專利名稱：循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測技術(shù)，特別是一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲裝置。
背景技術(shù)：
循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，簡稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞)是一種從固體原發(fā)腫瘤脫離的脫離癌細(xì)胞。循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體的不同組織，促使癌癥的轉(zhuǎn)移和發(fā)展。外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的定量可用作癌癥臨床處理的重要指征，用于提供治療措施的成功/失敗信息和轉(zhuǎn)移階段的預(yù)測。例如，每7. 5mL血中大于或等于5個循環(huán)腫瘤細(xì)胞的病人表示僅僅2. 7個月的中度疾病無惡化生存，而那些在每7. 5mL外周血中含有小于5個循環(huán)腫瘤細(xì)胞的病人則會有7. 0個月的疾病無惡化的生存(A. A. Adams等，Highly Efficient Circulating Tumor Cell Isolation from Whole Blood and Label-Free Enumeration Using Polymer-Based Microfluidics with an Integrated Conductivity Sensor. Journal of the American Chemical Society,130(27), pp. 8633 8641, 2008.)。 有這些基準(zhǔn)信息，醫(yī)生可以更加精確地測定一個患者的疾病狀態(tài)。定量外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的主要問題是其在血液中的豐度非常低(每毫升幾個至幾百個)。所以，分離和計算循環(huán)腫瘤細(xì)胞是一個巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)(S. Nagrath等， Isolation of Rare Circulating Tumor Cells in Cancer Patients by Microchip Technology. Nature Letter, Vol. 450，pp. 1235 1239,2007.)。為了使檢測稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的敏感度最大化，大多數(shù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞診斷設(shè)備使用了富集步驟來提高檢測目的物的可能性?，F(xiàn)有技術(shù)中的富集方法包括免疫磁性分離、密度梯度離心和細(xì)胞大小限制性過濾(A. L. Allan 禾P M. Keeney. , Circulating Tumor Cell Analysis :Technical and Statistical Consideration for Application to the clinic. Journal of Oncology, Vol. 2010，pp. 1 10,2010.)。免疫磁性分離利用了捕獲劑包被的磁珠來免疫識別血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，然后進(jìn)行磁性分離。但是，這種基于磁珠的方法受到其低循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲收率的限制， 因?yàn)槎鄠€加工步驟(密度梯度離心和洗滌)會導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞的損失。密度梯度離心是基于血液中各種顆粒的密度差異性。當(dāng)離心血液時，較重的顆粒(紅細(xì)胞、中性白細(xì)胞)遷移到底部，而包括單核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的較輕的顆粒仍然留在頂部。該方法的缺點(diǎn)是純度很低，并且樣品處理和轉(zhuǎn)移也會造成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的損失，進(jìn)而極大地影響捕獲收率(Z. Panteleaou 等，Detection of Circulating Tumor Cells in Prostate Cancer Patients !Methodological Pitfalls and Clinical Relevance. Molecular Medicine, Vol. 15，pp.101 114,2009.)。相似地，利用循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞(15至25 μ m)和環(huán)境血細(xì)胞G至18 μ m)之間大小的差異，可使用微型制造的濾膜將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從其他細(xì)胞中過濾分離出來 (G. Vona 等，Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells :A New Method for the Immunomorphological and Molecular Characterization of Circulating Tumor Cell.
