專利名稱：轉(zhuǎn)基因蕓苔屬植物事件mon 88302及其使用方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)領域，尤其涉及轉(zhuǎn)基因作物植物領域。
背景技術(shù)：
蕓苔屬作物在世界上許多地區(qū)是非常重要的?？蓪⑸锛夹g(shù)的方法用于此類作物以產(chǎn)生具有改良性狀例如除草劑耐受性的作物?？赏ㄟ^表達能夠提供這樣的耐受性的轉(zhuǎn)基因來在轉(zhuǎn)基因植物中獲得除草劑耐受性。轉(zhuǎn)基因在植物中的表達可受因素例如轉(zhuǎn)基因盒中使用的調(diào)控元件、轉(zhuǎn)基因插入物的染色體定位以及接近整合位置的任何內(nèi)源調(diào)控元件的接近度(proximity)的組合影響。例如，已觀察到在類似產(chǎn)生的事件之間在轉(zhuǎn)基因表達的總體水平上或轉(zhuǎn)基因表達的空間或時間模式上存在廣泛的變化。為此原因，可能必需產(chǎn)生和測試數(shù)百個單個植物轉(zhuǎn)化事件以最終鑒定對于商業(yè)農(nóng)業(yè)目的是有用的一個事件。一旦被鑒定為具有期望的轉(zhuǎn)基因表達 和分子特征，隨后可使用植物育種方法將這樣的事件用于將該性狀漸滲入其它遺傳背景。所得的后代可包含轉(zhuǎn)基因事件，因此可具有原始轉(zhuǎn)化體的該性狀的轉(zhuǎn)基因表達特征。這可用于產(chǎn)生許多不同的包含改良的性狀并且經(jīng)適當?shù)馗脑爝m合于特定地方生長條件的作物品種。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含事件MON 88302的轉(zhuǎn)基因植物和種子，其代表性種子樣品已由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)以登錄號PTA-10955保藏。包含事件的植物展示商業(yè)上可接受的對草甘膦除草劑的應用的耐受性。本發(fā)明提供了包含事件的后代植物、植物部分和細胞；與事件相關的重組DNA分子和使用此類分子的方法；從事件衍生的或包含其的商業(yè)產(chǎn)品；以及使用事件的方法。本發(fā)明提供了包含事件的植物、種子、細胞、后代植物或植物部分以及從包含事件的植物、細胞、植物部分或種子衍生的商業(yè)產(chǎn)品。本發(fā)明因此提供了包含具有核苷酸序列的DNA分子的植物、種子、細胞、后代植物、植物部分或商業(yè)產(chǎn)品，所述核苷酸序列選自SEQ IDNO:USEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8及其片段。本發(fā)明提供了包含重組DNA分子的植物、種子、細胞、后代植物或植物部分，所述重組DNA分子例如在DNA擴增法中產(chǎn)生包含本發(fā)明的DNA分子的擴增子。本發(fā)明提供了與事件相關的DNA分子。此類DNA分子可包含代表或來源于如下序列的核苷酸序列:事件MON 88302的轉(zhuǎn)基因插入與側(cè)翼基因組DNA的接合處，和/或側(cè)翼連接插入的DNA的基因組DNA的區(qū)域，和/或側(cè)翼連接插入位點的整合的轉(zhuǎn)基因DNA的區(qū)域，和/或整合的轉(zhuǎn)基因表達盒的區(qū)域，和/或此類區(qū)域的任何區(qū)域的連續(xù)序列。本發(fā)明還提供了用作診斷事件的引物和探針的DNA分子。提供了包含此類分子的植物、細胞、植物部分、商業(yè)產(chǎn)品、后代和種子。本發(fā)明提供了用于檢測來源于事件的DNA的存在的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明提供了通過如下步驟檢測事件的方法:將包含DNA的樣品與當與來自事件的基因組DNA一起用于核酸擴增反應時產(chǎn)生診斷事件的擴增子的引物組接觸，進行核酸擴增反應，從而產(chǎn)生擴增子，和檢測擴增子。本發(fā)明還提供了通過如下步驟檢測事件的方法:將包含DNA的樣品與當與來自事件的基因組DNA —起用于雜交反應時與對于事件是特異性的DNA分子雜交的探針接觸，進行雜交反應，和檢測探針對DNA分子的雜交。還提供了包括用于檢測來源于事件的DNA的存在的本發(fā)明的方法和組合物的試劑盒。本發(fā)明提供了通過如下步驟控制田間雜草的方法:通過種植包含事件的植物(即，種植包含事件的種子)，隨后施用有效劑量的能夠控制雜草而不損傷包含事件的植物的草甘膦。 本發(fā)明提供了通過如下步驟產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的施用的植物和/或種子的方法:將包含事件或包含選自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6, SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列的耐受草甘膦的植物與第二植物接觸，從而產(chǎn)生種子，生長所述種子以產(chǎn)生后代植物，用草甘膦處理后代植物，以及選擇包含事件并且耐受草甘膦的后代植物。本發(fā)明提供了通過如下步驟產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的施用的植物和/或種子的方法:將包含事件或包含選自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4, SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列的耐受草甘膦的植物自交，從而產(chǎn)生種子，生長種子以產(chǎn)生后代植物，利用草甘膦處理后代植物；和選擇包含事件并且耐受草甘膦的后代植物。本發(fā)明提供了通過如下步驟測定包含事件的植物或種子的接合性的方法:將包含DNA的樣品與當與來自事件MON 88302的基因組DNA —起用于核酸擴增反應時產(chǎn)生診斷事件的擴增子的第一引物組接觸，進行核酸擴增反應，從而產(chǎn)生擴增子，檢測擴增子，將樣品與第二引物組(所述第二引物組，當與來自植物的基因組DNA—起用于核酸擴增反應時產(chǎn)生第二擴增子，所述第二擴增子包含與鑒定為事件MON 88302的轉(zhuǎn)基因插入的基因組區(qū)域同源的天然基因組DNA)接觸，進行核酸擴增反應，從而產(chǎn)生第二擴增子，檢測第二擴增子，并且比較樣品中的第一與第二擴增子，其中兩種擴增子的存在表明樣品和從而植物或種子對于轉(zhuǎn)基因插入是雜合的。本發(fā)明的上述和其它方面根據(jù)下列詳述將變得更顯而易見的。附圖簡述

圖1:事件MON 88302的圖解表示；[A]相應于5’連接區(qū)域(junction region)的相對位置；[B]相應3’連接區(qū)域的相對位置；[C]相應于插入的轉(zhuǎn)基因DNA的側(cè)翼區(qū)域的相對位置和5’末端的部分；[D]相應于插入的轉(zhuǎn)基因DNA的3’側(cè)翼區(qū)域的相對位置和3’末端的部分；[E]表示轉(zhuǎn)基因表達盒；和[F]表示歐洲油菜(Brassica napus)基因組側(cè)翼序列和轉(zhuǎn)基因表達盒的連續(xù)序列。圖2:顯示當在4至6葉期施用草甘膦時與MON 88302相比較RT73事件的籽粒產(chǎn)量。RT73命名為RRl。圖3:顯示當在第一朵花時施用草甘膦時與MON 88302相比較RT73事件的籽粒產(chǎn)量。RT73命名為RRl。序列簡述SEQ ID NO:1_代表歐洲油菜基因組DNA與整合的轉(zhuǎn)基因表達盒之間的5’接合序列的60個核苷酸的序列。該核苷酸序列相應于SEQ ID NO:3的位點762至821 ([C]，參見圖1)和相應于SEQ ID NO:6的位點762至821。SEQ ID NO:2_代表整合的轉(zhuǎn)基因表達盒與歐洲油菜基因組DNA之間的3’接合處的60個核苷酸的序列。該核苷酸序列相應于SEQ ID NO:4的位點313至372 ([D]，參見圖1)和相應于SEQ ID NO:6的位點5189至5248。SEQ ID NO:3_側(cè)翼連接事件MON 88302的插入DNA達到和包括轉(zhuǎn)基因DNA的區(qū)域的5’序列。SEQ ID NO:3的核苷酸位點762至821相應于SEQ ID NO:1的核苷酸位點I至60 ；SEQ ID NO:3的核苷酸位點742至841相應于SEQ ID NO:7的核苷酸位點I至100，以及SEQ ID NO:3的核苷酸位點792至956相應于SEQ ID NO:5的核苷酸位點I至165。SEQ ID NO:4_側(cè)翼連接事件MON 88302的插入DNA達到和包括轉(zhuǎn)基因DNA的區(qū)域的3’序列。SEQ ID NO:4的核苷酸位點313至372相應于SEQ ID NO:2的核苷酸位點I至60 ；SEQ ID NO:4的核苷酸位點293至392相應于SEQ ID NO:8的核苷酸位點I至100，以及SEQ ID NO:4的核苷酸位點I至342相應于SEQ ID NO:5的核苷酸位點4086至4427。SEQ ID NO:5_賦予草甘膦除草劑耐受性的`整合的轉(zhuǎn)基因表達盒的序列。SEQ IDNO:5相應于SEQ ID NO:6的核苷酸位點792至5218。SEQ ID NO:6_代表側(cè)翼連接事件MON 88302的插入的DNA的5’序列(SEQ ID NO:3)、整合的表達盒的序列(SEQ ID NO:5)和側(cè)翼連接事件MON 88302的插入的DNA的3’序列(SEQ ID NO:4)的重疊群的核苷酸序列。