專利名稱：用于將轉(zhuǎn)基因插入安全港座位的內(nèi)切核酸酶的用途的制作方法
用于將轉(zhuǎn)基因插入安全港座位的內(nèi)切核酸酶的用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能切割位干“安全港座位”，即允許轉(zhuǎn)基因的安全的表達(dá)的座位的靶序列的內(nèi)切核酸酶。本發(fā)明還涉及該內(nèi)切核酸酶用于將轉(zhuǎn)基因插入細(xì)胞，組織或生物的用途。
背景技木大范圍核酸酶大范圍核酸酶，也稱之為尋靶內(nèi)切核酸酶，是在活細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)雙-鏈斷裂和重組中使用的第 I 內(nèi)切核酸酶(Rouet et al.PNAS 1994 91:6064-6068; Rouet et al.Mol CellBiol.199414:8096-8106;Choulika et al.Mol Cell Biol.199515:1968-1973;Puchta etal.PNAS 1996 93:5055-5060)。但是，它們的使用長期被它們的窄特異性限制。盡管已在過去數(shù)年鑒定幾百種天然的大范圍核酸酶，此多祥性仍大大地不足以解釋基因組復(fù)雜性，其在目標(biāo)基因之內(nèi)發(fā) 現(xiàn)大范圍核酸酶切割位點(diǎn)的概率仍極其低。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了對以與天然的內(nèi)切核酸酶相同的選擇性切割選擇的序列的具有剪裁的特異性的人工內(nèi)切核酸酶的需求。大范圍核酸酶作為衍生切割期望的靶序列的基因組加工工具的選擇支架新出現(xiàn)了(Paques et al.Curr Gen Ther.20077:49-66)。允許加工具有修飾的特異性的大范圍核酸酶的組合的組裝過程已描述于 Arnould et al.J Mol Biol.2006 355:443-458 ; Arnouldet al.J Mol Biol.2007 371:49-65;Smith et al.NAR 200634:el49;Grizot et al.NAR2009 37:5405。簡言之，這些過程依賴于具有不同于野生型大范圍核酸酶的底物特異性僅少核苷酸的底物特異性的局部加工的變體的鑒定。在該蛋白中鑒定的達(dá)4組突變可然后組裝進(jìn)新蛋白，以便產(chǎn)生具有完全再設(shè)計(jì)的結(jié)合界面的新大范圍核酸酶。這些過程需要2個(gè)步驟，其中不同組的突變首先組裝進(jìn)切割回文靶的同源ニ聚體變體。2個(gè)同源ニ聚體可然后共表達(dá)，以便產(chǎn)生切割選擇的非回文靶的異源ニ聚體大范圍核酸酶。此過程的第I步驟仍是最挑戰(zhàn)性的，且不可提前知道是否可以絕對確定度獲得切割給定座位的大范圍核酸酶。的確，并非所有序列等同可能被加工的大范圍核酸酶切害1]，及在特定情況中，大范圍核酸酶加工可被證明難(Galetto et al.Expert Opin BiolTher.20099:1289-303)。適合于定點(diǎn)基因組修飾的其他酶已對于定點(diǎn)基因組修飾建議特化的酶如整合酶，重組酶，轉(zhuǎn)座酶和內(nèi)切核酸酶。數(shù)年來，這些酶的使用仍受到限制，由于向期望的靶位點(diǎn)再靶向它們的天然的特異性的挑戰(zhàn)。的確，這些蛋白的靶位點(diǎn)，或具有足夠的程度的序列同一性的序列，應(yīng)存在于與待校正的突變相鄰的序列中，或待滅活的基因之內(nèi)，通常不是在這種情況中，除了在預(yù)加工的序列的情況中。會允許在基因治療中使用這些DNA修飾酶的主要挑戰(zhàn)依賴于再設(shè)計(jì)它們的DNA結(jié)合性質(zhì)的可能性。已開發(fā)許多策略，g在獲得具有定制的底物特異性的人工蛋白。早期使用自鏈霉菌屬(Streptomyces)卩遼菌體PhiC31的整合酶用于在內(nèi)源性座位中的靶向的基因轉(zhuǎn)移。此酶介導(dǎo)通過在噬菌體附接位點(diǎn)(attP)和細(xì)菌附接位點(diǎn)(attB)之間定點(diǎn)反應(yīng)來將噬菌體基因組重組到細(xì)菌染色體(Kuhstoss et al.J Mol Biol 1991222:897-908; Rausch et al.NAR 1991 19:5187-5189)。此可自將 attB 位點(diǎn)攜帶進(jìn)與attP帶有部分同一‘丨生的天然基因組序列，稱之為假attP位點(diǎn)(attP’)的質(zhì)粒發(fā)生。PhiC31整合酶已用于轉(zhuǎn)移幾種轉(zhuǎn)基因，包括hFIX，到人基因組中(Olivares et al.Nat Biotech200220:1124-1128;Ginsburg et al.Adv Genet 2005 54:179-187;Calos Curr Gene Ther
20066:633-645;Chalberg et al.J Mol Biol 2006 357:28-48;Aneja et al.J Gene Med
20079:967-975)。其缺點(diǎn)是可發(fā)生整合的位點(diǎn)不可選擇(Chalberg et al.J Mol Biol2006 357:28-48)，及不得不依賴于人基因組座位之內(nèi)的假attP位點(diǎn)，用于精確的整合。然而主要整合位點(diǎn)見于第19染色體，已鑒定幾百個(gè)其他整合座位(Chalberg et al.J MolBiol 2006 357:28-48)。在新近工作中，將PhiC31整合酶突變，以便增加在attP’位點(diǎn)整合的效率和特異性，為靶向選擇的位點(diǎn)的加工的整合酶的開發(fā)鋪了路(Keravala et al.Mo ITher 2009 17:112-120)。但是，加工的整合酶的開發(fā)落后于聚焦于靶向的重組酶和內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的類似努力。

定點(diǎn)重組酶，諸如自卩遼菌體Pl的Cre重組酶，或自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Flp蛋白已用于誘導(dǎo)含有它們的同源位點(diǎn)的預(yù)加工的序列之間的重組。Cre重組酶認(rèn)識及介導(dǎo)在2個(gè)同一的稱之為1xP的34bp位點(diǎn)之間的重組(Abremski etal.Cell 1983 32:1301-1311)。許多年來，Cre來源的重組酶的限制一直是重復(fù)的1xP，或假1xP位點(diǎn)，必需存在，以便允許DNA在這2個(gè)位點(diǎn)之間整合。但是，此分子的DNA結(jié)合接ロ的定向進(jìn)化已用于創(chuàng)建具有新特異性的重組酶(Buchholz et al.Nat Biotech2001 19:1047-10使用DNA靶向酶誘導(dǎo)病毒序列的切除的框架。的確，用反轉(zhuǎn)錄病毒莫洛尼鼠白血病病毒載體系統(tǒng)的工作顯示了，當(dāng)1xP位點(diǎn)導(dǎo)入綜合反轉(zhuǎn)錄病毒載體的LTR中時(shí)，Cre的表達(dá)可導(dǎo)致2個(gè)1xP位點(diǎn)之間的全部序列的缺失(Choulika et al.J Virol1996 70:1792-1798)。更最近，加工的Cre重組酶變體已用于自細(xì)胞切下HIV I型原病毒(Sarkar et al.Science 2007 316:1912-1915)。重組酶再設(shè)計(jì)來靶向原病毒LTR，及用于誘導(dǎo)全部干擾序列的切除。加工嘗試也已用Flp重組酶靶向FRT (Flp重組靶)序列來進(jìn)行(Buchholzt et al.Nat Biotech 1998 16:657-662),及已獲得認(rèn)識非-天然 Flp 重組革巴的變體(Voziyanov et al.J Mol Biol 2003 326:65-76)。但是，在當(dāng)今無在非-預(yù)加工的座位中用該酶靶向的插入的例。轉(zhuǎn)座子諸如Piggy Back和Sleeping Beauty可提供將序列插入脊椎動物細(xì)胞的有效工具且已建議作為病毒介導(dǎo)的基因遞送的替代，達(dá)到持久的表達(dá)(Izsvak et al.Molther 2004 9:147-156;Ivies et al.Curr Gene Ther 2006 6:593-607;Mates et al.NatGenet 2009 41:753-761)。轉(zhuǎn)座子是基因遞送的天然的手段，其中存在于DNA分子中的DNA序列通過轉(zhuǎn)座酶的作用被插入另一位置。加工的SB轉(zhuǎn)座酶，稱之為SBlOOX最近顯示增加方法的效率(Mates et al.Nat Genet 2009 41:753-761)。轉(zhuǎn)座在基因組水平上是隨機(jī)的，例如，SB 整合進(jìn) TA 二核苷酸(Vigdal et al.J Mol Biol 2002 323:441-452)，且應(yīng)因此不被認(rèn)為是用于靶向的方法的工具。但是，進(jìn)一歩工作顯示了在人細(xì)胞中，通過將轉(zhuǎn)座酶催化性結(jié)構(gòu)域融合到特定DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由加工的轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)座的可能性(Ivies, et al.Mol Ther 2007 15:1137-1144)，給新類別的靶向的工具的開發(fā)鋪了路。基因治療