3American Journal of Pathology，Vol. 156，pp. 57 63，2000.)，但是這仍留下了很多的大小相似的白細(xì)胞，這意味著這種方法也具有低純度。目前，在最新的生物學(xué)研究領(lǐng)域，S. Wang等率先利用采用具有三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的微芯片從全血樣品中分離活的癌細(xì)胞(S. Wang等，Three-Dimensional Nanostrucutred Substrates toward Efficient Capture of Circulating Tumor Cells. Angewandte Chemie International Edition，Vol. 48，pp. 8970 8973，2009.)。三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)是一種表面上具有由多個突起形成的微陣列的基質(zhì)。此微陣列構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)與待研究細(xì)胞的表面三維結(jié)構(gòu)相匹配，可形成類似于“鎖鑰”結(jié)構(gòu)。更具體地說，硅納米柱(SiNP)陣列增強(qiáng)了基質(zhì)和細(xì)胞表面的納米級別部分(例如微絨毛和絲狀偽足)之間的相互作用，從而導(dǎo)致比非結(jié)構(gòu)化的(即平面硅)基質(zhì)更高的細(xì)胞捕獲親和性，提高了細(xì)胞的捕獲效率。但是，此種方法目前僅被個別地應(yīng)用在前沿生物學(xué)研究領(lǐng)域，尚未向?qū)嶋H應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展。具體而言，此方法中的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)需要使用目前價格仍然昂貴的硅材料，而且硅材料制成的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)需要使用諸如光刻法等復(fù)雜且耗時的方法制造。換句話說，現(xiàn)有的采用硅類材料的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)及其制造方法均不適于工業(yè)上批量生產(chǎn)。此夕卜，考慮到樣品間的交叉污染，臨床上不可能多次重復(fù)使用同一微芯片進(jìn)行檢測診斷。如果想要將微芯片真正的用于當(dāng)前的臨床醫(yī)學(xué)診斷中，如用作一次性的診斷產(chǎn)品，就必須要降低原料成本和其生產(chǎn)成本。此外，由于靜態(tài)微芯片體積很小，也不便于拿取和操作。綜上所述，需要提供一種具有較低材料成本、生產(chǎn)成本、使用方便且適于工業(yè)化批量生產(chǎn)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，以解決提供具有低材料成本、低生產(chǎn)成本、適于工業(yè)化批量生產(chǎn)且使用方便的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備。為此，本實(shí)用新型提供了以下技術(shù)方案。根據(jù)本實(shí)用新型的一個實(shí)施利，本實(shí)用新型提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的裝置，所述裝置包括表面具有納米柱陣列結(jié)構(gòu)的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，所述納米柱陣列結(jié)構(gòu)與所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)相匹配，其中，所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)由生物相容的聚合物制成。在本實(shí)用新型的另一個實(shí)施方式中，所述納米柱具有IOOnm至200nm的直徑。在本實(shí)用新型的另一個實(shí)施方式中，所述納米柱具有IOOnm至200nm的間距。在本實(shí)用新型的另一個實(shí)施方式中，所述納米柱具有至少500nm的高度。在本實(shí)用新型的另一個實(shí)施方式中，所述納米柱具有500nm至15 μ m的高度，優(yōu)選具有1 μ m至10 μ m的高度，更優(yōu)選具有1 μ m至2 μ m的高度。在本實(shí)用新型的另一個實(shí)施方式中，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置進(jìn)一步包括用于容納所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的具有至少一個手柄的外殼。在本實(shí)用新型的另一個實(shí)施方式中，所述外殼中容納多個所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，且各個所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)之間由側(cè)壁間隔開。在本實(shí)用新型的另一個實(shí)施方式中，所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的上表面和/或所述納米柱的側(cè)壁涂覆有抗循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體，優(yōu)選地，所述抗循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體是抗EpCAM抗體。采用本實(shí)用新型各實(shí)施例提供的技術(shù)方案，可以得到低成本能夠大批量制造的循環(huán)腫瘤癌細(xì)胞捕獲裝置。

