FVII)和轉(zhuǎn)鐵蛋白的融合蛋白質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)鐵蛋白與所述FVII的C末端相連接。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼所述融合蛋白質(zhì)的DNA。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含所述DNA的重組載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含所述重組載體的宿主細(xì)胞。發(fā)明的有益效果根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)具有與天然型FVII相比提高的體內(nèi)半衰期同時(shí)保持FVII的高生物活性，因此可有效地用于使用FVII的治療。附圖簡(jiǎn)述當(dāng)與附圖結(jié)合時(shí)，通過(guò)以下對(duì)發(fā)明的描述，本發(fā)明的上述和其他目的及特征將變得顯而易見(jiàn)，所述附圖分別示出

圖1是示意圖，其示出用于由包含編碼FVII序列的cDNA的載體以及包含編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)序列的cDNA的載體構(gòu)建FVI1-Tf表達(dá)載體的克隆流程；圖2是示意圖，其示出用于通過(guò)重疊PCR構(gòu)建FVI1-GSl (接頭)-Tf表達(dá)載體的流程;圖3 是示意圖，其示出包含 GS3、GS5、GS7、GS9、GS11、GS13、GS15 或 GS-1-T 作為接頭的FVI1-GS接頭-Tf表達(dá)載體的構(gòu)建流程；圖 4 顯示了本發(fā)明的 VI1-Tf、FVI1-GSl-Tf、FVI1-GS3_Tf、FVI1-GS5_Tf、FVI1-GS7-Tf、FVI1-GS9-Tf、FVI1-GSll-Tf, FVI1-GS13_Tf、FVI1-GS15_Tf、FVI1-GSl-T-Tf和FVI1-螺旋-Tf(FVI1-Helix-Tf)融合蛋白質(zhì)，F(xiàn)VI1-白蛋白融合蛋白質(zhì)(FVI1-Alb)和FVII (諾其 (NovoSeven ))的 Western 印跡結(jié)果；圖 5 是圖表，其示出本發(fā)明的 FVI1-Tf、FVI1-GSl-Tf、FVI1-GS3-Tf、FVI1-GS5-Tf、FVI1-GS7-Tf、FVI1-GS9-Tf、FVI1-GSll-Tf, FVI1-GS13_Tf、FVI1-GS15_Tf、FVI1-GSl-T-Tf和FVI1-螺旋-Tf融合蛋白質(zhì)、以及FVI1-白蛋白融合蛋白質(zhì)(FVI1-Alb)的比活性(specific activity)；
圖6呈現(xiàn)接頭和FVI1-GSl-T-Tf融合蛋白質(zhì)中兩個(gè)末端處的限制性識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)；以及圖1 示出經(jīng)純化的本發(fā)明 FVI1-Tf、FVI1-GSl-Tf、FVI1-GSl-T-Tf、FVI1-GS3-Tf 以及FVI1-GS15_Tf融合蛋白質(zhì)，NovoSeven 和FVII的western印跡結(jié)果。發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明提供包含因子VII (FVII)和轉(zhuǎn)鐵蛋白的融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的FVII和轉(zhuǎn)鐵蛋白可源自任何哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。更具體地，本發(fā)明中所使用的FVII和轉(zhuǎn)鐵蛋白可分別具有與見(jiàn)于人血液中那些天然型蛋白質(zhì)不少于95%的序列同源性。最優(yōu)選地，F(xiàn)VII具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列并且轉(zhuǎn)鐵蛋白具有SEQ ID NO : 2的氨基酸序列。此外，用于本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的FVII或轉(zhuǎn)鐵蛋白可以是其天然型的功能等價(jià)物或功能衍生物，其具有基本等價(jià)的功能活性。示例性的功能等價(jià)物包括由分別在SEQ IDNO :1和2所示的氨基酸序列中缺失、插入或者非保守性或保守性替換任何氨基酸殘基或者其組合所誘導(dǎo)的突變體，其中這樣的改變基本不改變提供對(duì)FVII的生物活性的活性位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域。在一些情況中，可例如通過(guò)磷酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、丙烯?；⑻腔?