SEQ ID NO -J-代表歐洲油菜基因組DNA與整合的轉(zhuǎn)基因表達盒之間的5’接合序列的100個核苷酸的序列。該核苷酸序列相應于SEQ ID NO:3的位點742至841 ([C]，參見圖1)和相應于SEQ ID NO:6的位點742至841。SEQ ID NO:8_代表整合的表達盒與歐洲油菜基因組DNA之間的3’接合處的100個核苷酸的序列。該核苷酸序列相應于SEQ ID NO:4的位點293至392([D]，參見圖1)，和相應于SEQ ID NO:6的位點5169至5268。SEQ ID NO:9_用于鑒定事件MON 88302的引物SQ20901。引物SQ20901與插入的表達盒在接近3’轉(zhuǎn)基因插入邊界的區(qū)域上互補。使用引物SQ20901和SQ23770(SEQ IDNO:10)的組合產(chǎn)生的擴增子為事件MON 88302的存在的陽性結(jié)果。SEQ ID NO:10為稱為引物SQ23770并且用于鑒定事件MON 88302的引物的序列。引物SQ23770與側(cè)翼連接插入的表達盒并且接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界的3’區(qū)域互補。使用引物SQ20901(SEQ ID NO:9)和SQ23770的組合產(chǎn)生的擴增子為事件MON 88302的存在的陽性結(jié)果。SEQ ID NO:11為稱為探針PB10164和用于鑒定事件MON 88302的探針的序列。其與側(cè)翼連接插入的表達盒并且與轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界接近的3’區(qū)域互補。該探針為6FAM -標記的合成寡核苷酸。在使用與6FAM -標記的探針PB10164組合的引物SQ20901和SQ23770(SEQ ID NO:9-10)的擴增反應中熒光信號的釋放在TAQMAN 測定中被診斷為事件 MON 88302。SEQ ID NO:12為稱為引物SQ21948并且用于鑒定MON 88302事件的接合性的引物的序列。SEQ ID NO:13為稱為引物SQ24635并且用于鑒定歐洲油菜野生型的接合性的引物的序列。SEQ ID NO:14為稱為引物SQ22176并且用于鑒定MON 88302事件和歐洲油菜野生型的接合性的引物的序列。SEQ ID N0:15為用于MON 88302事件的接合性的測定的探針(PB4213)的序列。SEQ ID NO:16為用于歐洲油菜野生型的接合性測定的探針(PB10787)的序列。SEQ ID NO:17為稱為引物SQ2563并且用作TAQMAN 測定的內(nèi)部對照的引物的序列。SEQ ID NO:18為稱為引物SQ2564并且用作TAQMAN 測定的內(nèi)部對照的引物的序列。SEQ ID NO:19為用作TAQMAN 測定的內(nèi)部對照的VIC -標記的合成寡核苷酸探針(PB0751)的序列。詳細描述下列定義和方法被提供來更好地定義本發(fā)明和在本發(fā)明的實施中指導本領域技術(shù)人員。除非另外指出，否 則將根據(jù)相關領域技術(shù)人員常規(guī)使用的含義來理解術(shù)語。如本文中所用，術(shù)語“包含”意指“包括但不限于”。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因事件MON 88302。如本文中所用，術(shù)語“事件”是指作為將轉(zhuǎn)基因DNA在染色體的特定位置上插入植物的基因組的結(jié)果產(chǎn)生的DNA分子。事件MON 88302是指作為具有本文中提供為SEQ ID NO:5的序列的轉(zhuǎn)基因DNA至歐洲油菜A基因組的連鎖群N4上的特定位置的插入的結(jié)果而產(chǎn)生的DNA分子。也在本發(fā)明中提供了包含事件MON88302的植物和種子。包含MON 88302的種子樣品已由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)以登錄號PTA-10955保藏。包含MON 88302的植物顯示商業(yè)上可接受的對草甘膦除草劑的施用的耐受性。包含事件的植物可以指包括插入植物的基因組中的特定位置的轉(zhuǎn)基因的原始轉(zhuǎn)化體。包含事件的植物還可指包括插入植物的基因組的特定位置的轉(zhuǎn)基因的原始轉(zhuǎn)化體的后代。這樣的后代可通過自交或通過轉(zhuǎn)化體或其后代與另一種植物之間的有性異型雜交(outcross)來產(chǎn)生。這樣的其它植物可以為包含相同或不同的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物和/或非轉(zhuǎn)基因植物例如來自不同品種的非轉(zhuǎn)基因植物。甚至在輪回親本重復回交后，來自轉(zhuǎn)化的親本的插入的DNA和側(cè)翼DNA在相同的基因組位置上存在于雜交的后代中。轉(zhuǎn)基因事件MON 88302通過轉(zhuǎn)基因DNA(在本文中提供為SEQ ID NO:5)至歐洲油菜植物的A基因組的連鎖群N4的插入來產(chǎn)生。歐洲油菜通常被稱為油菜籽，特定品種可稱為油菜(canola)。如本文中所用，術(shù)語“油菜”或“油菜植物”是指能夠被用于產(chǎn)生介花油(canola oil)(即滿足包含少于2 %的芥酸的特殊質(zhì)量指標的油)的芥屬植物，包括多種品種:歐洲油菜，蕪菁甘藍(Brassica napobrassica)、蕪菁(Brassica rapa)、芥菜型油菜(Brassica juncea)和白菜型油菜(Brassica campestris)。因為歐洲油菜為由完菁(先前稱為白菜型油菜)和甘藍(Brassica oleracea)雜交產(chǎn)生并且保留兩者的基因組的異源四倍體，可將包含轉(zhuǎn)基因事件MON 88302的歐洲油菜植物與育種方法一起使用以將MON 88302事件(從而草甘膦耐受性性狀)引入蕓苔屬的其它成員。用于實施本發(fā)明的方法的蕓苔屬的成員的實例包括但不限于芥菜型油菜、蕪菁甘藍(Brassica napobrassica)、甘藍、埃塞俄比亞芥(Brassica carinata)、歐洲油菜、蕪菁和白菜型油菜，以及屬于蕓苔屬的允許蕓苔屬種之間育種的任何其它植物。包含事件MON 88302的DNA分子是指包含插入的轉(zhuǎn)基因DNA的至少一部分(提供為SEQ ID NO:5)和緊鄰插入的DNA的側(cè)翼基因組DNA的至少一部分的DNA分子。這樣，包含事件MON 88302的DNA分子具有代表轉(zhuǎn)基因DNA插入物的至少一部分和已將轉(zhuǎn)基因DNA插入其中的植物的基因組的特定區(qū)域的至少一部分的核苷酸序列。與周圍植物基因組相關的事件MON 88302中的插入的DNA的排列對于事件MON 88302是特異性的和獨特的，因此,這樣的DNA分子的核苷酸序列是描述性的并鑒定事件MON 88302。這樣的DNA分子的序列的實例在本文中提供為 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。該DNA分子也是包含事件MON 88302的植物的染色體的整體部分并且可被傳遞至植物的后代。事件MON 88302賦予對施用至植物的草甘膦除草劑的抗性?！安莞熟ⅰ笔侵窷-磷酰甲基-甘氨酸及其鹽。草甘膦為對廣譜植物種類具有活性的除草劑。當施用于植物表面時，草甘膦全身性地移動遍布植物。草甘膦因其對提供了用于合成芳香族氨基酸的前體的莽草酸途徑的抑制而具有光毒性。如本文中所用，術(shù)語“重組”是指通常未在自然界中發(fā)現(xiàn)的并且因而通過人干預產(chǎn)生的DNA和/或蛋白質(zhì)和/或生物體形式。這樣的人干預可產(chǎn)生重組DNA分子和/或重組植物。如本文中所用，“重組DNA分子”為包含不能一起天然存在的DNA分子的組合并且為人干預的結(jié)果的DNA分子，例如由至少兩個彼此異源的DNA分子的組合組成的DNA分子，和/或為人工合成的并且包含從通常存在于自然界中的多核苷酸序列衍生的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工地 整合入宿主細胞的基因組DNA的轉(zhuǎn)基因和相連的宿主細胞的基因組的側(cè)翼DNA的DNA分子。重組DNA分子的實例為本文中描述的因轉(zhuǎn)基因至歐洲油菜基因組內(nèi)的插入而產(chǎn)生的DNA分子，其可最終導致重組RNA和/或蛋白質(zhì)分子在該生物體中表達。如本文中所用，“重組植物”為通常非天然地存在的植物，其為人干預的結(jié)果，并且包含整合入其基因組的轉(zhuǎn)基因和/或異源DNA分子。作為這樣的基因組改變的結(jié)果，重組植物與相關的野生型植物截然不同。重組植物的實例為在本文中描述為包含事件MON 88302的植物。如本文中所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指人工地整合入宿主細胞的基因組的多核苷酸分子。這樣的轉(zhuǎn)基因?qū)τ谒拗骷毎梢允钱愒吹?。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指包含這樣的轉(zhuǎn)基因的植物。如本文中所用，術(shù)語“異源的”是指通常被發(fā)現(xiàn)在自然界中不與第二分子組合的第一分子。例如，分子可來源于第一物種并且被插入第二物種的基因組。分子因此對于宿主是異源的并且被人工地整合入宿主細胞的基因組。