圖1 三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞之間的拓?fù)鋵W(xué)相互作用的示意圖。圖2 根據(jù)本實(shí)用新型一個實(shí)施方式的具有三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的本實(shí)用新型的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備的示意性頂視圖。圖3 根據(jù)本實(shí)用新型一個實(shí)施方式的具有三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的本實(shí)用新型的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備的示意性側(cè)視圖。圖4 根據(jù)本實(shí)用新型一個實(shí)施方式的用納米壓印技術(shù)制備三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的方法的示意圖。
具體實(shí)施方式
以下將參照附圖結(jié)合示例性實(shí)施方式更全面地說明本實(shí)用新型。然而，本實(shí)用新型可以不同形式體現(xiàn)并不應(yīng)理解成受限于文中所述實(shí)施方式。相反，提供這些實(shí)施方式以使得本公開徹底而完整，并完整地將本實(shí)用新型的范圍傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。在附圖中， 各個部分的大小和比例可以放大，且相同的附圖標(biāo)記是指相同的部分。本實(shí)用新型的實(shí)現(xiàn)是基于特定三維納米結(jié)構(gòu)與特定細(xì)胞表面突起之間的拓?fù)鋵W(xué)相互作用。圖1描述了三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞之間的拓?fù)鋵W(xué)相互作用的原理。在圖1中，基質(zhì)100上的納米柱110具有根據(jù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞120細(xì)胞表面突起結(jié)構(gòu)所設(shè)計的高度、間距和寬度。在靜態(tài)孵育樣品的過程中，樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞120和其它細(xì)胞130會向下沉降，并接觸基質(zhì)100上的納米柱陣列。循環(huán)腫瘤細(xì)胞120的表面上有許多細(xì)胞突起，而設(shè)計出的納米柱110的高度、間距和寬度與細(xì)胞突起的形狀相匹配，所以循環(huán)腫瘤細(xì)胞120的細(xì)胞突起會插入到兩個納米柱之間的間隙，并與納米柱陣列形成緊密的交錯結(jié)合，即形成互補(bǔ)的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)合。對于其它細(xì)胞130，由于它們的表面突起結(jié)構(gòu)與納米柱陣列的結(jié)構(gòu)不匹配，突起不能充分插入或無法插入納米柱間隙，所以不能與納米柱陣列形成緊密結(jié)合?；谶@種“鎖鑰”模式的拓?fù)鋵W(xué)相互作用，可提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率。更進(jìn)一步地，當(dāng)在三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的上表面和/或納米柱的側(cè)壁涂覆抗循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體140(以加粗的短線表示)時，插入間隙中的細(xì)胞突起會與抗體140結(jié)合，更進(jìn)一步地提高了捕獲效率。第一方面，本實(shí)用新型提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的裝置，所述裝置包括表面具有納米柱陣列結(jié)構(gòu)的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，其中，所述納米柱陣列結(jié)構(gòu)與所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)相匹配，且所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)由生物相容的聚合物制成。目前，前沿生物學(xué)研究中采用具有納米結(jié)構(gòu)的微陣列來研究納米結(jié)構(gòu)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，如細(xì)胞粘連、遷移、分化等的影響，但是這些研究并沒有考慮到將具有納米結(jié)構(gòu)的微芯片用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離、檢測和/或捕獲中，更沒有考慮到將其用于臨床腫瘤檢測和診斷。更進(jìn)一步，當(dāng)前的微芯片納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)多采用硅材料，如Si、SiNP等。硅材料十分昂貴，且用于在硅表面上形成三維納米結(jié)構(gòu)的方法主要是復(fù)雜的光刻法。然而， 出于臨床安全的需要，臨床上需要使用一次性的診斷產(chǎn)品，這就要求必須開發(fā)出成本低廉的微芯片以便于大規(guī)模使用。目前生物學(xué)研究中所用的微芯片無法滿足上述臨床使用的要求。如果僅僅簡單地將硅材料用廉價材料替換，可能造成以下問題很多成本低廉的材料難以形成高縱橫比結(jié)構(gòu)，即難以形成三維納米微陣列結(jié)構(gòu)，例如，聚氨酯是一種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的材料，但是實(shí)驗(yàn)證明聚氨酯的材質(zhì)過于柔軟，無法形成具有高縱橫比的結(jié)構(gòu)； 很多成本低廉的材料本身對生物體不利，甚至有毒性；或雖然材料自身價格廉價，但沒有適合的方法能將此材料的表面加工成所需的三維納米結(jié)構(gòu)，所以，選擇適當(dāng)?shù)牟牧献鳛榧{米結(jié)構(gòu)基質(zhì)十分重要。通過大量實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些生物相容的聚合物成本低廉，易于形成高縱橫比、高保真度的結(jié)構(gòu)，且有適合的方法來對其表面進(jìn)行加工，因而有可能成為一種良好的候選材料。