、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等來(lái)修飾本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)，用于提高或降低其物理或化學(xué)特性，并且只要基本保持FVII的生物活性，這樣的功能衍生物也落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)中，轉(zhuǎn)鐵蛋白優(yōu)選地與FVII的C末端相連接。采用FVI1-轉(zhuǎn)鐵蛋白順序的融合蛋白質(zhì)優(yōu)于采用轉(zhuǎn)鐵蛋白-FVII順序的融合蛋白質(zhì)，可能是由于FVII的N末端的暴露 (見(jiàn)表3)。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)還可在FVII與轉(zhuǎn)鐵蛋白之間包含限制酶的識(shí)別序列以利于插入以下所描述的接頭。限制性識(shí)別序列可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何限制性識(shí)別序列，并且可優(yōu)選地使用AgeI識(shí)別序列(A/CCGGT)。換句話說(shuō)，融合蛋白質(zhì)(其中限制性識(shí)別序列與FVII的C末端相連接并且轉(zhuǎn)鐵蛋白與限制性識(shí)別序列相連接)包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供在FVII與轉(zhuǎn)鐵蛋白之間包含接頭的融合蛋白質(zhì)。所述接頭可具有I至100個(gè)氨基酸，優(yōu)選I至75個(gè)氨基酸，更優(yōu)選5至25個(gè)氨基酸，并且所述接頭可以是可將FVII與轉(zhuǎn)鐵蛋白功能性分離的任何肽。所述接頭可具有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如螺旋)或者可源自IgG鉸鏈區(qū)。優(yōu)選地，所述接頭在水溶液中可自由旋轉(zhuǎn)，并且不具有固定結(jié)構(gòu)，因此，所述接頭可以是非免疫原性的并且可通過(guò)使兩個(gè)融合伴侶之間的潛在干擾最小化而提高融合蛋白質(zhì)的FVII活性。例如，這樣的接頭可以是氨基酸序列SEQ ID NO :11所示的螺旋接頭。此外，這樣的柔性接頭可包含重復(fù)或隨機(jī)模式的甘氨酸(G)和絲氨酸(S)。例如，所述接頭包含(GGGGS)n (其中N是I至20的整數(shù))，并且優(yōu)選具有選自SEQ ID NO 3至11的任一氨基酸序列(見(jiàn)表I)。此外，具有與所述接頭不低于80%同源性(優(yōu)選具有不低于85%同源性)的任何氨基酸序列也可用于本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)。此外，所述接頭還可包括蛋白酶切割位點(diǎn)，其可被損傷組織中豐富的蛋白酶識(shí)別。所述切割位點(diǎn)可被選自凝血酶、因子X(jué)a、因子IXa和因子VIIa的蛋白酶切割。具有這種蛋白酶切割位點(diǎn)的融合蛋白質(zhì)在工作位點(diǎn)處被切割以產(chǎn)生每種蛋白質(zhì)(即，F(xiàn)VII和轉(zhuǎn)鐵蛋白)，并且所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作為個(gè)體蛋白質(zhì)而發(fā)揮功能。優(yōu)選地，所述接頭具有SEQ ID NO12的氨基酸序列(見(jiàn)表I)?？筛菀椎赝ㄟ^(guò)位于FVII與轉(zhuǎn)鐵蛋白之間的限制酶識(shí)別序列將所述接頭插入到融合蛋白質(zhì)中。因此，所述限制酶識(shí)別序列可存在于所述接頭的任一端或兩端，并且繼而被翻譯成由所述序列編碼的氨基酸。例如，當(dāng)使用AgeI限制酶識(shí)別序列時(shí)，Thr可存在于所述接頭的N末端，并且Thr-Gly可存在于所述接頭的C末端。即，當(dāng)使用接頭(GGGGS)3時(shí)，所述識(shí)別序列和接頭可以以一T (GGGGS) 3TG-的形式存在。在所述接頭的N末端和C末端處翻譯的氨基酸可根據(jù)所使用的限制酶識(shí)別序列而有所不同，但其存在并不影響融合蛋白質(zhì)的活性(見(jiàn)表5)。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)表現(xiàn)出不低于0.7的與未融合天然型FVII相比的FVII比活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述融合蛋白質(zhì)(其包含由SEQ ID NO 1的氨基酸序列所示的FVII和由SEQ ID NO 2的氨基酸序列所示的轉(zhuǎn)鐵蛋白)具有約0. 82至約0. 92的與未融合天然型FVII相比的FVII比活性(見(jiàn)表2和表3)。此外，所述融合蛋白質(zhì)(其包含由SEQ ID NO :1的氨基酸序列所示的FVI1、由SEQID NO 3的氨基酸片列所示的接頭以及由SEQ ID NO 2的氨基酸序列所示的轉(zhuǎn)鐵蛋白)具有約0. 