如本文中所用，術(shù)語“嵌合的”是指通過將第一 DNA分子融合于第二 DNA分子產(chǎn)生的單個DNA分子，其中通常發(fā)現(xiàn)第一和第二 DNA分子通常都不以該構(gòu)型(即彼此融合)存在。嵌合DNA分子因此為另外通常在自然界中不能被發(fā)現(xiàn)的新DNA分子。本發(fā)明提供了 DNA分子及其相應的核苷酸序列。如本文中所用，術(shù)語“DNA序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常從5’(上游)末端至3’(下游)末端顯示的DNA分子的核苷酸的序列。本文中使用的命名法為美國聯(lián)邦法規(guī)法典(United States Codeof Federal Regulations) § 1.822 的 Title 37 所要求的和 WIPO Standard ST.25(1998),附錄2中的表(表I和3)中所示的命名法。本發(fā)明僅公開轉(zhuǎn)基因事件MON 88302中提供的兩條單核苷酸序列鏈的一條鏈。因此，通過推斷和推斷，互補序列(在本領域中也稱為完全互補序列或逆互補序列)在本發(fā)明的范圍內(nèi)，從而也預期在所述主題的范圍內(nèi)。相應于插入的轉(zhuǎn)基因DNA的完全核苷酸序列和側(cè)翼連接插入的轉(zhuǎn)基因DNA的任一末端的歐洲油菜基因組DNA的大部分區(qū)段的核苷酸序列在本文中提供為SEQ ID NO:6。該核苷酸序列的小部分為提供為SEQ ID NO:5的插入的轉(zhuǎn)基因DNA。側(cè)翼連接插入的轉(zhuǎn)基因DNA的5’末端和插入的DNA的5’末端的一部分的基因組DNA的核苷酸序列在本文中提供為SEQ ID NO:3。側(cè)翼連接插入的轉(zhuǎn)基因DNA的3’末端和插入的DNA的3’末端的一部分的基因組DNA的核苷酸序列在本文中提供為SEQ ID NO:4。橫跨其中轉(zhuǎn)基因DNA連接于和聯(lián)接于基因組DNA的位置的區(qū)域,在本文中稱為接合處(junction)?！敖雍闲蛄?junctionsequence) ”或“接合區(qū)域(junction region) ”是指橫跨插入的轉(zhuǎn)基因DNA和相鄰側(cè)翼基因組DNA的DNA序列和/或相應DNA分子。事件MON 88302的接合序列的實例在本文中提供為SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。來源于蕓苔屬植物或種子的核苷酸分子中這些接合序列之一的鑒定確定了 DNA獲自事件MON 88302并且被診斷為來自事件MON 88302的DNA在樣品中的存在。SEQ ID NO:1為橫跨基因組DNA與插入的DNA的5’末端之間的接合處的60個核苷酸的序列。SEQ ID NO:7為橫跨基因組DNA與插入的DNA的5’末端之間的接合處的100個核苷酸的序列。SEQ ID NO:2為橫跨基因組DNA與插入的DNA的3’末端之間的接合處的60個核苷酸的序列。SEQ ID NO:8為橫跨基因組DNA與插入的DNA的3’末端之間的接合處的100`個核苷酸的序列。來源于轉(zhuǎn)基因事件MON88302的包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的DNA的任何區(qū)段在本發(fā)明的范圍內(nèi)。來源于轉(zhuǎn)基因事件MON 88302的包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的DNA的任何區(qū)段在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，包含與本段落內(nèi)描述的任何序列互補的序列的任何多核苷酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)。圖1舉例說明了 SEQ ID NO:1-5和SEQ ID NO:7_8相對于從5’至3’排列的SEQID NO:6的物理排列。本發(fā)明還提供了包含DNA分子的核酸分子，所述DNA分子具有與SEQID NO:6的全長具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。本發(fā)明提供了可用作用于診斷來源于事件MON 88302的DNA在樣品中的存在的引物或探針的示例性DNA分子。此類引物或探針對于靶核酸序列是特異性的，因此對于利用本文中描述的本發(fā)明的方法鑒定事件MON 88302核酸序列是有用的?！耙铩蓖ǔＪ歉叨燃兓姆蛛x的多核苷酸，其被設計來用于包括熱擴增的特異性退火或雜交法?？蓪⒁粚σ锱c模板DNA例如歐洲油菜基因組DNA的樣品一起用于熱擴增，例如聚合酶鏈式反應(PCR)，以產(chǎn)生擴增子，其中從這樣的反應產(chǎn)生的擴增子可具有相應于位于其中引物與模板雜交的兩個位點之間的模板DNA的序列的DNA序列。如本文中所用，“擴增子”為一條或一段已使用擴增技術(shù)合成的DNA，即擴增反應的產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個實施方案中，診斷事件MON 88302的擴增子包括未在歐洲油菜基因組中天然存在的序列。本發(fā)明的擴增子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2及其互補序列的至少約40個連續(xù)核苷酸。引物通常被設計來與互補靶DNA鏈雜交以形成引物與靶DNA鏈之間的雜種，并且引物的存在是被聚合酶識別以開始使用靶DNA鏈作為模板延伸引物(S卩，另外的核苷酸至不斷延長的多核苷酸分子內(nèi)的聚合)的點。如本發(fā)明中所用，引物對意指為了線性擴增被引物對的單個成員靶向結(jié)合的位置之間的多核苷酸區(qū)段，通常在熱擴增反應或其它常規(guī)核酸擴增法中使用兩個結(jié)合雙鏈核苷酸區(qū)段的相反鏈的引物。用作引物的示例性DNA分子提供為SEQID NO:9-10o提供為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10的引物對可用作第一 DNA分子和與第一 DNA分子不同的第二 DNA分子，并且兩個分子各自具有充分長度的SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的連續(xù)核苷酸或其互補序列以用作DNA引物，以便當與來源于事件MON 88302的模板DNA—起用于熱擴增反應中時，可產(chǎn)生對于轉(zhuǎn)基因事件MON 88302的3’部分是特異性和獨特的擴增子。該示例性引物對可用于擴增診斷事件MON 88302的3’接合區(qū)域。類似地，本發(fā)明提供了可用于擴增診斷事件MON 88302的5’接合區(qū)域的引物對。此類引物可包含第一 DNA分子和與第一 DNA分子不同的第二 DNA分子，兩者具有充分長度的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的連續(xù)核苷酸或其互補序列以用作DNA引物，以便當與來源于事件MON 88302的模板DNA —起用于熱擴增反應時，可產(chǎn)生對于轉(zhuǎn)基因事件MON 88302的5’部分是特異性和獨特的擴增子?！疤结槨睘榕c靶核酸的鏈互補的分離的核酸。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸而且還包括特異性結(jié)合靶DNA序列的聚酰胺和其它探針材料，并且這樣的結(jié)合的檢測在診斷、鑒別、確定或確認該靶DNA序列在特定樣品中的存在中是有用的?？蓪⑻结樳B接于常規(guī)可檢測標記或報道分子例如放射性同位素、配體、化學發(fā)光劑或酶。在本發(fā)明的一個實施方案中，診斷事件MON 88302的探針包括未在歐洲油菜基因組中天然存在的序列。用作探針的示例性DNA分子提供為SEQ ID NO =Il0根據(jù)本發(fā)明的探針和引物可與靶序列具有完全序列同一性，雖然可通過常規(guī)方法設計與靶序列不同的保持優(yōu)先與靶序列雜交的能力的引物和探針。為了核酸分子能夠用作引物或探針，其僅需在序列上充分互補以能夠在所使用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。任何常規(guī)核酸雜交或擴增方法可用于鑒定來自事件MON 88302的轉(zhuǎn)基因DNA在樣品中的存在。探針和引物在長度上通常為至少約11個核苷酸、至少約18個核苷酸、至少約24個核苷酸或至少約30個核苷酸或更多個核苷酸。此類探針和引物在嚴格雜交條件下與祀DNA序列特異性雜交。常規(guī)嚴格條件由Sambrook等人，1989和由Haymes等人在:Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington,DC(1985)中描述。如本文中所用，如果兩個核酸能夠形成反向平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則兩個核苷酸分子被認為能夠彼此特異性雜交。如果核酸分子顯示完全互補性，則它們被認為是另一個核酸分子的“互補序列”。如本文中所用，當分子之一的每一個核苷酸與另一個分子的核苷酸互補時，則分子被認為顯示“完全互補性”。如果兩個分子以足以允許它們在至少常規(guī)“低嚴格”條件下保持彼此退火的穩(wěn)定性彼此雜交，則它們被認為是“最低程度互補”。