在幾乎10年前通過基因治療的幾個(gè)X-SCID患者的成功的治療是在基因治療領(lǐng)域最重要的里程碑之一。此巨大的成就之后是在解決不同疾病，包括另ー形式的SCID，大皰性表皮松解和利伯黑矇和其他的其他臨床試驗(yàn)中顯著成功。但是，這些初始成功長期被一系列嚴(yán)重的不利的事件，即X-SCID治療的患者中白血病的呈現(xiàn)掩蓋(Hacein-Bey-Abinaet al.Science 2003 302:415-419;Hacein-Bey-Abina et al.J Clin Invest.2008118:3132-3142;Howe et al.J Clin Invest.2008 118:3143-3150)。全部白血病的情況，但只有一例，可最終通過化學(xué)治療治療，及方法全局性地呈現(xiàn)為成功，但這些嚴(yán)重的不利效果凸顯了當(dāng)前基因治療方法的主要風(fēng)險(xiǎn)。由此本領(lǐng)域有對將基因插入受試者基因組的安全的方法的需求。這些日子開發(fā)用于治療遺傳的疾病的多數(shù)基因治療流程基于變體等位基因與疾病-導(dǎo)致基因的另外的和功能拷貝的互補(bǔ)。在非-分裂組織，諸如視網(wǎng)膜中，遞送此拷貝可使用，來源于例如，腺伴隨病毒(AAV)的非整合載體實(shí)現(xiàn)。但是，當(dāng)靶向干細(xì)胞，諸如造血干細(xì)胞(HSC)時(shí)，其命運(yùn)是増殖，持續(xù)表達(dá)成為問題，及有對整合載體的需求。反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其整合進(jìn)基因組及隨著宿主染色體復(fù)制，被證明為此目的有效，但它們的插入的隨機(jī)性質(zhì)提起了各種關(guān)心，全部與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)。X-SCID試驗(yàn)中觀察到的白血病的情況明顯與整合位點(diǎn)附近的原-癌基因的活化關(guān)聯(lián)。此外，轉(zhuǎn)基因的不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)可導(dǎo)致代謝或免疫學(xué)問題。最終，插入可導(dǎo)致內(nèi)源性基因的敲除。 定點(diǎn)整合會是病毒載體的隨機(jī)整合的有希望的替代，由于其可緩和插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)(Kolb et al.Trends Biotechnol.2005 23:399-406;Porteus et al.NatBiotechnol.2005 23:967-973;Paques et al.Curr Gen Ther.20077:49-66)。但是，加工用于靶向的重組的工具相對繁瑣。此外，各工具具有關(guān)于活性和特異性的其固有性質(zhì)。因此，本領(lǐng)域有對允許轉(zhuǎn)基因靶向的插入基因組座位，其可被認(rèn)為是用于基因添加的“安全港”的工具的需求。此外，如果此工具可用于插入轉(zhuǎn)基因，無論它們的序列為何，則極其有利，由此允許通過基因治療使用相同的工具治療多種疾病。而且，如果此工具允許將轉(zhuǎn)基因以高功效插入基因組，及導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因以高水平穩(wěn)定的表達(dá)，則極其有利。發(fā)明概述本發(fā)明顯著地針對以下實(shí)施方式:實(shí)施方式1:能切割用于將轉(zhuǎn)基因插入個(gè)體的基因組的靶序列的變體內(nèi)切核酸酶，其中(i)所述基因組含有包含所述靶序列的座位；以及(ii)所述靶序列位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200kb的距離處，其中所述RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞増殖關(guān)聯(lián)。實(shí)施方式2:根據(jù)實(shí)施方式I的內(nèi)切核酸酶，其中所述轉(zhuǎn)基因的插入基本上不修飾位于靶序列附近的基因的表達(dá)。實(shí)施方式3:根據(jù)實(shí)施方式I或2的內(nèi)切核酸酶，其中所述靶序列位于離最近基因至少IOOkb的距離處。實(shí)施方式4:根據(jù)實(shí)施方式I 3之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶，其中所述RIS已在自通過由干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因治療治療的患者的細(xì)胞中鑒定。實(shí)施方式5:根據(jù)實(shí)施方式I 3之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶,其中所述RIS已在自通過由造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因治療治療的患者的細(xì)胞中鑒定。實(shí)施方式6:根據(jù)實(shí)施方式I 5之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶，其中所述內(nèi)切核酸酶是尋靶內(nèi)切核酸酶。實(shí)施方式7:根據(jù)實(shí)施方式6的內(nèi)切核酸酶，其中所述尋靶內(nèi)切核酸酶是LAGLIDADG內(nèi)切核酸酶家族的成員。實(shí)施方式8:根據(jù)實(shí)施方式7的內(nèi)切核酸酶，其中所述LAGLIDADG內(nèi)切核酸酶家族的成員是1-CreI。

實(shí)施方式9:根據(jù)實(shí)施方式I 8之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶，其中所述座位選自:人染色體6p25.1上的SH3座位，人染色體7q31.2上的SH4座位，人染色體21q21.1上的SH6座位，人染色體13q34上的SHl2座位，人染色體3pl2.2上的SHl3座位，人第22染色體上的SH19座位，人染色體12q21.2上的SH20座位，人染色體3p24.1上的SH21座位，人染色體6pl2.2上的SH33座位，人染色體2pl6.1上的SH7座位和人第5染色體上的SH8座位。實(shí)施方式10:實(shí)施方式I 9之任一項(xiàng)中定義的內(nèi)切核酸酶用于將轉(zhuǎn)基因插入細(xì)胞或組織的基因組的體外或離體用途。實(shí)施方式11:變體ニ聚1-CreI蛋白，其包含2個(gè)單體，所述2個(gè)單體包含與SEQID NO:1或SEQ ID NO:42具有至少80%同一性的序列，其中:(i)所述ニ聚1-CreI蛋白能切割位于個(gè)體座位之內(nèi)的靶序列，所述靶序列位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200kb的距離處，及所述RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)；以及(ii)所述靶序列不包含SEQ ID NO:4的序列。實(shí)施方式12:根據(jù)實(shí)施方式11的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述ニ聚1-CreI蛋白能切割位于人染色體6p25.1上的SH3座位之內(nèi)的靶序列。