97的與未融合天然型FVII相比的FVII比活性(見(jiàn)表2)。根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)(其中另一些接頭插入FVII與轉(zhuǎn)鐵蛋白之間)也具有約0. 74至約I的與未融合天然型FVII相比的FVII比活性(見(jiàn)表2)。此外，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)具有比其上沒(méi)有連接轉(zhuǎn)鐵蛋白的FVII長(zhǎng)3 4倍的半衰期(見(jiàn)表6)。 本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白質(zhì)的DNA。由于密碼子簡(jiǎn)并性或者考慮生物體中優(yōu)選的密碼子，可對(duì)編碼融合蛋白質(zhì)的DNA進(jìn)行多種改變和修改以表達(dá)所述融合蛋白質(zhì)，除非所述融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列實(shí)質(zhì)地改變，經(jīng)修改的DNA也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明中，編碼所述融合蛋白質(zhì)的DNA可優(yōu)選地由SEQ ID NO 13至24的任一核苷酸序列所示?？赏ㄟ^(guò)用于表達(dá)所述DNA的載體來(lái)提供本發(fā)明編碼所述融合蛋白質(zhì)的DNA。本發(fā)明提供包含編碼所述融合蛋白質(zhì)的DNA的重組載體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指用于將編碼所述融合蛋白質(zhì)的DNA引入宿主細(xì)胞并在其中表達(dá)所述融合蛋白質(zhì)的工具(means)。所述載體可包括常規(guī)載體，例如質(zhì)粒載體、粘粒(cosmid)載體、曬菌體載體、病毒載體等,優(yōu)選質(zhì)粒載體。合適的表達(dá)載體包含表達(dá)調(diào)節(jié)元件(例如，啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子、聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子)，以及用于膜導(dǎo)向或分泌的信號(hào)序列或前導(dǎo)序列，并且可根據(jù)目的而多樣地制備。應(yīng)確保所述起始密碼子和終止密碼子在施用基因構(gòu)建體的生物體中運(yùn)作，并且處于編碼序列的閱讀框中(in-frame)。此外，所述表達(dá)載體包含用于選擇含有所述載體的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記，以及復(fù)制起點(diǎn)(如果所述表達(dá)載體是可復(fù)制的)。所述載體可自身復(fù)制或可被整合到宿主細(xì)胞的DNA中。具體地,可通過(guò)將編碼所述融合蛋白質(zhì)的DNA插入到pcDNA3. 1-hygro載體而制備根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)載體。此外，本發(fā)明提供通過(guò)用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生所述融合蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。因?yàn)?，所述蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和修飾根據(jù)宿主細(xì)胞的類型而有所不同，優(yōu)選選擇最適于目的的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞(HEK293)、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK 21)、人肝癌細(xì)胞Ofep G2)等，但不限于此。為了用根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，此類方法的實(shí)例包括但不限于電穿孔、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣(CaPO4)沉淀、氯化隹丐(CaCl2)沉淀等。發(fā)明的實(shí)施方式以下實(shí)施例僅為舉例說(shuō)明的目的而給出，并不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 :制備因子 VII (FVII)質(zhì)粒載體(pcDNA3. l-hygro-FVII)將從H印G2細(xì)胞(KCLB No. 88065)純化的總RNA用作模板用于逆轉(zhuǎn)錄。通過(guò)使用FVII基因特異性引物FVI1-F和FVI1-R(SEQ ID NO 25和26)的PCR擴(kuò)增互補(bǔ)DNA(cDNA)以獲得人FVI1-F基因的開(kāi)放閱讀框。