類似地，如果分子可以以足以允許它們在常規(guī)“高嚴格”條件下保持彼此退火的穩(wěn)定性彼此雜交，則它們被認為是“互補的”。因此偏離完全互補性是可允許的，只要這樣的偏離不完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。 如本文中所用，術(shù)語“分離的”是指至少部分地將分子與通常在其自體或天然狀態(tài)中與其聯(lián)接的其它分子分離。在一個實施方案中，術(shù)語“分離的”是指這樣的DNA分子，其至少部分地與在自體或天然狀態(tài)中通常側(cè)翼連接所述DNA分子的核酸分離。因此，例如作為重組技術(shù)的結(jié)果融合于它們通常不與其聯(lián)接的調(diào)控或編碼序列的DNA分子在本文中被認為是分離的。此類分子即使當整合入宿主細胞的染色體或與其它DNA分子一起存在于核酸溶液中時亦被認為是分離的。本領域技術(shù)人員公知的許多方法可用于分離和操作本發(fā)明中公開的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶鏈式反應)技術(shù)可用于擴增特定起始DNA分子和/或產(chǎn)生原始分子的變體。DNA分子或其片段還可通過其它技術(shù)例如通過利用化學方法直接合成片段(這通常通過使用自動寡核苷酸合成儀來實施)來獲得。因此本文中提供的DNA分子和相應的核苷酸序列尤其對于鑒定事件MON 88302，選擇包含事件MON 88302的植物品種或雜種，檢測來源于事件MON 88302的DNA在樣品中的存在，和監(jiān)測樣品的事件MON 88302的存在和/或不存在或包含事件MON 88302的植物和植物部分是有用的。本發(fā)明提供了植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織、纖維和葉)以及商業(yè)產(chǎn)品。此類植物、后代、種子、植物細胞、植物部分和商業(yè)產(chǎn)品包含可檢測量的本發(fā)明的多核苷酸，即例如具有提供為SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列的至少一個的多核苷酸。本發(fā)明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分還可包含一個或多個另外的轉(zhuǎn)基因。這樣的轉(zhuǎn)基因可以是編碼賦予期望的性狀(包括但不限于增強的昆蟲抗性、增加的水分利用效率、增加的產(chǎn)量性能、增強的抗旱性、增強的種子質(zhì)量、疾病抗性、改良的營養(yǎng)質(zhì)量和/或增強的除草劑耐受性)蛋白質(zhì)或RNA分子的任何核苷酸序列，其中相對于缺乏這樣的另外的轉(zhuǎn)基因的可比較植物測量期望的性狀。本發(fā)明提供了來源于包含事件MON 88302的轉(zhuǎn)基因植物的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織以及葉。為了使得能夠進行本發(fā)明，已按照布達佩斯協(xié)議保藏了 包含事件MON 88302的種子的代表性樣品。經(jīng)選擇用于接收保藏物的貯藏處為美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址為10801 University Boulevard,Manassas, Virginia USA, Zip Code 20110。ATCC 忙藏處已給事件 MON 88302 種子分配了登錄號 PTA-10955。本發(fā)明提供了在其基因組中包含具有SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID N0:7或SEQ ID NO:8的DNA分子的微生物。這樣的微生物的實例為轉(zhuǎn)基因植物細胞。微生物例如本發(fā)明的植物細胞在許多工業(yè)應用中是有用的，所述工業(yè)應用包括但不限于:(i)用作用于科學調(diào)查或工業(yè)研究的研究工具；(ii)用于用于產(chǎn)生可用于隨后的科學研究或用作工業(yè)產(chǎn)品的內(nèi)源或重組碳水化合物、脂質(zhì)、核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)物或小分子的培養(yǎng)；和(iii)與現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)技術(shù)一起使用以產(chǎn)生隨后可用于農(nóng)業(yè)研究或生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物或植物組織培養(yǎng)物。微生物例如轉(zhuǎn)基因植物細胞的產(chǎn)生和使用利用現(xiàn)代微生物學技術(shù)和人干預來產(chǎn)生人造的獨特的微生物。在該方法中，將重組DNA插入植物細胞的基因組以產(chǎn)生與天然存在的植物細胞分離且獨特的轉(zhuǎn)基因植物細胞。該轉(zhuǎn)基因植物細胞可隨后使用現(xiàn)代微生物技術(shù)進行培養(yǎng)(與細菌和酵母細胞非常相似)，并且可以以未分化的單細胞狀態(tài)存在。新型植物細胞的遺傳組成和表型為通過將異源DNA整合入細胞的基因組產(chǎn)生的技術(shù)作用。本發(fā)明的另一個方面為使用本發(fā)明的微生物的方法。使用本發(fā)明的微生物例如轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法包括(i)通過將重組DNA整合入細胞的基因組，隨后使用該細胞衍生具有相同異源DNA的另外的細胞來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞的方法；(ii)使用現(xiàn)代微生物技術(shù)培養(yǎng)包含重組DNA的細胞的方法；(iii)從培養(yǎng)細胞產(chǎn)生并且純化內(nèi)源或重組碳水化合物、脂質(zhì)、核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法；和(iv)使用現(xiàn)代植組織培養(yǎng)技術(shù)利用轉(zhuǎn)基因植物細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物組織培養(yǎng)物的方法。如本文中所用，“后代”包括從具有提供為SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列的至少一個的祖先植物和/或多核苷酸衍生的包含事件DNA的任何植物、種子、植物細胞和/或可再生植物部分。植物、后代和種子對于轉(zhuǎn)基因可以是純合的或雜合的。后代可從由包含事件MON 88302的植物產(chǎn)生的種子和/或從由利用包含事件MON 88302的植物的花粉授精的植物產(chǎn)生的種子生長而來?？蓪⒑蟠参镒曰ㄊ芊?也稱為“自交”)以產(chǎn)生植物的純育品系，即對于轉(zhuǎn)基因是純合的植物。適當?shù)暮蟠淖越豢僧a(chǎn)生對于兩個添加的外源基因是純合的植物?；蛘?，可將后代植物與另一種植物異型雜交例如交配，以產(chǎn)生品種或雜種種子或植物。另一種植物可以為轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的。本發(fā)明的品種或雜種種子或植物因此可通過如下步驟來衍生:將不存在事件MON 88302的特異性和獨特的DNA的第一親本與包含事件MON 88302的第二親本雜交，從而導致包含事件MON 88302的特異性和獨特的DNA的雜種。每一個親本可以為雜種或近交種(inbred)/品種，只要雜交或交配導致本發(fā)明的植物或種子，即具有至少一個包含事件MON 88302的特異性和獨特的DNA和/或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的等位基因的種子。因此可將兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物交配以產(chǎn)生包含兩個獨立地分離的額外的外源基因的雜種后代。例如,可將包含事件MON 88302的耐受草甘膦的植物與另一種轉(zhuǎn)基因植物雜交以產(chǎn)生具有兩個轉(zhuǎn)基因親本的特征的植物。該方法的一個實例為包含事件MON 88302的耐受草甘膦的蕓苔屬植物與具有一個或多個另外的性狀的蕓苔屬植物例如芥菜或油菜的雜交，從而導致耐受草甘膦并且具有一個或多個另外的性狀的后代植物或種子。具 有期望的轉(zhuǎn)基因性狀的蕓苔屬植物在本領域是已知的，包括但不限于具有除草劑耐受性(例如，事件RT200、事件RT73、事件MS1、事件RF1、事件RF2、Topas 19/2、MS8、RF3、T45)的性狀的蕓苔屬植物，雜交育種系統(tǒng)或繁育系統(tǒng)(fertilitysystem)(例如，事件MS1、事件MS8、事件RF1、事件RF2、事件Rf3)、昆蟲控制、增加的產(chǎn)量、疾病抗性(例如，核盤菌屬(ScleiOtinia)抗性、黑腿病抗性、甘藍根腫病抗性、鐮刀霉枯萎病(Fusarium Wilt)抗性)、改變的或改良的油的組成(例如，事件pCGN3828-212/86_18、事件pCGN3828-212/23)，它們?nèi)棵枋鲇诶缈晒搏@得的美國農(nóng)業(yè)部(USDA)動植物衛(wèi)生檢疫處(Animal and Plant Health Inspection Service) (APHIS)非管制狀態(tài)申請列表。