在本文中，除非另有說明，所用術(shù)語“生物相容的”是指聚合物材料對細(xì)胞不會產(chǎn)生諸如生物、化學(xué)、物理等不良影響。本實(shí)用新型的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)可由生物相容的聚合物材料制成，所述生物相容的聚合物優(yōu)選自由聚二甲基硅氧烷和聚(甲基)丙烯酸酯組成的組中。在一個實(shí)施方式中， 所述聚(甲基)丙烯酸酯選自由聚(甲基)丙烯酸甲酯、聚(甲基)丙烯酸乙酯、聚(甲基)丙烯酸丙酯、聚(甲基)丙烯酸丁酯和聚(甲基)丙烯酸戊酯組成的組中。在一個實(shí)施方式中，本實(shí)用新型的生物相容的聚合物材料為聚二甲基硅氧烷或聚(甲基)丙烯酸甲酯。聚二甲基硅氧烷或聚(甲基)丙烯酸酯是很好的生物相容的聚合物材料，對細(xì)胞不會產(chǎn)生任何不良影響。它們的價格低廉，易于獲得。而且，這種聚合物材料的材質(zhì)硬度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硅類材料，因此可使用工藝簡單的納米壓印技術(shù)在其表面上形成具有高縱橫比的表面結(jié)構(gòu)。當(dāng)前的生物學(xué)研究領(lǐng)域尚未有人采用聚二甲基硅氧烷或聚(甲基)丙烯酸酯來制造循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，更未有人試圖將采用此材料制造的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置用于臨床檢測。由此可見，使用這種生物相容的聚合物材料制成的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置可滿足在臨床上大規(guī)模使用的要求。圖2是根據(jù)本實(shí)用新型一個實(shí)施方式的具有三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的本實(shí)用新型的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備的示意性頂視圖。如圖2所示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備包括三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)230、外殼220和手柄 210?；|(zhì)230上具有由納米柱240形成的陣列結(jié)構(gòu)。納米柱MO的直徑、高度和間距根據(jù)待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的突起來設(shè)計，以使得納米柱MO的陣列結(jié)構(gòu)與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)相匹配。具體地，在本實(shí)用新型中，納米柱240具有IOOnm至200nm的直徑、IOOnm至200nm 的間距和至少500nm的高度。優(yōu)化這些納米柱MO的直徑、高度和間距可以最大程度實(shí)現(xiàn)納米柱陣列與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的拓?fù)鋵W(xué)匹配，最終實(shí)現(xiàn)從樣品如血液中捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在一個實(shí)施方式中，此直徑可為例如lOOnm、llOnm、120nm、130nm、140nm、150nm、 170nm、190nm和200nm。如果納米柱MO的直徑小于lOOnm，則突起插入在臨近兩個納米柱間隙中的兩個循環(huán)腫瘤細(xì)胞會過于擁擠，可能導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫離基質(zhì)表面；如果納米柱240的直徑大于200nm，會導(dǎo)致單位面積內(nèi)能布置的納米柱240的數(shù)量過少，影響檢測效率。在一個實(shí)施方式中，此間距可為例如lOOnm、120nm、130nm、140nm、150nm、170nm、 190nm和200nm。如果納米柱240的間距小于lOOnm，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的突起將會因間距過小而無法插入；如果納米柱240的間距大于200nm，其它細(xì)胞的突起或甚至是體積較小的細(xì)胞有可能插入，造成檢測特異性降低。如果納米柱MO的高度小于500nm，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的突起無法充分地插入間隙，造成檢測特異性降低。理論上，納米柱MO的高度越高，能夠插入到兩個納米柱間隙中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞突起部分就越多，使得循環(huán)腫瘤細(xì)胞與納米柱陣列的相互作用增強(qiáng)，提高了捕獲的特異性。 但是，在實(shí)際生產(chǎn)中，如果納米柱MO的高度過高，工藝的復(fù)雜性和生產(chǎn)成本也會成倍增力口，這會影響本實(shí)用新型循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備的臨床推廣。因此，在本實(shí)用新型的一個實(shí)施方式中，納米柱240優(yōu)選具有1 μ m至10 μ m的高度，更優(yōu)選具有1 μ m至2 μ m的高度，以最大程度實(shí)現(xiàn)捕獲效果與成本效益的平衡。如圖2所示，納米柱MO的形狀為圓柱形，但本實(shí)用新型不限于此。根據(jù)需要，納米柱MO的形狀可為圓柱形、三棱柱形、四棱柱形等。在一個實(shí)施方式中，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置進(jìn)一步包括用于容納三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)230的具有至少一個手柄210的外殼220。