實(shí)施方式13:根據(jù)實(shí)施方式12的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述靶序列包含SEQ IDNO:2的序列。實(shí)施方式14:根據(jù)實(shí)施方式12或13的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述蛋白包含:(a)第I單體，其在SEQ ID NO:1的第30，38，70和75位包含氨基酸取代；以及(b)第2單體，其在SEQ ID NO:1的第44，54，70和75位包含氨基酸取代。實(shí)施方式15:根據(jù)實(shí)施方式14的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述多肽包含:(a)包含 30G 38R 70D 75N 86D 突變的第 I 單體；(b)選自下列的第2単體:(i)包含 44A 54L 64A 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；(ii)包含 44A 54L 70Q 75Y 92R 158R 162A 突變的單體；(iii)包含 4E 44A 54L 64A 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；(iv)包含 44A 54L 64A 70Q 75N 158W 162A 突變的單體；(V)包含 44A 54L 70Q 75N 突變的單體；(vi)包含 44A 54L 57E 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；以及(vii)包含 44V 54L 70Q 75N 77V 突變的單體；實(shí)施方式16:根據(jù)實(shí)施方式14的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述多肽包含:(a)包含 30G 38R 70D 75N 81T 154G 突變的第 I 單體；
(b)選自下列的第2單體:(i)包含 44A 54L 70Q 75N 105A 158R 162A 突變的單體；(ii)包含 44A 54L 64A 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；(iii)包含 4E 44A 54L 64A 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；(iv)包含 44A 54L 64A 70Q 75N 158W 162A 突變的單體；(V)包含44A 54L 70Q 75N突變的單體；以及(vi)包含 44V 54L 70Q 75N 77V 突變的單體；實(shí)施方式17:根據(jù)實(shí)施方式14的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述多肽包含:(a)包含 30G 38R 50R 70D 75N 142R 突變的第 I 單體；(b)選自下列的第2單體: (i)包含 44A 54L 70Q 75N 105A 158R 162A 突變的單體；(ii)包含 44A 54L 64A 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；(iii)包含 44A 54L 70Q 75Y 92R 158R 162A 突變的單體；(iv)包含 4E 44A 54L 64A 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；(V)包含 44A 54L 64A 70Q 75N 158W 162A 突變的單體；(vi)包含 44A 54L 66C 70Q 71R 75N 151A 158R 162A 突變的單體；(vii)包含 44A 54L 70Q 75N 突變的單體；(viii)包含 44A 54L 57E 70Q 75N 158R 162A 突變的單體；以及(ix)包含 44V 54L 70Q 75N 77V 突變的單體；實(shí)施方式18:根據(jù)實(shí)施方式11的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述ニ聚1-CreI蛋白能切割位于人染色體7q31.2上的SH4座位之內(nèi)的靶序列。實(shí)施方式19:根據(jù)實(shí)施方式18的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述靶序列包含SEQ IDNO:3的序列。實(shí)施方式20:根據(jù)實(shí)施方式18或19的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述蛋白包含:(a)第I單體，其在SEQ ID NO:1的第24，70，75和77位包含氨基酸取代；以及(b)第2單體，其在SEQ ID NO:1的第24，44和70位包含氨基酸取代。實(shí)施方式21:根據(jù)實(shí)施方式20的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述多肽包含:(a)選自下列的第I單體:(i)包含 24V 44R 68Y 70S 75Y 77N 突變的單體；(ii)包含24V 68A 70S 75N 77R突變的單體；以及(iii)包含 24V 70D 75N 77R 突變的單體；(b)選自下列的第2單體:(i)包含24V 44Y 70S突變的單體；以及(ii)包含 24V 44Y 70S 77V 突變的單體。實(shí)施方式22:根據(jù)實(shí)施方式11的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述ニ聚1-CreI蛋白能切割位于人染色體21q21.1上的SH6座位之內(nèi)的靶序列。實(shí)施方式23:根據(jù)實(shí)施方式22的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述靶序列包含SEQ IDNO:59的序列。實(shí)施方式24:根據(jù)實(shí)施方式22或23的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述蛋白包含:
(a)第I單體，其在SEQ ID NO:1的第44位，及任選地在第70和/或75位包含氨基酸取代；以及(b)第2單體，其在SEQ ID NO:1的第28，40，44，70和75位包含氨基酸取代。實(shí)施方式25:根據(jù)實(shí)施方式24的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述多肽包含:(a)包含44K 68T 70G 75N突變的第I單體；以及(b)選自下列的第2單體:(i)包含 28Q 40R 44A 70L 75N 96R IllH 144S 突變的單體；(ii)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 85R 103T 突變的單體；(iii)包含 28Q 40R 44A 70L 75N 103S 突變的單體；(iv)包含 24F 27V 28Q 40R 44A 70L 75N 99R 突變的單體；(V)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 81T 突變的單體；(vi)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 77V 突變的單體；