具有期望的非轉(zhuǎn)基因性狀的蕓苔屬植物在本領域是已知的，包括但不限于性狀:除草劑耐受性(例如，1471 (對于咪唑啉酮耐受性)、CLB-1 (對于咪唑啉酮耐受性)、TTC(對于三嗪耐受性))、病原體抗性、昆蟲控制、增加的產(chǎn)量、疾病抗性(例如，核盤菌屬抗生、黑腿病抗性、甘藍根腫病抗性、鐮刀霉枯萎病抗性)、改變的或改良的油的組成(包括低亞麻酸和/或高油酸)、改變的化學和/或營養(yǎng)組成、改變的蛋白質(zhì)組成、冷耐受性、干旱耐受性、改變的成熟和/或開花以及其它改變的或改良的農(nóng)藝學性質(zhì)。還涉及對親本植物的回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異型雜交，同樣地涉及營養(yǎng)繁殖。通常用于不同性狀和作物的其它育種方法的描述可見于幾篇參考文獻之一，例如，F(xiàn)ehr，參見Breeding Methods for Cultivar Development,WiIcox J.編輯,American Society ofAgronomy, Madison WI (1987)中。本發(fā)明提供了來源于包含事件MON 88302的植物的植物部分。如本文中所用，“植物部分”是指由從包含事件MON 88302的植物衍生的材料組成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織、纖維及葉。植物部分可以是能活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。本發(fā)明提供了從包含事件MON 88302的植物衍生的商業(yè)產(chǎn)品。如本文中所用商業(yè)產(chǎn)品”是指由從包含事件MON 88302的植物、種子、植物細胞或植物部分衍生的材料組成的任何組合物或產(chǎn)品。商業(yè)產(chǎn)品可售予消費者并且可以是能活的或不能存活的。不能存活的商業(yè)產(chǎn)品包括但不限于不能存活的種子和谷物；經(jīng)處理的種子、種子部分和植物部分；脫水的植物組織、冷凍的植物組織和經(jīng)處理的植物組織；經(jīng)處理用于陸生和/或水生動物消費的動物飼料的植物、油、谷物粗粉(meal)、面粉、薄片、麩、纖維和用于人消費的任何其它食品；和生物質(zhì)及燃料 產(chǎn)品。能活的商業(yè)產(chǎn)品包括但不限于種子和植物細胞。因此包含事件MON 88302的植物可用于制造通常從蕓苔屬植物獲得的任何商業(yè)產(chǎn)品。從包含事件MON88302的植物衍生的任何此類商業(yè)產(chǎn)品可包含至少可檢測量的相應于事件MON 88302的特異性和獨特的DNA，并且特別地可包含可檢測量的包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少40個連續(xù)核苷酸的多核苷酸?？墒褂脵z測多核苷酸分子的任何標準方法，包括本文中公開的檢測方法。如果在商業(yè)產(chǎn)品中存在任何可檢測量的SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2，那么商業(yè)產(chǎn)品在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此本發(fā)明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織及葉)以及商業(yè)產(chǎn)品尤其對于生長植物以產(chǎn)生用于農(nóng)業(yè)目的的包含事件MON88302的種子和/或植物部分、產(chǎn)生用于植物育種和研究目的的包含事件MON 88302的后代是有用的，可與用于工業(yè)和研究應用的微生物學技術(shù)一起使用和售予消費者。本發(fā)明提供了用于控制田地中的雜草的方法。提供了用于控制田地中雜草的方法，其由在田地中種植包含事件MON 88302的植物和為了控制田地中的雜草對田地施用至少一個除草上有效的劑量的草甘膦(而不損傷包含MON 88302的植物)組成。還提供了用于控制田地中的雜草的另一種方法，其由如下步驟組成:給田地施用至少一個除草上有效的劑量的草甘膦，隨后在田地中種植包含事件MON 88302的作物。可單獨地或組合地使用本發(fā)明的方法。草甘膦的施用可以在種植前(即，在種植包含事件MON 88302的種子之前的任何時間，包括但不限于約種植前14天至約種植前I天或與播種包含事件MON 88302的種子同時)、出苗前(即，在種植包含事件MON 88302的種之后和在包含事件MON 88302的植物出苗之前的任何時間)和/或出苗后(即，在包含事件MON 88302的植物出苗后的任何時間)進行。在實施本發(fā)明的方法中，可在生長季節(jié)中使用草甘膦的多次施用，例如兩次施用(例如種植前施用和出苗后施用或出苗前施用和出苗后施用)或三次施用(例如，種植前施用、出苗前施用和出苗后施用)。在生長季節(jié)中施用的總草甘膦因此可包括一個或多個季節(jié)內(nèi)施用，其中多次季節(jié)內(nèi)施用的總和加起來產(chǎn)生施用的總草甘膦。如本文中所用，有效地控制雜草生長的草甘膦的量，即在田地中用作作物內(nèi)(in-crop)施用以控制田地中雜草生長的草甘膦的除草上有效的劑量，應當由在整個生長季節(jié)中在總共約0.125磅草甘膦每英畝與約6.4磅草甘膦每英畝之間的范圍組成。例如，用于在田間用作作物內(nèi)施用的草甘膦的除草上有效的劑量在整個生長季節(jié)可以為總共至少約0.125、約0.5、約1.0、約1.6、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0或約6.4磅每英畝。提供了用于產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)基因事件MON 88302的耐受除草劑植物的方法。此類方法中使用的轉(zhuǎn)基因植物對于轉(zhuǎn)基因可以是純合的或雜合的。通過此類方法產(chǎn)生的后代植物可以是品種或雜種植物；可從由植物產(chǎn)生的種子和/或從由利用包含事件MON 88302的植物的花粉授精的植物產(chǎn)生的包含事件MON 88302的種子生長而來；以及對于轉(zhuǎn)基因可以是純合的或雜合的。隨后可將后代植物自花受粉以產(chǎn)生植物的純育品系，即對于轉(zhuǎn)基因是純合的植物，或可選擇地將后代植物異型雜交，例如與另一種無關植物交配以產(chǎn)生品種或雜種種子或植物。

可通過將包含事件MON 88302的含有包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的序列的多核苷酸分子的植物與另一種植物有性雜交并從而產(chǎn)生種子(隨后將所述種子生長成后代植物)來產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的施用的植物。隨后可利用草甘膦除草劑處理此類后代植物以選擇耐受草甘膦除草劑的后代植物。或者，可使用診斷方法分析此類后代植物以選擇包含事件MON 88302DNA的后代植物。雜交中使用的其它植物可以耐受或可以不耐受草甘膦除草劑以及可以為或可以不為轉(zhuǎn)基因的。所產(chǎn)生的后代植物和/或種子可以為品種或雜種種子。在實施本方法中，可通過人工干預，例如:通過人手工收集一種植物的花粉和將該花粉與第二種植物的花柱(style)或柱頭接觸；通過人手工和/或人行動除去、破壞或覆蓋植物的雄蕊或花藥(例如，通過人工干預或通過施用化學殺配子劑)以便防止天然自花受粉并且使得必將發(fā)生異花受粉以使受精發(fā)生；通過在進行“定向受粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，通過在果園或田間放置蜂箱或通過用傳粉昆蟲籠框植物(cagingplants));通過人工打開或除去花的部分以允許外來花粉置于花柱或柱頭上或接觸花柱或柱頭；通過選擇性放置植物(例如，有意地在傳粉距離之內(nèi)種植植物)；和/或通過施用化學藥品以促成開花或促進感受性(柱頭對花粉的)來完成或促成將一種植物與另一種植物的有性雜交即異花受粉的步驟。耐受草甘膦除草劑的施用的植物可通過將包含事件MON 88302 (包含含有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的序列的多核苷酸分子)的植物自交和從而產(chǎn)生種子(隨后將所述種子生長成后代植物)來產(chǎn)生。隨后可用草甘膦除草劑處理這些后代植物以選擇耐受草甘膦除草劑的后代植物?；蛘?，可使用診斷方法分析此類后代植物以選擇包含事件MON 88302DNA的后代植物。在實施本方法中,可通過人工干預,例如:通過人手工收集植物的花粉和將該花粉與相同植物的花柱或柱頭接觸，和隨后任選地阻止植物的進一步受粉；通過人手工和/或人行動除去、破壞或覆蓋其它附近植物的雄蕊或花藥(例如，通過去雄或通過施用化學殺配子劑)以便防止天然異花受粉并且使得必將發(fā)生自花受粉以使受精發(fā)生；通過在進行“定向受粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，通過用傳粉昆蟲籠框單獨的植物)；通過人工操作花或其部分以允許自花受粉；通過選擇性放置植物(例如，有意地在傳粉距離之外種植植物)；和/或通過施用化學藥品以促成開花或促進感受性(柱頭對花粉的)來完成或促成將一種植物與其自身有性雜交即自花受粉或自交的步驟。