在以下條件下通過(guò)處理50 ii L的反應(yīng)溶液(0. 5iiLcDNA.O. 4uM(10pmol/u L) SEQ ID NO :25 和 26 的引物、0. 2mM dNTP、5 單位的 TaqDNA 聚合酶和水)而進(jìn)行PCR :在94°C下5分鐘的I個(gè)變性循環(huán)，在94°C下I分鐘、60°C下I分鐘、以及在72°C下2. 5分鐘的35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以及在72°C下5分鐘的I個(gè)最終延伸循環(huán)。將經(jīng)純化的 PCR 產(chǎn)物克隆到 pGEM-T 易載體(pGEM-T easy vector) (Promega, Cat# A1360)中。通過(guò)使用EcoRI和NcoI的限制性酶切選擇陽(yáng)性克隆。通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步核實(shí)所選擇的克隆。為了將FVII的ORF(FVI1-ORF)轉(zhuǎn)移至表達(dá)載體，通過(guò)T4DNA聚合酶使以NotI切割的FVI1-ORF成平末端(blunt), 并與以Hindlll/Xbal酶切并且成平末端的pcDNA3. 1-hygro載體(Invitrogen)相連接。 通過(guò)用Apa1、Xba1、EcoR1、Nco1、PstI限制性酶切和DNA測(cè)序而確證經(jīng)連接的載體。該載體被定名為“pcDNA3. l-hygro-FVII”。實(shí)施例2 :構(gòu)建 FVI1-Tf 表達(dá)載體(pcDNA3. l-hygro-FVI1-Tf)將實(shí)施例1中制備的FVII cDNA與人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)cDNA融合以作為動(dòng)物細(xì)胞中的單一酶原而表達(dá)。人轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA購(gòu)自O(shè)rigene (Cat# SC322130)并且核實(shí)其與GenBank登錄號(hào)NM_001063. 2的序列是否相同。設(shè)計(jì)融合中所使用的引物以除去FVII的終止密碼子以及轉(zhuǎn)鐵蛋白的信號(hào)肽。為了利于在FVII與Tf之間插入多種大小的接頭，向連接引物中添加AgeI位點(diǎn)(ACCGGT)，其將被翻譯成蘇氨酸(Thr)和甘氨酸(Gly)。所產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)可具有以下結(jié)構(gòu)(前導(dǎo)肽)-(成熟FVII) -(Thr-Gly)-(成熟Tf)(其中前導(dǎo)肽由成熟FVII中不存在的信號(hào)肽(前肽(prepeptide))和待通過(guò)加工酶切割的肽原(propeptide)組成，由38個(gè)氨基酸構(gòu)成，并且與SEQ ID NO 1氨基酸序列中的I至38位置的氨基酸相對(duì)應(yīng))。通過(guò)使用引物 FVI1-SU FVI1-ASU Tf-Sl 和 Tf-ASl (SEQ IDNO 27 至 30)擴(kuò)增 FVII以及Tf的cDNA，并且使用實(shí)施例1中所描述載體。SEQ ID NO 27和30的引物分別包含NheI和XhoI位點(diǎn)。圖1中描述了用于將FVII cDNA與Tf cDNA相連接的克隆策略。首先，通過(guò)PCR從pcDNA3. l-hygro-FVII載體擴(kuò)增FVII cDNA。在以下條件下通過(guò)處理50 y L的反應(yīng)溶液(I ii L載體模板、Iii L 引物對(duì)、FVI1-Sl 和 FVI1-ASl (IOiiM)、IOii L 5x Phusion HF 緩沖液、200 u M dNTP、0. 5 u LPhusion DNA 聚合酶(FINNZYMES, #F-530S, 2 單位 / u L)和 35. 5 y L水)而進(jìn)行PCR :在98°C下30秒的I個(gè)變性循環(huán)，在98°C下10秒、60°C下45秒、以及在72°C下30秒的30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以及在72°C下7分鐘的I個(gè)最終延伸循環(huán)。接下來(lái)，使用轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA作為模板擴(kuò)增Tf。重復(fù)上述PCR操作，不同之處在于使用引物對(duì)(Tf-Sl 10uM ；Tf-ASl :10iiM)。通過(guò)一系列的限制性酶切(restriction)和連接而將經(jīng)擴(kuò)增的FVII和Tf cDNA相連接。用AgeI和XhoI或者用NheI酶切通過(guò)PCR擴(kuò)增的每種DNA。