在圖2中，外殼220的形狀為矩形，但本實(shí)用新型不限于此。根據(jù)需要，外殼220的形狀可為圓形，橢圓形，多邊形，如三角形、四邊形、五邊形、六邊形等。同理，外殼220中容納的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)230的形狀也可以相應(yīng)地為圓形，橢圓形，多邊形，如三角形、四邊形、五邊形、六邊形等。圖3是根據(jù)本實(shí)用新型一個實(shí)施方式的具有三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的本實(shí)用新型的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備的示意性側(cè)視圖。如圖3所示，外殼320具有圍繞三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)330的側(cè)壁，且具有納米柱340 的基質(zhì)330置于外殼320底部上。在圖3中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備僅容納了一個三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)330，并具有一個手柄。在圖3所示的實(shí)施方式中，該循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備的外殼320可具有約4-5cm的長度，約l-2cm的寬度，和約34cm的高度。外殼320所容納的總體積為約7. 5mL。但顯然本實(shí)用新型不限于此。為提高檢測效率并降低成本，本實(shí)用新型的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備可優(yōu)選容納2 個或更多個三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)。為了避免樣品之間相互交叉污染，各基質(zhì)間可由側(cè)壁間隔開以構(gòu)成獨(dú)立的小室。對小室的形狀沒有特別規(guī)定，只要能方便操作即可。例如，根據(jù)上述各種三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的形狀，小室可為矩形，也可為圓形，橢圓形，多邊形，如三角形、四邊形、五邊形、六邊形等。各小室的大小也沒有特別限制，只要能容納基質(zhì)即可。例如可具有約(0. 3-2) X (0. 3-2) cm2的底部，側(cè)壁高度可為約0. 5-2cm。如圖3所示，外殼320上還可具有至少一個，如兩個手柄310以利于拿取。手柄 310的形狀和大小同樣沒有特別限制，只要能夠便于拿取外殼即可。手柄310的長度可約為1-2厘米。外殼320和手柄310可采用任何適宜的材料，例如聚合物材料，諸如聚乙烯、聚丙烯等聚烯烴材料，諸如聚碳酸酯等聚酯材料等；金屬材料，如不銹鋼，只要其價格低廉，不影響循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備的使用即可，但優(yōu)選能夠通過適當(dāng)?shù)那懈罟ぞ呷缬嬎銠C(jī)數(shù)字控制機(jī)器批量制備。為了進(jìn)一步提高捕獲效率，可在三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的上表面和/或納米柱的側(cè)壁上涂覆抗循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體。優(yōu)選地，所述抗循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體是抗EpCAM抗體(抗上皮細(xì)胞粘連分子抗體，“anti-印ithelial cell adhesion molecule antibody”)，優(yōu)選為生物素化的抗EpCAM抗體。循環(huán)腫瘤細(xì)胞突起中的某些多肽或蛋白質(zhì)會與這些特異性抗體結(jié)合，更進(jìn)一步地增強(qiáng)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞域三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的相互作用，提高了捕獲效率。第二方面，本實(shí)用新型提供了一種制造循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置的方法，所述方法包括以下步驟用模具對生物相容的聚合物基質(zhì)進(jìn)行納米壓印，所述模具具有能使所述生物相容的聚合物基質(zhì)產(chǎn)生與所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)匹配的納米柱陣列結(jié)構(gòu)；和將所述模具與所述聚合物基質(zhì)分離。圖4是根據(jù)本實(shí)用新型一個實(shí)施方式的用納米壓印技術(shù)制備三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的示例性步驟。圖如顯示了由主體410和模塑層420組成的模具。模塑層420具有多個凸起430。 這些凸起430的排列成能使本實(shí)用新型的聚合物基質(zhì)440產(chǎn)生納米柱陣列結(jié)構(gòu)，并使由納米柱組成的陣列結(jié)構(gòu)與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)相匹配。例如，凸起430能產(chǎn)生具有如IOOnm至200nm的直徑、IOOnm至200nm的間距和至少500nm的高度的納米柱。模塑層 420和凸起430的硬度應(yīng)大于聚合物基質(zhì)的硬度，優(yōu)選其硬度是基質(zhì)硬度的2倍、3倍、4倍或更高。例如可為銅、硅等材料。在一個實(shí)施方式中，采用硅作為模具材料，將模具用高精密度小型碾磨機(jī)碾磨形成諸如柱、洞和溝等微特征。在另一個實(shí)施方式中，采用包括電子束平板印刷術(shù)、反應(yīng)性離子蝕刻和其他適當(dāng)方法在硅模具上形成所需圖案。圖4b和圖如顯示了單次壓印模塑步驟，其中該模具以箭頭450所示的方向被熱壓入基質(zhì)440中，隨后該模具以箭頭470標(biāo)出的方向離開基質(zhì)440中。