(vii)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 103T 121E 132V 160R 突變的單體；(viii)包含 28Q 40R 44A 70L 75N 突變的單體；(ix)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 103T 突變的單體；以及(X)包含 28Q 34R 40R 44A 70L 75N 81V 103T 108V 160E 突變的單體。實(shí)施方式26:根據(jù)實(shí)施方式24的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述多肽包含:(a)包含44K突變，及任選地70S和/或75N突變的第I單體；以及(b)選自下列的第2単體:(i)包含 28Q 40R 44A 70L 75N 96R IllH 144S 突變的單體；(ii)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 85R 103T 突變的單體；(iii)包含 28Q 40R 44A 70L 75N 103S 突變的單體；(iv)包含 24F 27V 28Q 40R 44A 70L 75N 99R 突變的單體；(V)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 81T 突變的單體；(vi)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 103T 121E 132V 160R 突變的單體；(vii)包含 7R 28Q 40R 44A 70L 75N 103T 突變的單體；以及(viii)包含 28Q 34R 40R 44A 70L 75N 81V 103T 108V 160E 突變的單體。實(shí)施方式27:融合蛋白，其包含根據(jù)實(shí)施方式11 26之任ー項(xiàng)的ニ聚1-CreI蛋白的單體。實(shí)施方式28:根據(jù)實(shí)施方式27的融合蛋白，其中所述單體由包含SEQ ID N0:43的序列的肽接頭連接。實(shí)施方式29:根據(jù)實(shí)施方式27或28的融合蛋白，其中C-端單體還包含K7E和K96E突變，及其中N-端單體還包含E8K，E61R和G19S突變。實(shí)施方式30:根據(jù)實(shí)施方式27 29之任ー項(xiàng)的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自下列的序列:SEQ ID NO: 25 40和76 96。實(shí)施方式31:核酸，其編碼根據(jù)實(shí)施方式I 9之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶或根據(jù)實(shí)施方式11 30之任ー項(xiàng)的蛋白。實(shí)施方式32:表達(dá)載體,其包含根據(jù)實(shí)施方式31的核酸。實(shí)施方式33:根據(jù)實(shí)施方式32的表達(dá)載體,還包含祀向構(gòu)建體,所述祀向構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)基因和2個(gè)與側(cè)接被實(shí)施方式I 9之任一項(xiàng)中定義的內(nèi)切核酸酶或被實(shí)施方式11 30之任ー項(xiàng)中定義的蛋白識別的靶序列的基因組序列同源的序列。實(shí)施方式34:實(shí)施方式33的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼治療性多肽。實(shí)施方式35:根據(jù)實(shí)施方式32 34之任ー項(xiàng)的表達(dá)載體,其用于基因治療。實(shí)施方式36:以下物質(zhì)的組合: 根據(jù)實(shí)施方式32的表達(dá)載體；以及 包含靶向構(gòu)建體的載體，所述靶向構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)基因和2個(gè)與被實(shí)施方式I 9之任一項(xiàng)中定義的內(nèi)切核酸酶或被實(shí)施方式11 30之任ー項(xiàng)中定義的蛋白識別的靶序列的基因組序列同源的序列。實(shí)施方式37:藥物組合物，其包含:實(shí)施方式32 34之任一項(xiàng)中定義的表達(dá)載體或?qū)嵤┓绞?6中定義的組合，和藥學(xué)有活性的載體。實(shí)施方式38:通過基因治療治療個(gè)體的方法，包括給有需求的個(gè)體施用有效量的實(shí)施方式32 34之任一項(xiàng)中定義的表達(dá)載體或?qū)嵤┓绞?6中定義的組合。實(shí)施方式39:獲得適合于將轉(zhuǎn)基因插入個(gè)體的基因組的內(nèi)切核酸酶的方法，包括下列步驟:(a)選擇，在所述個(gè)體的基因組之內(nèi)，既不 與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)的反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)；(b)限定向所述RIS的上游延伸200kb和向所述RIS的下游延伸200kb的基因組區(qū)；以及(C)鑒定能切割位于所述基因組區(qū)之內(nèi)的靶序列的野生型內(nèi)切核酸酶或構(gòu)建變體內(nèi)切核酸酶。實(shí)施方式40:根據(jù)實(shí)施方式I 9之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶，或根據(jù)實(shí)施方式11 30之任ー項(xiàng)的蛋白，或根據(jù)實(shí)施方式31的核酸，或根據(jù)實(shí)施方式32 34之任ー項(xiàng)的表達(dá)載體，或根據(jù)實(shí)施方式36的組合，用于將轉(zhuǎn)基因插入細(xì)胞，組織或非-人動物的基因組的用途，其中所述用途不是治療劑。實(shí)施方式41:實(shí)施方式40的用途，其用于制造遺傳性病癥的非-人動物模型。實(shí)施方式42:實(shí)施方式40的用途，其用于產(chǎn)生重組蛋白。實(shí)施方式43:非-人轉(zhuǎn)基因動物，其在其基因組中包含:根據(jù)實(shí)施方式31的核酸，或根據(jù)實(shí)施方式32 34之任ー項(xiàng)的表達(dá)載體,或根據(jù)實(shí)施方式36的組合。發(fā)明詳述發(fā)明人在基因組之內(nèi)鑒定了“安全港”座位，其允許通過靶向的插入的轉(zhuǎn)基因的安全的表達(dá)，其中(i)所述座位接近反在自通過基因治療治療的患者的細(xì)胞中鑒定的轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)，及(ii)所述反轉(zhuǎn)錄病毒插入不與癌或異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)。如自以下說明和實(shí)施例立即明顯，本發(fā)明的安全港座位可位于基因的內(nèi)含子之內(nèi)，或基因間區(qū)之內(nèi)。尤其是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，內(nèi)切核酸酶可以靶向所述用于基因添加的安全港的方式加ェ。更特別，發(fā)明人加工了能識別及切割位于不同安全港座位之內(nèi)的靶序列的幾種1-CreI大范圍核酸酶，例如SH6，SH3座位，SH4座位，SH12座位，SH13座位，SH19，SH20座位，SH21座位，SH33座位，SH7座位，SH8座位，SH18座位，SH31座位，SH38座位，SH39座位，SH41座位，SH42座位，SH43座位，SH44座位，SH45座位，SH46座位，SH47座位，SH48座位，SH49座位，SH50座位，SH51座位，SH52座位，SH70座位，SH71座位，SH72座位，SH73座位，SH74 座位，SH75 座位，SHlOl 座位，SH106 座位，SH107 座位，SH102 座位，SH105 座位，SH103座位，SH104座位，SHl 13座位，SH109座位，SHl 12座位，SH108座位，SHllO座位，SHl 14座位，SHl 16座位，SHlll座位，SHl 15座位，SH121座位，SH120座位，SH122座位，SHl 17座位，SHl 18 座位，SHl 19 座位，SHl23 座位，SHl26 座位，SHl28 座位，SHl29 座位，SHl24 座位，SHl31座位，SHl25座位，SHl27座位，SHl30座位，SHll座位，SHl7座位，SH23座位，SH34座位，SH40座位，SH53座位，SH54座位，SH55座位，SH56座位，SH57座位，SH58座位，SH59座位，SH60座位，SH61座位，SH62座位，SH65座位，SH67座位，SH68座位和SH69座位，其在本文進(jìn)ー步所述。還顯示，這些大范圍核酸酶可有效切割它們的靶序列。這些大范圍核酸酶，以及其他酶如整合酶，重組酶和轉(zhuǎn)座酶，可因此用作將轉(zhuǎn)基因插入安全港的工具，由此避免在基因治療框內(nèi)不利的事件諸如白血病的呈現(xiàn)。此外，這些大范圍核酸酶，以及其他酶如整合酶，重組酶和轉(zhuǎn)座酶可用于自單靶向構(gòu)建體起始將任何轉(zhuǎn)基因插入安全港，不考慮轉(zhuǎn)基因的序列。