將經(jīng)酶切的DNA純化并以1:1的摩爾比連接。將經(jīng)連接的DNA亞克隆到用Nhel/Xhol酶切的pcDNA3. 1-hygro載體(Invitrogen)中。通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步核實(shí)插入物的大小和序列。實(shí)施例3 :構(gòu)建FVI1-GS接頭-Tf表達(dá)載體使用包含甘氨酸和絲氨酸的由5個(gè)氨基酸組成的肽作為基本接頭單位。所述基本接頭單位包含四個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸，具有以下序列“GGGGS”。應(yīng)用所述基本接頭單位(下文中稱為“GS-X接頭”，其中X是重復(fù)數(shù)目的基本GS接頭單位)以構(gòu)建更長(zhǎng)的GS接頭。在該實(shí)施例中，構(gòu)建GS-1至GS-15的接頭。I)構(gòu)建FVI1-GS-1接頭-Tf表達(dá)載體合成一組包含基本GS接頭單位的引物GS-FV-ASl和GS-Tf-Sl (SEQ ID NO :31和32)，并通過(guò)重疊PCR將其插入到FVII與Tf之間(見(jiàn)圖2)。通過(guò)使用一組引物FVI1-Sl和 GS-FV-ASl (SEQ ID N0:27 和 31)以及Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES，#F-530S)的PCR將所述GS-1接頭與FVII相連接。通過(guò)在以下條件下處理 50 ii L 的反應(yīng)溶液 (I u LpcDNA3. l-hygro-FVI1-Tf 載體、I y L FVI1-Sl (10pmole/l u L),I u LGS-FV-ASl (lOpmole/ u L) U U L IOmM dNTP、IOy L 5x Phusion HF緩沖液、35. 5 y L水和0. 5 ii L Phusion DNA聚合酶(2單位/ y L))而進(jìn)行PCR :在98°C下30秒的I個(gè)變性循環(huán)，在98°C下10秒、64°C下30秒、以及在72°C下45秒的35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以及在72°C下7分鐘的I個(gè)最終延伸循環(huán)。同時(shí)，為了將GS-1接頭與Tf相連接，重復(fù)上述PCR操作，不同之處在于使用一組引物GS-Tf-Sl和Tf-AS1(SEQ ID NO :32和30)。使用經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為重疊PCR的模板。通過(guò)在以下條件下處理反應(yīng)溶液(IuL經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、I y LFVI1-Sl (lOpmole/u L,SEQ ID NO :27)，I y L 反義引物(Tf-ASl lOpmole/u L, SEQ ID NO:30) UOu L 5x PhusionHF 緩沖液、I ii L IOmM dNTP、34. 5 y L 水、0. 5 y L Phusion DNA 聚合酶(2單位/y L))而進(jìn)行重疊PCR :在98°C下I分鐘的I個(gè)變性循環(huán)，在98°C下10秒、66/68°C下30秒、以及在72°C下45秒的45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以及在72°C下7分鐘的I個(gè)最終延伸循環(huán)。將進(jìn)擴(kuò)增的重疊PCR產(chǎn)物克隆到用NheI和XhoI酶切的pcDNA3. 1-hygro-lacZ中。2)構(gòu)建FVI1-GS-3接頭-Tf表達(dá)載體合成包含GS-3 和 AgeI 位點(diǎn)的引物對(duì) GS3-S 和 GS3-AS(SEQ ID NO :33 和 34)。為了制造GS-3雙鏈接頭，通過(guò)在98 °C下加熱混合物(5iiL GS3-S (lOOpmole/u L) ,5 u LGS3-AS(100pmole/ii L)、2ii L IOX 退火緩沖液(IOOmM Tris-Cl [pH 8. 0] UM NaClUOmMEDTA)和8iiL水)10分鐘并在25°C下冷卻I小時(shí)而使引物退火。用AgeI酶切經(jīng)退火的接頭，并且還用AgeI酶切實(shí)施例2中制備的pcDNA3. l-hygro-FVI1-Tf載體。在37°C下用IuL CIP (小牛腸磷酸酶；NEB，#M0290S)處理經(jīng)酶切的載體I小時(shí)，并對(duì)其進(jìn)行凝膠提取操作(QIAGEN，#28704)，隨后使用T4DNA連接酶(TAKARA, #2011A)以1: 3的摩爾比(載體插入物)連接。3)構(gòu)建FVI1-GS-5接頭-Tf至FVI1-GS-15接頭-Tf的表達(dá)載體為了構(gòu)建包含GS-5接頭的融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體，實(shí)施了新的策略。