由此類方法包括的和通過使用此類方法產(chǎn)生的后代植物和種子與其它植物截然不同，例如因為所述后代植物和種子:是重組的并且通過人工干預產(chǎn)生；為耐受草甘膦除草劑的；包含至少一個由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因DNA組成的等位基因；和/或包含可檢測量的選自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的多核苷酸序列。種子可選自單株后代植物，并且只要種子包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，其就可在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在實施本發(fā)明中，可將兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物雜交以產(chǎn)生包含兩個獨立地分離的異源基因的雜種后代。適當?shù)暮蟠淖越豢僧a(chǎn)生對于兩個基因都是純合的植物。還涉及對親本植物的回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異型雜交，同樣地涉及營養(yǎng)繁殖。通常用于不同性狀和作物的其它方法的描述可見于幾個參考文獻之一例如aFehr，參見Breeding Methodsfor Cultivar Development 中，Wilcox J.編輯,American Society of Agronomy,MadisonWI (1987)中。用于本文中公開的方法的植物和種子還可包含一種或多種另外的轉(zhuǎn)基因。這樣的轉(zhuǎn)基因可以是編碼賦予期望的性狀的蛋白質(zhì)或RNA分子的任何核苷酸序列，所述期望的性狀包括但不限于增強的昆蟲抗性、增加的水分利用效率、增加的產(chǎn)量性能、增強的抗旱性、增強的種子質(zhì)量、改良的營養(yǎng)質(zhì)量和/或增強的除草劑耐受性)，其中相對于缺乏這樣的另外的轉(zhuǎn)基因的植物測量期望的性狀。因此本發(fā)明的方法尤其對于控制田地中雜草同時生長植物以產(chǎn)生用于農(nóng)業(yè)或研究目的的包含事件MON 88302的種子和/植物部分，選擇用于植物育種或研究目的的包含事件MON 88302的后代，和產(chǎn)生包含事件MON 88302的后代植物和種子是有用的。可評估本發(fā)明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆莢、花、根或莖組織及葉)和商業(yè)產(chǎn)品的DNA組成、基因表達和/或蛋白質(zhì)表達。這樣的評估可通過使用標準方法例如PCR、northern印跡、southern分析、western印跡、免疫沉淀和ELISA或通過使用本文中提供的檢測法和/或檢測試劑盒來進行。提供了檢測對于事件MON 88302是特異性的材料在樣品中的存在的方法。一種方法由檢測對于包含事件MON 88302的細胞、組織或植物是特異性的DNA和來源于所述細胞、組織或植物的DNA的存在組成 。方法提供了待與引物對接觸的模板DNA樣品，所述引物對能夠在經(jīng)歷適合于熱擴增的條件時從事件MON 88302DNA產(chǎn)生擴增子，特別地包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2或其互補序列的至少40個連續(xù)核苷酸的擴增子。擴增子從來源于事件MON 88302的模板DNA分子產(chǎn)生，只要模板DNA分子結(jié)合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的特異性和獨特的核苷酸序列。擴增子可以為單鏈或雙鏈DNA或RNA，這取決于被選擇用于產(chǎn)生擴增子的聚合酶。該方法提供了檢測在任何這樣的熱擴增反應中產(chǎn)生的擴增子分子，和確認相應于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補序列的核苷酸在擴增子的序列中的存在。擴增子中相應于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補序列的核苷酸的檢測是事件MON 88302特異性DNA和從而包含事件MON 88302的生物材料在樣品中的存在的確定和/或診斷。提供了用于檢測相應于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的DNA分子在由來源于植物或植物組織的材料組成的樣品中的存在的另一種方法。方法由如下步驟組成:(i)從植物或從一組不同的植物提取DNA樣品，(ii)將DNA樣品與顯示SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的至少40個連續(xù)核苷酸的DNA探針分子接觸，(iii)允許探針和DNA樣品在嚴格雜交條件下雜交，和隨后(iv)檢測探針與靶DNA樣品之間的雜交事件。雜交組合物的檢測被診斷為SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4(視具體情況而定)在DNA樣品中的存在。雜交的不存在為轉(zhuǎn)基因事件在樣品中的不存在的替代性診斷?；蛘?，確定特定植物包含相應于SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的序列或其互補序列之任一或兩者為確定植物包含至少一個相應于事件MON 88302的等位基因。因此可能通過任何公知的核酸檢測方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交檢測本發(fā)明的核酸分子的存在。事件特異性PCR測定例如由Taverniers等人(J.Agric.Food Chem.,53 =3041-3052,2005)進行了論述，其中顯示了轉(zhuǎn)基因玉蜀黍品系Btll、Btl76和GA21以及轉(zhuǎn)基因事件RT73的事件特異性跟蹤系統(tǒng)。在本研究中，基于每一個事件的基因組/轉(zhuǎn)基因接合處的序列設計事件特異性引物和探針。轉(zhuǎn)基因植物事件特異性 DNA 檢測法已在美國專利 N0.6，893，826 ;6，825，400 ;6，740, 488 ;6，733,974 ；6，689，880 ;6，900，014 和 6，818，807 中進行了描述。提供了 DNA檢測試劑盒。一種類型的試劑盒包括至少一種具有足夠長度的SEQ IDN0:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的連續(xù)核苷酸(以用作對于檢測來源于轉(zhuǎn)基因事件MON88302的DNA在樣品中的存在是特異性的DNA引物或探針)的DNA分子。利用試劑盒檢測的DNA分子包含SEQ ID NO:1所示的序列的至少40個連續(xù)核苷酸?；蛘?試劑盒可包括至少一種具有足夠長度的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的連續(xù)核苷酸(以用作對于檢測來源于轉(zhuǎn)基因事件MON 88302的DNA在樣品中的存在是特異性的DNA引物或探針)的DNA分子。待利用試劑盒檢測的DNA分子包SEQ ID NO:2中所示的至少40個連續(xù)核苷酸。備選試劑盒使用其中將靶DNA樣品與上述引物對接觸，隨后進行足以產(chǎn)生包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少40個連續(xù)核苷酸的擴增子的核酸擴增反應的方法。擴增子的檢測和確定SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的不少于40個連續(xù)核苷酸或其互補序列在擴增子的序列中的存在被診斷為事件MON 88302特異性DNA在DNA樣品的存在。提供了足以用作DNA探針的DNA分子，其對于確定、檢測或?qū)τ谠\斷對于事件MON88302 DNA是特異性和獨特的DNA在樣品中的存在或甚至不存在是有用的。DNA分子包含SEQ ID NO:1或其互補序列的至少40個連續(xù)核苷酸，或SEQ ID NO:2或其互補序列的至少40個連續(xù)核苷酸。可利用本領域已知的多種核酸擴增法(包括熱擴增法)的任一方法實現(xiàn)核酸擴增。可通過使用來源于本文中提供的序列的引物，然后進行擴增子或克隆的DNA的標準DNA測序來驗證(和必要時校正)來自事件MON 88302 (包含事件MON 88302的代表性種子樣品以ATCC PTA-10955保藏)的異源DNA插入物、接合序列或側(cè)翼序列?？衫枚喾N技術(shù)檢測由此類方法產(chǎn)生的擴增子。一種這樣的方法為遺傳位點分析(Genetic Bit Analysis) (Nikiforov,等人Nucleic Acid Res.22:4167-4175,1994),其中設計了與相鄰的側(cè)翼基因組DNA序列和插入的DNA序列重疊的DNA寡核苷酸。將寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在熱擴增目標區(qū)域(使用插入的序列中的一個引物和相鄰側(cè)翼基因組序列中的一個引物)后，可將單鏈擴增子與固定的寡核苷酸雜交，并將其用作模板、使用DNA聚合酶和對于預期的下一個堿基是特異性的標記的ddNTP進行單堿基延伸反應。讀出可以是基于熒光或ELISA的。歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸，熒光或其它信號的檢測表示插入物/側(cè)翼序列的存在。