本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶和其用途本發(fā)明因 此涉及: 能切割用于將轉(zhuǎn)基因插入個(gè)體的基因組的靶序列的內(nèi)切核酸酶，其中(i)所述基因組含有包含所述靶序列的座位，及(ii)所述靶序列位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200kb的距離處，其中所述RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞増殖關(guān)聯(lián)。 能切割用于將轉(zhuǎn)基因插入細(xì)胞或組織的基因組的靶序列的內(nèi)切核酸酶的體外或離體用途，(i)所述基因組含有包含所述靶序列的座位，及(ii)所述靶序列位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200kb的距離處，其中所述RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)。 將轉(zhuǎn)基因插入個(gè)體的基因組的方法，包括下列步驟:(i)提供能切割靶序列的內(nèi)切核酸酶，其中所述基因組含有包含所述靶序列的座位，及所述靶序列位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200kb的距離處，其既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞増殖關(guān)聯(lián)；(ii)使個(gè)體接觸轉(zhuǎn)基因及所述內(nèi)切核酸酶，其中所述轉(zhuǎn)基因被插入所述個(gè)體的基因組的座位。如本文所用，術(shù)語“內(nèi)切核酸酶”指稱能催化DNA或RNA分子，優(yōu)選DNA分子之內(nèi)的核酸之間的鍵的水解(切割)的任何野生型或變體酶。本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶不切割DNA或RNA分子，不考慮其序列，但在特定多核苷酸序列，還稱之為“靶序列”或“靶位點(diǎn)”識別及切割DNA或RNA分子。稱之為本發(fā)明的靶序列的靶序列被本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶識別及切割。本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶可例如是自加工的鋅-指結(jié)構(gòu)域與限制酶諸如 FokI (Porteus et al.Nat Biotechnol.2005 23:967-973)或化學(xué)內(nèi)切核酸酶(Arimondo et al.Mol Cell Biol.2006 26:324-333;Simon et al.NAR 200836:3531-3538;Eisenschmidt et al.NAR 2005 33:7039-7047;Cannata et al.PNAS 2008105:9576-9581)的催化性結(jié)構(gòu)域的融合得到的尋■革E內(nèi)切核酸酶(Paques et a 1.Curr GenTher.2007 7:49_66)，嵌合鋅-指核酸酶(ZFN)。在化學(xué)內(nèi)切核酸酶中，化學(xué)或肽切割物與核酸的聚合物或與識別特異性靶序列的另ー DNA綴合，由此使切割活性靶向特定序列。
本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶優(yōu)選是尋靶內(nèi)切核酸酶，也名為大范圍核酸酶。該尋革巴內(nèi)切核酸酶為本領(lǐng)域熟知(見例如Stoddard, Quarterly Reviews ofBiophysics, 2006, 38:49 - 95)。尋靶內(nèi)切核酸酶識別DNA靶序列及產(chǎn)生單鏈或雙鏈斷裂。尋靶內(nèi)切核酸酶是高度特異性的，識別長度跨12 45bp (bp)，通常長度跨14 40bp的DNA靶位點(diǎn)。本發(fā)明的尋靶內(nèi)切核酸酶可例如對應(yīng)于LAGLIDADG內(nèi)切核酸酶，HNH內(nèi)切核酸酶，或GIY-YIG內(nèi)切核酸酶。該內(nèi)切核酸酶的例包括:I_Sce I，1-Chu I，1-Cre I, 1-CsmI, P1-Sce I, P1-Tli I, P1-Mtu I, 1-Ceu I, 1-Sce II,1-Sce III, HO, P1-Civ I, P1-CtrI, P1-Aae I, P1-Bsu I, P1-Dha I, P1-Dra I, P1-Mav I, P1-Mch I, P1-Mfu I, P1-Mfl I,P1-Mga I,P1-Mgo I,P1-Min I,P1-Mka I,P1-Mle I,P1-Mma I,P1-Msh I,P1-Msm I,P1-MthI, P1-Mtu I, P1-Mxe I, P1-Npu I, P1-Pfu I, P1-Rma I, P1-Spb I, P1-Ssp I, P1-Fac I,P1-Mja I, P1-Pho I, P1-Tag I, P1-Thy I, P1-Tko I, P1-Tsp I，1-MsoI。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的尋靶內(nèi)切核酸酶是LAGLIDADG內(nèi)切核酸酶諸如1-SceI, 1-CreI, 1-CeuI，1-MsoI 和 1-DmoI。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述LAGLIDADG內(nèi)切核酸酶是1-CreI。野生型1-CreI是能切割22 24bp雙鏈靶序列的同源二聚體尋靶內(nèi)切核酸酶。1-CreI的野生型單體序列包括顯示為SEQ ID NO:1的序列(其對應(yīng)于pdb登錄號N0.1g9y的1-CreI序列)和顯示為SwissProt登錄號n° P05725的序列(尤其是顯示為73版的序列，最后修改時(shí)間為2009年11月3日)。在本專利申請中，1-CreI變體可在野生型1-CreI序列的第I甲硫氨酸之后包含另外的丙氨酸，及在C-端結(jié)尾處3個(gè)另外的氨基酸殘基(見SEQ ID N0:42的序列和

圖11)。在野生型1-CreI序列的最后脯氨酸之后的這3個(gè)另外的氨基酸殘基由2個(gè)另外的丙氨酸殘基及I個(gè)天冬氨酸殘基組成。這些另外的殘基不影 響酶的性質(zhì)。為清楚起見，這些另外的殘基不影響1-CreI或其變體中殘基的編號。更特別，本文所用的編號完全指稱SEQ IDNO:1的野生型1-CreI酶中殘基的位置。例如，野生型1-CreI的第2殘基實(shí)際上是SEQ IDNO:42的變體的第3殘基，由于此變體在第I甲硫氨酸之后包含另外的丙氨酸。在本申請中，1-CreI變體可為同源二聚體(包含2個(gè)同一單體的大范圍核酸酶)，異源二聚體(包含2個(gè)非-同一單體的大范圍核酸酶)和單鏈。本發(fā)明包括野生型(天然存在的)和變體內(nèi)切核酸酶。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶是“變體”內(nèi)切核酸酶，即不在自然界天然地存在，及通過遺傳加工或由隨機(jī)誘變獲得的內(nèi)切核酸酶。本發(fā)明的變體內(nèi)切核酸酶可例如通過將野生型，天然存在的，內(nèi)切核酸酶的氨基酸序列中的至少I殘基用不同氨基酸取代來獲得。所述取代可例如通過定點(diǎn)誘變和/或由隨機(jī)誘變來導(dǎo)入。在本發(fā)明的框架內(nèi)，該變體內(nèi)切核酸酶保持有功能，即它們保留識別及特別切割靶序列的能力。本發(fā)明的變體內(nèi)切核酸酶切割不同于對應(yīng)的野生型內(nèi)切核酸酶的靶序列的靶序列。例如，變體1-CreI內(nèi)切核酸酶的靶序列不同于SEQ ID N0:4的序列。獲得具有新特異性的該變體內(nèi)切核酸酶的方法為本領(lǐng)域熟知。本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)，該具有新特異性的變體內(nèi)切核酸酶可用于將基因插入細(xì)胞，組織或個(gè)體的基因組的“安全港”座位。如本文所用，術(shù)語“座位”是染色體上DNA序列(例如基因)的特定物理位置。如在此說明書中使用，術(shù)語“座位”通常指稱染色體上內(nèi)切核酸酶的靶序列的特定物理位置。