通過(guò)以下兩個(gè)步驟構(gòu)建包含接頭經(jīng)延長(zhǎng)的FVI1-Tf融合載體。第一步是向以前獲得的接頭中添加合成的雙鏈(ds)GS2接頭。確保延長(zhǎng)接頭之后，將所述接頭切出并將其插入pcDNA3. l-hygro-FVI1-Tf載體中的FVII基因與Tf基因之間。例如，為了將GS-3接頭延長(zhǎng)至GS-5接頭，用BglII酶切SEQ ID NO :35的經(jīng)合成dsGS_2接頭單位，并與用BamHI和StuI處理的pcDNA3. l-hygro-FVI1-GS3_Tf載體連接。接下來(lái)，在通過(guò)BamHl和AgeI酶切確證延伸所述接頭之后，用AgeI將經(jīng)延長(zhǎng)的接頭切出，并將其克隆到用AgeI和CIP處理的pcDNA3. l-hygro-FVI1-Tf載體中。通過(guò)相同的策略構(gòu)建包含GS-7、GS-9、GS-11、GS-13 和 GS-15 接頭的 FVI1-Tf 融合表達(dá)載體(見(jiàn)圖 3)。實(shí)施例4 :構(gòu)建含有包含凝血酶切割位點(diǎn)的接頭的FVI1-Tf表達(dá)載體(pcDNA3.1-hygro-FVI1-GSl-T-Tf)通過(guò)使GS-1單位與凝血酶識(shí)別序列(下文中稱為“GS1-T接頭”)的兩端鄰接而制備包含凝血酶切割位點(diǎn)的接頭。設(shè)計(jì)并合成SEQ ID NO :36(有義)的dsGSl_T接頭以在兩端包含AgeI位點(diǎn)。用AgeI酶切dsGSl_T接頭，并使用PCR純化試劑盒(Qiagen，cat# 28104)進(jìn)行純化。將經(jīng)純化的接頭連接到用CIP/Agel處理的pcDNA3. l-hygro-FVI1-Tf 載體中。實(shí)施例5 :構(gòu)建包含螺旋接頭的FVI1-Tf表達(dá)載體(pcDNA3. l-hygro-FVI1-螺旋-Tf)通過(guò)美國(guó)公開(kāi)( Laid-open Publication)No. 2009/0170163中公開(kāi)的方法制備螺旋接頭DNA。通過(guò)使用弓I物向所制備螺旋接頭DNA (螺旋接頭S和螺旋接頭AS (SEQ ID NO 37和38))的兩端添加AgeI位點(diǎn)。將引物螺旋接頭S和螺旋接頭AS退火并用AgeI酶切，隨后插入用AgeI和CIP處理的pcDNA3. l-hygro-FVI1-Tf載體中。通過(guò)DNA測(cè)序確證所構(gòu)建的載體。比較例1:構(gòu)建FVI1-白蛋白融合表達(dá)載體(FVI1-Alb)構(gòu)建歐洲專利No. 1816201中所公開(kāi)的FVI1-白蛋白融合蛋白質(zhì)。通過(guò)使用人肝HiRNA(Clontech)作為模板以及白蛋白基因特異性引物白蛋白-S和白蛋白-AS(SEQ ID NO:39和40)的RT-PCR獲得人白蛋白cDNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)通過(guò)使用AccuScript高保真RT-PCR系統(tǒng)試劑盒(Cat# 600180)進(jìn)行RT-PCR。首先，將10 y L的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液(IyL10X 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0. 6 ii L 寡-dT 引物、I ii L dNTP、0. L 水、L 人肝 mRNA(10ng/y L))在65°C下保持5分鐘，并在室溫下保持5分鐘，并在42°C下與I y L IOOmM DTT和I UL逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)I小時(shí)。通過(guò)使用合成cDNA作為模板以及引物白蛋白-S和白蛋白-AS的PCR獲得人白蛋白序列。在以下條件下通過(guò)處理50 ii L的反應(yīng)溶液(IiiL cDNA模板、IOu L 5x Phusion HF緩沖液、分別I y L引物白蛋白-S和白蛋白_AS、1 y L IOmM dNTP、0. 5u L Phusion DNA 聚合酶(FINNZYMES, #F-530S ；2 單位 / u L)和 35. 5 y L /JO 而進(jìn)行PCR:在98°C下I分鐘的I個(gè)變性循環(huán)，在98°C下10秒、60°C下30秒、以及在72°C下60秒的30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，以及在72°C下7分鐘的I個(gè)最終延伸循環(huán)。將合成的SEQ ID NO 41和42的寡核苷酸退火至歐洲專利No. 1816201中所公開(kāi)的GS接頭[SS(GGS)9GS] (SEQID NO:45)。為了將實(shí)施例1中制備的FVII cDNA連接至上述接頭，通過(guò)使用引物mutFVII (XhoI) -S 和 mut FVII (XhoI) -AS (SEQ ID NO 43 和 44)的基于 PCR 的誘變，用 XhoI 位點(diǎn)替換pcDNA3. l-hygro-FVII載體中的FVII終止密碼子。使用Xhol/Apal位點(diǎn)，將GS接頭[SS(GGS)9GS]融合至 pcDNA3. l-hygro-FVII 載體中 FVIIcDNA 的 3'端。最終，將用 BamHI酶切的人白蛋白cDNA插入到pcDNA3.1-hygro-FVI1-GS-接頭載體中。通過(guò)DNA測(cè)序核實(shí)所制備的pcDNA3.1-hygro-FVI1-GS-接頭-白蛋白表達(dá)載體。表I中示出實(shí)施例2至5以及比較例I中所構(gòu)建表達(dá)載體的特征。表I[表 I]