因?yàn)槟＞叩挠捕雀哂诨|(zhì)440的硬度，當(dāng)在一定溫度和壓力條件下將模具壓入基質(zhì)440中時，在基質(zhì)440上會形成多個凸起460和凹陷的壓印區(qū)。在將模具取出后，在基質(zhì)440中會形成與模具上的微特征相對應(yīng)的圖案，從而完成納米壓印過程。圖4d顯示了將該模具以箭頭480所示方向移到基質(zhì)440之上的另一個位置。如圖4d所示，通過重復(fù)圖如-如的步驟，易于在基質(zhì)440上形成所需的納米結(jié)構(gòu)特征。在一個實(shí)施方式中，模具可以固定，聚合物可以卷繞。通過重復(fù)進(jìn)行圖的步驟，可以在基質(zhì)440上重復(fù)、連續(xù)地形成許多納米結(jié)構(gòu)特征。借助這種簡單的卷繞式印刷方法，縮短了制備階段，提高了產(chǎn)量。納米壓印的工藝步驟、條件和所用設(shè)備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可參見如《納米壓印技術(shù)》，孫洪文，電子工業(yè)出版社，2011年1月。納米壓印工藝步驟簡單，適用于在工業(yè)規(guī)模上對本實(shí)用新型所采用的生物相容的聚合物進(jìn)行加工，以在其表面形成與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)相匹配的納米柱陣列結(jié)構(gòu)。本實(shí)用新型的方法優(yōu)選進(jìn)一步包括將如上所述的抗循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體涂覆到所述聚合物基質(zhì)的表面上的步驟。[0057]此外，還優(yōu)選包括制造一個如上所述的具有至少一個手柄的外殼，并將所述聚合物基質(zhì)置于其中的步驟。第三方面，本實(shí)用新型提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置在癌癥診斷中的應(yīng)用。在臨床應(yīng)用中，將血液樣品置于循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置內(nèi)，由于三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的強(qiáng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲能力，循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞能夠以靜態(tài)方式得到分離。計算待檢測血液樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目，并與各種癌癥的確診標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，以進(jìn)行癌癥的確診判斷。綜上所述，本實(shí)用新型具有以下優(yōu)點(diǎn)本實(shí)用新型選用廉價且有效的生物相容的聚合物材料，此材料的物理和化學(xué)性質(zhì)適合用作捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)材料，且可以采用適合產(chǎn)業(yè)化的納米壓印技術(shù)來進(jìn)行加工；本實(shí)用新型選用了適于產(chǎn)業(yè)化的納米壓印技術(shù)來加工生物相容的聚合物材料，所希望的基質(zhì)圖案僅需通過簡單的壓印-釋放步驟即可從模板復(fù)制而來；本實(shí)用新型的捕獲裝置可容納多個用于檢測不同樣品的基質(zhì)且具有便于拿取的手柄，這極大方便了本實(shí)用新型捕獲裝置在臨床上的應(yīng)用；本實(shí)用新型的捕獲裝置具有已根據(jù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面特征圖案化的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，其在臨床上的應(yīng)用將會極大提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測、捕獲、診斷特異性；且本實(shí)用新型的捕獲裝置中可進(jìn)一步涂覆有特異性抗體，因此可同時利用拓?fù)鋵W(xué)和免疫組化的原理來實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲，進(jìn)一步提高了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測、捕獲、診斷特異性。利用這些特征并綜合考慮成本和目的，本實(shí)用新型能夠用廉價的聚合物三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)實(shí)現(xiàn)高循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲效率，這種三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)極具成本優(yōu)勢且可以通過簡單的納米壓印技術(shù)批量生產(chǎn)。將目前尚處在實(shí)驗(yàn)室階段且用于研究目的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置用于臨床，仍需要克服如材料選擇，工藝選擇等許多技術(shù)困難，且還需要兼顧考慮臨床檢測中對產(chǎn)品一次性使用的需要，因此，本實(shí)用新型提供了迄今為止臨床實(shí)用性最好的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲技術(shù)方案，本實(shí)用新型的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置可一次性地用于癌癥診斷和治療中。實(shí)施例實(shí)施例1