該座位，其包含被本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶識別及切割的靶序列，稱之為“本發(fā)明的座位”。理想情況下，插入安全港座位應(yīng)對其他基因的表達(dá)無沖擊。測試這些性質(zhì)是多步過程，及期望由生物信息學(xué)手段進(jìn)行候選體安全港座位的第I預(yù)篩選。可由此首先鑒定靶向的插入不可能導(dǎo)致插入誘變的座位。本發(fā)明的座位的主要特征之一是:(i)其位于在基因治療臨床試驗(yàn)中，自患者的細(xì)胞中觀察到反轉(zhuǎn)錄病毒插入的區(qū)，及(ii)所述反轉(zhuǎn)錄病毒插入未相關(guān)于癌或異常細(xì)胞增殖。的確，鑒定本發(fā)明的安全港座位的一種方式是使用由之前的基因治療試驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。在X-SCID試驗(yàn)中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體-運(yùn)載的轉(zhuǎn)基因緊鄰LM02和CCND2基因的插入已顯示相關(guān)于白血病。患者中載體插入的追蹤明顯展示，在幾年過程之后，攜帶此插入的細(xì)胞數(shù)目勝過了其他修飾的細(xì)胞(Hacein-Bey-Abina et al.Science 2003302:415-9;Deichmann et al.J.0f Clin.1nvest.2007 117:2225-32,Cavazzana-Calvoet al.Blood 2007 10 9:4575-4581)。在另一臨床試驗(yàn)中，在幾個(gè)座位插入被發(fā)現(xiàn)在2個(gè)患者中引發(fā)高增殖速度(Ott et al.Nat Med 2006 12:401-9)。在這些情況中，增殖似乎是MDS1-EVI1，PRDM16或SETBPl基因的插入活化的結(jié)果。盡管起初未觀察到惡性，EVII活化最終在兩名患者中導(dǎo)致脊髓發(fā)育不良(Stein et al., Nat.Med 2010 16:198-205)。更通常，即便非致癌，自接近插入子的基因的活化得到的細(xì)胞增殖可代表向惡性的第I步驟，由此導(dǎo)致有關(guān)安全性的潛在問題。為了更佳明白病毒載體整合的模式，及其在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的命運(yùn)上的潛在結(jié)果，已在自基因治療試驗(yàn)的患者中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)的幾個(gè)大規(guī)模研究(Mavilio et al., Nat Med 2006:1397-1402;Recchia et al.PNAS2006:1457-62;Aiuti, et al.J Clin Invest 2007:2233-40;Schwarzwaelder et al.JClin Invest 2007:2241-9;Deichmann et al.J Clin Invest 2007:2225-32)。未與白血病或與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)的RIS可被認(rèn)為是安全港。因此，本發(fā)明的座位優(yōu)選重疊或接近臨床試驗(yàn)中鑒定的RIS，且仍不與癌或異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)。更特別，本發(fā)明的座位定義為包含位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200，180，150，100或50kb的距離處的靶序列的座位，所述RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)。該座位稱之為本發(fā)明的“安全港”座位(或本發(fā)明的座位)，即對于轉(zhuǎn)基因插入安全的座位?！胺崔D(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)”(RIS)是指鑒定為在自通過用所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體基因治療治療的患者的細(xì)胞中用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的插入位點(diǎn)的基因組位點(diǎn)。該RIS為本領(lǐng)域熟知。它們包括但不限于 Schwarzwaelder 等人(J.Clin.1nvest.2007117:2241), Deichmann等人(J.0f Clin.1nvest.2007117:2225)，Aiuti 等人(J.Clin.1nvest.2007117:2233)，Recchia 等人(PNAS 2006103:1457)和 Mavilio 等人(Nature Medicine 12:1397，2006)中描述的那些?！胺崔D(zhuǎn)錄病毒載體”是指源于自逆轉(zhuǎn)錄病毒科(retixwiridae)的病毒的任何載體。根據(jù)本發(fā)明的RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)。知道相關(guān)于白血病或異常細(xì)胞增殖的RIS為本領(lǐng)域熟知，和可容易排除由本領(lǐng)域技術(shù)人員。知道相關(guān)于白血病或異常細(xì)胞增殖的該RIS包括，例如，緊鄰LM02，CCND2, MDSl-EVI I，PRDM16和SETBPl基因的插入位點(diǎn)。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方式中，已在臨床試驗(yàn)中，用作為干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞鑒定用于限定安全港座位的RIS。RIS可由此已在自通過由干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因治療治療的患者的細(xì)胞中鑒定。在本發(fā)明的另一最優(yōu)選的實(shí)施方式中，已在對于SCID患者的臨床試驗(yàn)中，用作為造血干細(xì)胞(HSC)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞鑒定用于限定安全港座位的RIS。RIS可由此已在自通過由造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因治療治療的患者的細(xì)胞中鑒定。此外，可使用根據(jù)本發(fā)明的RIS的定義的更嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。RIS之中，共同整合位點(diǎn)(CIS)是座位，其中RIS的表示的統(tǒng)計(jì)學(xué)可作為插入之后細(xì)胞高增殖速度的結(jié)果解析。(Mikkers et al., 2003, Nat.Genet.32:153; Lundet al.,2002,Nat.Genet 32:160;Hemati et al.2004, PLOS Biol.2:e423;Suzukiet al., 2002, Nat.Genet.32:166-174;Deichman et al.J.0f Clin.1nvest.2007117:2225-32)。例如，Deichman 等人(J.0f Clin.1nvest.2007 117:2225-32)對自通過基因治療治療的9X-SCID患者的RIS進(jìn)行測量，及發(fā)現(xiàn)了可明確地標(biāo)位到人基因組的572個(gè)獨(dú)特RIS。它們之中，它們定義了第2，第3，第4，第5和更高量級的CIS。第2量級的CIS被定義為在30kb距離之內(nèi)2個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒插入的發(fā)生，第3，第4和第5量級的CIS被定義為在50，100或200kb之內(nèi)分別3，4或5個(gè)插入的發(fā)生。122RIS見于47個(gè)不同CIS座位，在RIS的隨機(jī)分布下預(yù)期的值的33倍。11個(gè)CIS發(fā)現(xiàn)定位緊鄰原-癌基因，包括ZNF217，VAV-3, CCND2, LM02, MDSI, BCL2L1, N0TCH2, S0CS2, RUNXI，RUNX3 和 SEPT6。為了確保最大安全性，避免位于CIS之內(nèi)的RIS可優(yōu)選。