另一個方法為由Winge (Innov.Pharma.Tech.00:18-24, 2000)描述的焦憐酸測序技術(shù)。在該方法中，設計與相鄰基因組DNA和插入DNA接合處重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸與來自目標區(qū)域(一個引物在插入的序列中以及一個引物在側(cè)翼基因組序列中)的單鏈擴增子雜交，在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和螢光素存在的情況下進行溫育。分別單獨地添加ddNTP，摻入導致被測量的光信號。歸因于成功的擴增、雜交和單或多堿基延伸，光信號表示轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列的存在。由Chen,等人，(Genome Res.9:492-498,1999)描述的突光偏振為可用于檢測擴增子的方法。通過使用該方法，設計與基因側(cè)翼序列和插入的DNA接合處重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸與來自目標區(qū)域(一個引物在插入的DNA中并且一個引物在側(cè)翼基因組DNA序列中)的單鏈擴增子雜交，并且在DNA聚合酶和熒光標記的ddNTP存在的情況下進行溫育。單堿基延伸導致ddNTP的摻入。摻入可使用熒光計測量為偏振的改變。歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸，偏振的改變表示轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列的存在。通過使用由制造商提供的說明書，TAQMAN (PE Applied Biosystems, FosterCity, CA)也可用于檢測和/或定量DNA序列的存在。簡而言之，設計與基因組側(cè)翼序列和插入DNA接合處重疊的FRET寡核苷酸探針。在耐熱聚合酶和dNTP存在的情況下，循環(huán)FRET探針和擴增引物(一個引物在插入物DNA序列中并且一個引物在側(cè)翼基因組序列中)。FRET探針的雜交導致熒光部分的切割和釋放，與FRET探針上的猝滅部分分離。歸因于成功擴增和雜交，突光信號表不側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。已描述了分子信標在序列檢測中的用途，如Tyangi等人(Nature Biotech.14:303-308,1996)中所描述的。簡而言之,設計與側(cè)翼基因組序列和插入DNA接合處重疊的FRET寡核苷酸。RRET探針的獨特結(jié)構(gòu)導致其包含使熒光與猝滅部分保持緊密靠近的二級結(jié)構(gòu)。在耐熱聚合酶和dNTP存在的情況下循環(huán)FRET探針和擴增引物(一個引物在插入DNA物序列中并且一個引物在側(cè)翼基因組序列中)。在成功的擴增后，F(xiàn)RET探針對靶序列的雜交導致探針二級結(jié)構(gòu)的消除以及熒光部分與猝滅部分的空間分離，從而導致熒光信號的產(chǎn)生。歸因于成功的擴增和雜交而，突光信號`表不側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入物序列的存在。其它描述的方法例如微流體學(microfluidics)(美國專利公布N0.2006068398、美國專利N0.6，544，734)提供了分離和擴增DNA樣品的方法和裝置。用于檢測和測量特異性DNA分子的光學染料(W0/05017181)。包括用于檢測結(jié)合特異性DNA分子并且隨后可被檢測的DNA分子或納米珠粒的電子傳感器的納米管裝置(W0/06024023)?？墒褂帽疚闹泄_的組合物和DNA檢測領域內(nèi)公知的方法來開發(fā)DNA檢測試劑盒。試劑盒用于鑒定樣品中的事件MON 88302并且可被用于培養(yǎng)包含適當?shù)氖录﨑NA的植物的方法。試劑盒可包含與SEQ ID NO:1-6或其片段或互補序列相似或互補的DNA引物或探針。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法因而尤其對于鑒定事件MON 88302事件，選擇包含事件MON 88302的植物品種或雜種，檢測來源于事件MON 88302的DNA在樣品中的存在，和監(jiān)測樣品的事件MON 88302的存在或不存在或包含事件MON 88302的植物、植物部分或商業(yè)產(chǎn)品是有用的。下列實施例被包括用來舉例說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案的實例。本領域技術(shù)人員應當理解，下列實施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)非常適合于本發(fā)明的實施，從而被認為構(gòu)成用于其實施的優(yōu)選模式的實例的方法。然而，鑒于本公開內(nèi)容，本領域技術(shù)人員應當理解可在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下在公開的特定實施方案中進行許多改變，并且獲得類似或相似的結(jié)果。
實施例實施例1:歐洲油菜的轉(zhuǎn)化和MON 88302事件的選擇本實施例描述了如何產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因事件和如何選擇事件MON 88302。通過利用圖1中舉例說明的轉(zhuǎn)基因DNA進行歐洲油菜細胞的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因事件MON 88302，所述轉(zhuǎn)基因的DNA序列示于SEQ ID NO:5。提供為SEQ ID NO:5的轉(zhuǎn)基因插入物為包含嵌合啟動子的表達盒，其如下部分組成:來源于玄參花葉病毒的35S增強子(E-FMV.35S)的增強子分子，該增強子分子有效地聯(lián)接于來源于擬南芥Tsfl基因的啟動子分子(P-At.Tsfl)，所述啟動子分子有效地聯(lián)接于來源于擬南芥Tsfl基因的前導序列分子(L-At.Tsfl);所述前導序列分子有效地聯(lián)接于來自擬南芥Tsfl基因(1-At.Tsfl)的內(nèi)含子序列；所述內(nèi)含子序列有效地聯(lián)接于編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的DNA分子(CTP2，擬南芥EPSPS);編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的DNA分子有效地聯(lián)接于編碼抗草甘膦EPSPS的DNA分子(CP4-syn);所述編碼抗草甘膦EPSPS的DNA分子有效地聯(lián)接于來源于豌豆基因的3’UTRDNA 分子(T-RbcS2, E9)。首先使用農(nóng)桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化，利用5個表達盒之一各自轉(zhuǎn)化來自歐洲油菜的外植體。隨后在含有草甘膦的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的細胞，將存活的細胞再生成植物。產(chǎn)生超過23，000個外植體，從所述外植體產(chǎn)生224個總的個體RO事件，并將其用于隨后的篩選(表I)。表1:歐洲油菜的轉(zhuǎn)化和MON 88302事件的選擇
權(quán)利要求
1.一種分子，其包含:a.具有選自SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和SEQ ID NO:8的序列的多核苷酸分子； b.具有與SEQID NO:6具有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸分子；或 c.具有與(a)或(b)互補的序列的多核苷酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子來源于事件MON88302，包含事件MON 88302事件的種子的代表性樣品已于ATCC登錄號PTA-10955下保藏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子包含在蕓苔屬植物、植物細胞、種子、后代植物、植物部分或商業(yè)產(chǎn)品中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子為從來源于事件MON88302的DNA的模板分子產(chǎn)生的擴增子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子被診斷為事件MON88302的存在。
6.一種診斷事件88302的存在的多核苷酸探針，其中所述多核苷酸探針具有充分長度以結(jié)合包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸分子，并且其中所述多核苷酸探針在嚴格雜交條件下與包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的DNA分子雜交，并且在嚴格雜交條件下不與不包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA分子雜交。