_9] ^mmmmmmmmmMmmwmm.用于壓印基質(zhì)的模具采用硅材料制成。通過電子束平板印刷術(shù)在模具表面上形成具有IOOnm直徑、IOOnm間距和500nm高度的納米柱的納米柱陣列結(jié)構(gòu)。采用聚丙烯酸甲酯作為生物相容的聚合物材料，用加工好的模具對其進(jìn)行卷繞式納米壓印。納米壓印采用本領(lǐng)域所用的常規(guī)的工藝條件進(jìn)行，具體工藝參見《納米壓印技術(shù)》，孫洪文，電子工業(yè)出版社，2011年1月。實(shí)施例2^mmmmmmmmmMmmwmm.采用與實(shí)施例1相同的方法制造循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，區(qū)別在于模具表面的納米柱陣列結(jié)構(gòu)為200nm直徑、200nm間距和15 μ m高度，且采用聚丙烯酸甲酯作為生物相容的聚合物材料。實(shí)施例3▲棚____胞搬采用與實(shí)施例1相同的方法制造循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，區(qū)別在于模具表面的納米柱陣列結(jié)構(gòu)為150nm直徑、150nm間距和10 μ m高度，采用聚二甲基硅氧烷作為生物相容的聚合物材料，且在納米柱陣列的底部和納米柱的側(cè)壁涂覆抗EpCAM抗體。實(shí)施例4▲棚____胞搬采用與實(shí)施例1相同的方法制造循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，區(qū)別在于模具表面的納米柱陣列結(jié)構(gòu)為150nm直徑、150nm間距和2 μ m高度，采用聚二甲基硅氧烷作為生物相容的聚合物材料，且在納米柱陣列的底部和納米柱的側(cè)壁涂覆抗EpCAM抗體。文中已公開了示例性實(shí)施方式，盡管使用了具體的術(shù)語，但它們僅以普通的和描述性含義來使用及解釋并不用于限制的目的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)上的改變，而不脫離以下權(quán)利要求中給出的本實(shí)用新型的范圍。
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權(quán)利要求1.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，所述裝置包括表面具有納米柱陣列結(jié)構(gòu)的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，所述納米柱陣列結(jié)構(gòu)與所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)相匹配，其中，所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)由生物相容的聚合物制成。
2.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述納米柱陣列結(jié)構(gòu)中的納米柱的直徑為IOOnm至200nm。
3.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述納米柱陣列結(jié)構(gòu)中的納米柱的間距為IOOnm至200nm。
4.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述納米柱陣列結(jié)構(gòu)中的納米柱的高度至少為500nm。
5.如權(quán)利要求4所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述納米柱的高度為500nm至 15 μ m0
6.如權(quán)利要求5所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述納米柱的高度為1μ m至 2 μ m0
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置進(jìn)一步包括用于容納所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的具有至少一個手柄的外殼。
8.如權(quán)利要求7所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述外殼中容納多個所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，且各個所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)間由側(cè)壁間隔開。
9.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)的上表面和/或所述納米柱的側(cè)壁涂覆有抗循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體。
10.如權(quán)利要求9所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置，其中所述特異性抗體為抗EpCAM抗體。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲裝置。所述裝置包括表面具有納米柱陣列結(jié)構(gòu)的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，所述納米柱陣列結(jié)構(gòu)與所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面突起結(jié)構(gòu)相匹配，其中，所述三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)由生物相容的聚合物制成。由于該裝置的三維納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)采用生物相容性聚合物，且通過納米壓印方法制造，因此成本低廉，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，可一次性用于臨床診斷。
文檔編號C12M1/00GK202279815SQ2011202556
公開日2012年6月20日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者杜昭輝, 賴勝 申請人:西門子公司