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的靶序列未位于CIS內(nèi)。此外，所述靶序列或座位優(yōu)選位于離作為共同整合位點(diǎn)(CIS)的部分的RIS至少50，100或200kb的距離處?！肮餐衔稽c(diǎn)”(CIS)是指30kb，50kb，100kb或200kb的基因組區(qū)，其中臨床試驗(yàn)中鑒定的RIS過度存在(推定插入的隨機(jī)分布)。該CIS為本領(lǐng)域熟知及描述于Schwarzwaelder 等人(J.Clin.1nvest.2007 117:2241), Deichmann 等人(J.0f Clin.1nvest.2007 117:2225),Aiuti 等人(J.Clin.1nvest.2007117:2233)，Recchia 等人(PNAS2006 103:1457)，Mavilio 等人(Nature Medicine 12:1397，2006)和 Gabriel 等人(Nat.Med.200915(12):143)。除了接近RIS之外，靶向的整合進(jìn)本發(fā)明的座位應(yīng)不導(dǎo)致靶向的細(xì)胞中必要的功能的分裂。因此，在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，插入本發(fā)明的座位優(yōu)選基本上不修飾位于靶序列附近的基因，例如最近基因的表達(dá)。此外，在另一特定實(shí)施方式中，遺傳元件插入所述座位優(yōu)選基本上不修飾所述細(xì)胞，組織或個(gè)體的表型(除了由于遺傳元件的表達(dá)所致的表型)。”表型”是指細(xì)胞的，組織的或個(gè)體的可觀察的特性。 表型包括例如活力，細(xì)胞增殖和/或生長速率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可例如通過分析相鄰基因的表達(dá)模式，通過進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的微-陣列研究和/或通過表征增殖和/或分化異常(如果任何)容易確證座位是本發(fā)明的安全港座位。在仍另一特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的座位不包含任何基因。不包含任何基因的座位指稱不包含任何參考的或知道的基因的座位。在其他術(shù)語中，該座位不包含任何根據(jù)序列數(shù)據(jù)庫諸如美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上可利用的那些的知道的基因。因此，本發(fā)明的靶序列和/本發(fā)明的或座位可有利地位于離最近基因至少1，5，10，25，50，100，180，200，250，300,400 或 500kb 的距離處?！盎ā笔侵富具z傳單元，由沿著染色體以線性方式排列的編碼特異性蛋白或蛋白段的DNA段組成。基因一般包括啟動子，5’非翻譯區(qū)，一個(gè)或更多編碼序列(外顯子)，任選地內(nèi)含子，3’非翻譯區(qū)?；蚩蛇€包含終止子，增強(qiáng)子和/或沉默子?！白罱颉笔侵肝挥诜謩e最接近靶序列，靶序列的著絲粒和端粒的1，2或3個(gè)基因。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的座位還允許轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定的表達(dá)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的靶序列在所述細(xì)胞，組織或個(gè)體的基因組之內(nèi)僅存在一次。一旦已選擇該本發(fā)明的安全港座位，可然后(i )構(gòu)建特異性識別及切割位于所述座位的之內(nèi)靶序列的變體內(nèi)切核酸酶，例如如在實(shí)施例1，2和5中描述，或(ii)測定是否知道的野生型內(nèi)切核酸酶能切割位于所述座位之內(nèi)的靶序列。或者，一旦已選擇本發(fā)明的安全港座位，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在其中插入被知道的野生型或變體內(nèi)切核酸酶識別及切割的靶序列。因此，本發(fā)明針對獲得適合于將轉(zhuǎn)基因插入個(gè)體的基因組的內(nèi)切核酸酶的方法，包括下列步驟:(a)選擇和/或鑒定，在所述個(gè)體的基因 組之內(nèi)，既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)的反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)；(b)限定向所述RIS的上游延伸200kb和向所述RIS的下游延伸200kb的基因組區(qū)；以及(C)鑒定能切割位于所述基因組區(qū)之內(nèi)的靶序列的野生型內(nèi)切核酸酶或構(gòu)建變體內(nèi)切核酸酶。該內(nèi)切核酸酶允許安全地將轉(zhuǎn)基因插入細(xì)胞，組織或個(gè)體的基因組，例如基本上不修飾地(i )最近基因的表達(dá)，和/或(ii )細(xì)胞，組織或個(gè)體的細(xì)胞增殖和/或生長速率。當(dāng)進(jìn)行以上方法時(shí)，可當(dāng)然應(yīng)用以上提及的與本發(fā)明的座位相關(guān)的全部標(biāo)準(zhǔn)。例如，可排除作為CIS的部分的RISjP /或在步驟(b)定義的基因組區(qū)可僅向所述RIS上游延伸50kb和向所述RIS下游延伸50kb，和/或包含靶序列的座位可不包含任何基因。本發(fā)明的座位可例如對應(yīng)于描述于下表A C的SH3，SH4，SH6，SHl2，SHl3，SH19，SH20, SH21，SH33，SH7或SH8座位中的任何一個(gè)。表A提供人基因組之內(nèi)座位的位置，座位之內(nèi)包含的靶序列，最接近RIS的位置以及描述RIS的出版物的引用，及切割座位的本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶的例。表B提供有關(guān)位于本發(fā)明的座位的立即上游(在5’)和下游(在3’ )的最近基因的信息。距離指示靶序列和基因的最近編碼序列之間的距離。表C和D提供與表B類似信息，但分別對于第2最近基因及對于第3最近基因。表A’，B’，C’和D’提供類似于分別表A，B，C和D中的信息的更新的信息，對于一些座位及這些座位，即SH3，SH4，SH6，SH8和SH19之內(nèi)的靶序列的關(guān)聯(lián)的例。更新的定位信息通過引用人基因組組件的GRCh37/hgl9版本給予。
本發(fā)明的座位也可對應(yīng)于描述于下表A” D”的SH18，SH31，SH38，SH39，SH41，SH42, SH43, SH44, SH45, SH46, SH47, SH48, SH49, SH50, SH51, SH52, SH70, SH71, SH72, SH73,SH74和SH75中的任何一個(gè)。表A”提供人基因組之內(nèi)的座位的位置，座位之內(nèi)包含的靶序列，最接近RIS的位置以及描述RIS的出版物的引用，所述靶和最接近RIS之間的距離和切割座位的本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶的例。表B”提供有關(guān)位于本發(fā)明的座位的立即上游(在5’)和下游(在3’)的最近基因的信息。距離指示靶序列和基因的最近編碼序列之間的距離。表C”和D”提供與表B”類似的信息，但分別對第2最近基因及對第3最近基因。座位的位置，此座位內(nèi)的靶和基因根據(jù)人基因組組件的GRCh37/hgl9版本給予。表A
權(quán)利要求
1.切割用于將轉(zhuǎn)基因插入個(gè)體的基因組的靶序列的變體內(nèi)切核酸酶，其中 (i )所述基因組含有包含所述靶序列的座位；以及 (ii)所述靶序列位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200kb的距離處，其中所述RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞増殖關(guān)聯(lián)。
2.利要求1的內(nèi)切核酸酶，其中所述轉(zhuǎn)基因的插入基本上不修飾位于靶序列附近的基因的表達(dá)。
3.利要求1或2的內(nèi)切核酸酶，其中所述靶序列位于離最近基因至少IOOkb的距離處。