權(quán)利要求
1.包含因子VII(FVII)和轉(zhuǎn)鐵蛋白的融合蛋白質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)鐵蛋白與所述FVII的C末端相連接。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所述FVII是氨基酸序列SEQIDNO :1所示的多肽或其功能等價(jià)物。
3.權(quán)利要求2的融合蛋白質(zhì)，其中所述功能等價(jià)物具有與所述FVII的功能活性基本等價(jià)的功能活性，并且在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中具有氨基酸殘基的缺失、插入或替換。
4.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)鐵蛋白是氨基酸序列SEQIDNO 2所示的多肽或其功能等價(jià)物。
5.權(quán)利要求4的融合蛋白質(zhì)，其中所述功能等價(jià)物具有與所述FVII的功能活性基本等價(jià)的功能活性，并且在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中具有氨基酸殘基的缺失、插入或替換。
6.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其在所述FVII的C末端與所述轉(zhuǎn)鐵蛋白之間還包含限制酶識(shí)別序列。
7.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其在所述FVII與所述轉(zhuǎn)鐵蛋白之間還包含接頭。
8.權(quán)利要求7的融合蛋白質(zhì)，其中所述接頭由I至100個(gè)氨基酸組成。
9.權(quán)利要求7的融合蛋白質(zhì)，其中所述接頭由I至75個(gè)氨基酸組成。
10.權(quán)利要求7的融合蛋白質(zhì)，其中所述接頭由5至25個(gè)氨基酸組成。
11.權(quán)利要求7的融合蛋白質(zhì)，其中翻譯自限制酶識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸存在于所述接頭的一端或兩端。
12.權(quán)利要求7的融合蛋白質(zhì)，其中所述接頭是SEQID NO :3至11的任一氨基酸序列所示的肽。
13.權(quán)利要求7的融合蛋白質(zhì)，其中所述接頭包含蛋白酶切割位點(diǎn)，其能夠被選自凝血酶、因子X(jué)a、因子IXa和因子VIIa的蛋白酶切割。
14.權(quán)利要求13的融合蛋白質(zhì)，其中所述接頭是由SEQID NO :12的氨基酸序列所示的肽。
15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的融合蛋白質(zhì)，其中所述融合蛋白質(zhì)具有與未融合天然型FVII相比不低于0. 7的FVII比活性。
16.編碼權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的融合蛋白質(zhì)的DNA。
17.權(quán)利要求16的DNA，其中所述DNA由SEQID NO : 13至24的任一核苷酸序列所示。
18.包含權(quán)利要求16的DNA的重組載體。
19.包含權(quán)利要求18的重組載體的宿主細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其選自CH0細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和H印G2細(xì)胞。
全文摘要
與現(xiàn)有的包含除轉(zhuǎn)鐵蛋白之外其他融合伴侶的FVII融合蛋白質(zhì)相比，根據(jù)本發(fā)明的包含因子VII(FVII)和轉(zhuǎn)鐵蛋白的融合蛋白質(zhì)具有提高的FVII比活性，并因此可有效地用于使用FVII的治療。
文檔編號(hào)C12N15/62GK103068854SQ201180027707
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者宋寅瑛, 金薰?jié)? 李峰鏞, 樸萬(wàn)勛, 李鎬順, 林允挺, 李智慧, 孫瑞延, 金旼善 申請(qǐng)人:Sk化學(xué)公司