7.一種用于檢測來源于事件MON 88302的DNA分子在DNA樣品中的存在的方法，所述方法包括: a.將DNA樣品與根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸探針接觸； b.將所述樣品和所述多核苷酸探針經(jīng)歷嚴格雜交條件；和 c.檢測所述多核苷酸探針對所述DNA分子的雜交 其中所述雜交的檢測診斷所述來源于事件MON 88302的DNA分子在所述DNA樣品中的存在。
8.對由第一 DNA分子和與所述第一 DNA分子不同的第二 DNA分子組成的DNA分子，其中所述DNA分子包含具有擁有充分長度的SEQ ID NO:6的連續(xù)核苷酸或其互補序列的核苷酸序列的多核苷酸分子，以用作當與來源于事件MON 88302的模板一起用于擴增反應中時產(chǎn)生診斷樣品中的事件MON 88302 DNA的擴增子的DNA引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA分子對，其中所述擴增子包含選自SEQID NO:1和SEQID NO: 2的核苷酸序列。
10.一種檢測來源于事件MON 88302的DNA分子在DNA樣品中的存在的方法，所述方法包括: a.將DNA樣品與根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA分子對接觸； b.進行足以產(chǎn)生包含具有SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的至少40個連續(xù)核苷酸的多核苷酸分子的擴增子的擴增反應；和 c.檢測所述擴增子， 其中所述擴增子的檢測被診斷為所述來源事件MON 88302的DNA分子在所述DNA樣品中的存在。
11.一種包括至少一種多核苷酸分子的DNA檢測試劑盒，所述多核苷酸分子包含具有充分長度的SEQ ID NO:6的連續(xù)核苷酸和其互補序列，以用作對于檢測來源于事件MON88302的DNA的存在是特異性的DNA引物或多核苷酸探針，其中所述DNA的檢測被診斷為所述事件MON 88302 DNA在樣品中的存在。
12.一種包含多核苷酸分子的植物、種子、細胞或其植物部分，所述多核苷酸分子具有選自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物、種子、細胞或其植物部分，其中所述植物、種子、細胞或其植物部分耐受草甘膦除草劑處理。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物、種子、細胞或其植物部分，其基因組，當在DNA擴增法中測試時，產(chǎn)生診斷事件MON 88302的擴增子。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物部分，其中所述植物部分選自花粉、胚珠、豆莢、花、根組織、莖組織或葉組織。
16.一種包含事件MON 88302的植物、種子、細胞或其植物部分，包含事件MON 88302的種子的代表性樣品已于ATCC登錄號PTA-10955下被保藏。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植物、種子、細胞或其植物部分，其中所述植物、種子、細胞或其植物部分耐受草甘膦除草劑處理。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植物或種子，其中所述植物或種子為具有至少一個來源于事件MON 88302的親本的雜種。
19.一種當在DNA擴增法中測試時能夠產(chǎn)生診斷事件MON 88302的擴增子的種子、植物或其部分，其中所述擴增 子包含具有選自SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的序列的 DNA 分子。
20.一種來源于事件MON 88302的無生命植物材料，所述事件MON 88302包含選自SEQID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的 DNA分子。
21.一種包含多核苷酸分子的微生物，所述多核苷酸分子具有選自SEQ ID NO:U SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的核苷酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微生物，其中所述微生物為植物細胞。
23.一種來源于包含事件MON 88302的植物、種子、細胞或其植物部分的商業(yè)產(chǎn)品。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述商業(yè)產(chǎn)品包含具有選自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的核苷酸序列的DNA分子。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述商業(yè)產(chǎn)品選自完整或經(jīng)加工的種子、動物飼料、油、谷物粗粉、面粉、薄片、麩、生物質(zhì)和燃料產(chǎn)品。
26.一種用于控制包括包含事件MON 88302的植物的田地中雜草的方法，所述方法包括利用有效地控制所述田地中的雜草生長的量的草甘膦處理田地而不損傷所述包含事件MON 88302的植物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述有效地控制雜草的生長的草甘膦的量為約0.125磅至約6.4磅每英畝。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述有效地控制雜草的生長的草甘膦的量為約.1.6磅每英畝。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中在所述包含事件MON88302的植物的6葉期后對田地進行所述處理。
30.一種產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的施用的蕓苔屬植物的方法，包括: a.將耐受草甘膦的包含事件MON88302的蕓苔屬植物與第二蕓苔屬植物雜交，從而產(chǎn)生種子； b.生長所述種子以產(chǎn)生多個后代植物； c.選擇包含事件MON88302的后代植物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述 的方法，其中所述選擇后代植物包括用草甘膦處理所述后代植物和選擇耐受草甘膦的后代植物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述選擇后代植物包括鑒定包含具有選自SEQID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的核苷酸序列的DNA分子的后代植物。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述第二蕓苔屬植物不存在對草甘膦除草劑的耐受性。
34.一種產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的施用的蕓苔屬植物的方法，包括: a.將耐受草甘膦的包含事件MON88302的事件蕓苔屬植物自交，從而產(chǎn)生種子； b.生長所述種子以產(chǎn)生多個后代植物； c.選擇包含事件MON88302的后代植物。
35.一種測定事件MON 88302植物或種子的接合性的方法，包括: a.將包含DNA的樣品與包含SEQID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID N0:14的引物組接觸，所述引物組當與來自事件MON 88302的基因組DNA—起用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生被診斷為事件MON 88302的第一擴增子； b.進行核酸擴增反應，從而產(chǎn)生所述第一擴增子； c.檢測所述第一擴增子； d.將包含DNA的所述樣品與所述引物組接觸，所述引物組，當與來自植物的基因組DNA一起用于核酸擴增反應時，產(chǎn)生第二擴增子，所述第二擴增子包含與鑒定為事件MON 88302的轉(zhuǎn)基因插入的基因組區(qū)域同源的自體基因組DNA ； e.進行核酸擴增反應，從而產(chǎn)生所述第二擴增子； f.檢測所述第二擴增子；和 g.比較樣品中的所述第一和第二擴增子，其中兩個擴增子的存在表示所述樣品對于所述轉(zhuǎn)基因插入是雜合的。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含轉(zhuǎn)基因事件MON 88302的植物，所述植物顯示對草甘膦除草劑的耐受性。本發(fā)明還提供了與所述事件相關的種子、植物部分、細胞、商業(yè)產(chǎn)品和方法。本發(fā)明還提供了對于事件是獨特的并且通過將轉(zhuǎn)基因DNA插入歐洲油菜植物的基因組產(chǎn)生的DNA分子。
文檔編號C12N15/82GK103096712SQ201180027546
公開日2013年5月8日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者A·J·布朗, J·F·伯恩, R·H·科爾, J·H·克勞利, J·A·米克洛斯, R·C·里普利, S·賽弗特-希金斯, 謝嘉麗 申請人:孟山都技術(shù)公司