4.利要求1 3之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶，其中所述內(nèi)切核酸酶是尋靶內(nèi)切核酸酶。
5.利要求1 4之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶，其中所述內(nèi)切核酸酶能切割位于選自下列的座位之內(nèi)的靶序列:人染色體21q21.1上的SH6座位，人染色體6p25.1上的SH3座位，人染色體7q31.2上的SH4座位，人染色體13q34上的SHl2座位，人染色體3pl2.2上的SHl3座位，人第22染色體上的SH19座位，人染色體12q21.2上的SH20座位，人染色體3p24.1上的SH21座位，人染色體6pl2.2上的SH33座位，人染色體2pl6.1上的SH7座位，人第5染色體上的SH8座位，SH18座位，SH31座位，SH38座位，SH39座位，SH41座位，SH42座位，SH43座位，SH44座位，SH45座位，SH46座位，SH47座位，SH48座位，SH49座位，SH50座位，SH51座位，SH52座位，SH70座位，SH71座位，SH72座位，SH73座位，SH74座位，SH75座位，SHlOl座位，SH106座位，SH107座位，SH102座位，SH105座位，SH103座位，SH104座位，SHl 13座位，SH109座位，SHl12座位，SH108座位，SHllO座位，SHl 14座位，SHl 16座位，SHlll座位，SHl 15 座位，SHl21 座位，SHl20 座位，SHl22 座位，SHl 17 座位，SHl 18 座位，SHl 19 座位，SHl23座位，SHl26座位，SHl28座位，SHl29座位，SHl24座位，SHl31座位，SHl25座位，SHl27座位，SHl30座位，SHll座位，SHl7座位，SH23座位，SH34座位，SH40座位，SH53座位，SH54座位，SH55座位，SH56座位，SH57座位，SH58座位，SH59座位，SH60座位，SH61座位，SH62座位，SH65座位，SH67座位，SH68座位和SH69座位。
6.體ニ聚1-CreI蛋白，其包含各包含與SEQID NO:1或SEQ ID NO:42具有至少80%同一性的序列的2個(gè)單體，其中: (i)所述ニ聚1-CreI蛋白能切割位于個(gè)體的座位之內(nèi)的靶序列，所述靶序列位于離反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)至多200kb的距離處，及所述RIS既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)；以及 (ii)所述靶序列不包含SEQID N0:4的序列。
7.利要求6的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述ニ聚1-CreI蛋白能切割位于選自下列的座位之內(nèi)的靶序列:人染色體21q21.1上的SH6座位，人染色體6p25.1上的SH3座位，人染色體7q31.2上的SH4座位，人染色體13q34上的SHl2座位，人染色體3pl2.2上的SHl3座位，人第22染色體上的SH19座位，人染色體12q21.2上的SH20座位，人染色體3p24.1上的SH21座位，人染色體6pl2.2上的SH33座位，人染色體2pl6.1上的SH7座位，人第5染色體上的SH8座位，SH18座位，SH31座位，SH38座位，SH39座位，SH41座位，SH42座位，SH43座位，SH44座位，SH45座位，SH46座位，SH47座位，SH48座位，SH49座位，SH50座位，SH51座位，SH52座位，SH70座位，SH71座位，SH72座位，SH73座位，SH74座位，SH75座位，SHlOl座位，SH106座位，SH107座位，SH102座位，SH105座位，SH103座位，SH104座位，SHl 13座位，SH109座位，SHl 12座位，SH108座位，SHllO座位，SHl 14座位，SHl 16座位，SHlll座位，SHl 15 座位，SHl21 座位，SHl20 座位，SHl22 座位，SHl 17 座位，SHl 18 座位，SHl 19 座位，SHl23座位，SHl26座位，SHl28座位，SHl29座位，SHl24座位，SHl31座位，SHl25座位，SHl27座位，SHl30座位，SHll座位，SHl7座位，SH23座位，SH34座位，SH40座位，SH53座位，SH54座位，SH55座位，SH56座位，SH57座位，SH58座位，SH59座位，SH60座位，SH61座位，SH62座位，SH65座位，SH67座位，SH68座位和SH69座位。
8.利要求6或7的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述ニ聚1-CreI蛋白能切割位于人染色體21q21.1上的SH6座位之內(nèi)的靶序列。
9.利要求8的ニ聚1-CreI蛋白，其中所述靶序列包含SEQID NO:59的序列。
10.合蛋白，其包含權(quán)利要求6 9之任ー項(xiàng)中定義的ニ聚1-CreI蛋白的單體。
11.利要求10的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自下列的序列:SEQID NO:81,82 85，294，295，76 80，25 40，86 96，127 150，182 213，235 270 和 275 278。
12.酸，其編碼權(quán)利要求1 5之任一項(xiàng)中定義的內(nèi)切核酸酶或權(quán)利要求6 11之任ー項(xiàng)中定義的蛋白。
13.達(dá)載體，其包含權(quán)利要求12中定義的核酸。
14.利要求13的表達(dá)載體，其還包含靶向構(gòu)建體，所述靶向構(gòu)建體包含: 轉(zhuǎn)基因、和 與側(cè)接被權(quán)利要求1 5之任一項(xiàng)中定義的內(nèi)切核酸酶或權(quán)利要求6 11之任ー項(xiàng)中定義的蛋白識別的靶序列的基因組序列同源的2個(gè)序列。
15.列之組合: 權(quán)利要求13中定義的表達(dá)載體；以及 包含祀向構(gòu)建體的載體，所述祀向構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)基因和與被權(quán)利要求1 5之任一項(xiàng)中定義的內(nèi)切核酸酶或權(quán)利要求6 11之任ー項(xiàng)中定義的蛋白識別的靶序列的基因組序列同源的2個(gè)序列。
16.物組合物，其包含: 權(quán)利要求14中定義的表達(dá)載體或權(quán)利要求15中定義的組合，及 藥學(xué)可接受的載體。
17.利要求1 5之任一項(xiàng)的內(nèi)切核酸酶,或 權(quán)利要求6 11之任ー項(xiàng)的蛋白，或 權(quán)利要求12的核酸，或 權(quán)利要求13或14的表達(dá)載體，或 權(quán)利要求15的組合， 用于將轉(zhuǎn)基因插入細(xì)胞，組織或非-人動物的基因組的用途，其中所述用途不是治療性的。
18.利要求17的用途，其用于制造遺傳性病癥的非-人動物模型。
19.利要求17的用途，其用于產(chǎn)生重組蛋白。
20.得適合于將轉(zhuǎn)基因插入個(gè)體的基因組的內(nèi)切核酸酶的方法，包含下列步驟: (a)在所述個(gè)體的基因組之內(nèi)選擇既不與癌關(guān)聯(lián)也不與異常細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)的反轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)(RIS)； (b)限定向所述RIS的上游延伸200kb和向所述RIS的下游延伸200kb的基因組區(qū)；以及 (c)鑒定能切割位于 所述基因組區(qū)之內(nèi)的靶序列的野生型內(nèi)切核酸酶或構(gòu)建變體內(nèi)切核酸酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及能切割位于“安全港座位”，即允許轉(zhuǎn)基因的安全的表達(dá)的座位的靶序列的內(nèi)切核酸酶。本發(fā)明還涉及該內(nèi)切核酸酶用于將轉(zhuǎn)基因插入細(xì)胞，組織或個(gè)體的用途。
文檔編號C12N9/22GK103097527SQ201180019244
公開日2013年5月8日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者O·達(dá)諾斯, A·杜克賴特 申請人:塞勒克提斯公司