專利名稱：具有抗炎癥活性的香菇β-葡聚糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗炎癥活性的棒狀香菇β-葡聚糖及其制備方法。它屬于高分子物理領(lǐng)域，也屬于生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
炎癥是宿主對(duì)內(nèi)在或外在環(huán)境刺激的一種響應(yīng)。該響應(yīng)過程嚴(yán)格受控于生理?xiàng)l件，短時(shí)間內(nèi)的急性炎癥具有治療效果，然而由于生理失控導(dǎo)致炎癥持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)或轉(zhuǎn)變成慢性炎癥時(shí)，它就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害作用，甚至導(dǎo)致一些重大疾病出現(xiàn)，如心腦血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、老年癡呆癥、自身免疫性疾病和癌癥等。近年來(lái)，很多研究者致力于抗炎癥藥物的研究和開發(fā)。在眾多抗炎癥藥物中，有機(jī)化合物類居多，不可避免地會(huì)產(chǎn)生不同程度的毒副作用。香菇(Lentinus edodes)是一種兼食用和藥用為一體的大型真菌，香菇中最重要的香菇多糖有很明顯的抗腫瘤活性，增強(qiáng)宿主對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲感染的抵抗能力，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性等多種生物學(xué)和免疫學(xué)活性。香菇多糖有多種類型，目前研究表明，香菇多糖中存在四種雜多糖(L-FI_L-FIVn)和兩種葡聚糖(L-FV和 L-FVIn)。但對(duì)香菇多糖的進(jìn)一步研究相對(duì)較少，尤其是新多糖的發(fā)現(xiàn)和研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗炎癥活性的棒狀香菇葡聚糖，該葡聚糖具有顯著的抑制LPS(革蘭氏陰性菌)誘導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)因子一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子 (TNF-α)、白細(xì)胞介素IL-Ia和IL-1 γ α等的釋放。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于還提供上述香菇葡聚糖的制備方法，該制備方法簡(jiǎn)單易行、成本較低廉。本發(fā)明目的還在于提供上述香菇β -葡聚糖在制備抗炎癥或提高免疫機(jī)能的藥物或保健品中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種具有抗炎癥活性的棒狀香菇葡聚糖， 其主鏈為β - (1 —幻-葡聚糖，平均每7 10個(gè)主鏈葡萄糖殘基含2 3個(gè)(1 — 6)鍵接的葡萄糖側(cè)基，它在水中呈棒狀鏈。研究表明，該葡聚糖具有顯著的抑制LPS (革蘭氏陰性菌)誘導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)因子一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子(TNF-a)釋放的作用。本發(fā)明還提供了上述棒狀香菇葡聚糖的制備方法，其包括如下步驟將香菇子實(shí)體粉碎，脫脂，用生理鹽水浸泡，離心，收集殘?jiān)?；取殘?jiān)?00 130°c沸水下提取，離心，收集殘?jiān)诩兯羞M(jìn)行超聲提取，離心得提取液；提取液脫色后，除去游離的蛋白質(zhì)，用水透析，濃縮，冷凍干燥得到白色香菇β -葡聚糖純品。對(duì)于香菇子實(shí)體，采用干燥子實(shí)體，更易于粉碎，優(yōu)選可以粉碎至3 7目，使其提取效率更高。其中所述脫脂的方法可以采用索氏提取法提取去除脂肪，具體可以依次用乙酸乙酯、丙酮作為提取溶劑進(jìn)行，提取6 10小時(shí)。生理鹽水浸泡可以去除細(xì)胞壁外的水溶性小分子，浸泡時(shí)間為8 M小時(shí)，重復(fù) 1 4次。其中所述沸水提取方法是用殘?jiān)? 5倍體積的水煮20 40分鐘，重復(fù)1 4 次。其中所述超聲提取的條件為溫度20 30°C，頻率18 30KHz，功率400 600W， 時(shí)間16 20min。其中所述脫色可以用H2A進(jìn)行脫色。其中所述游離蛋白的去除采用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，一般6 10次。本發(fā)明香菇葡聚糖具有顯著的抑制LPS(革蘭氏陰性菌)誘導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)因子一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF-α )、白細(xì)胞介素IL-I α和IL-1 γ α等的釋放。因而本發(fā)明香菇葡聚糖可以用于抗炎癥或提高免疫機(jī)能的藥物或保健品中。進(jìn)而，本發(fā)明還提供含有上述香菇β-葡聚糖的抗炎癥或提高免疫機(jī)能的藥物或保健品。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、該β-葡聚糖來(lái)源于我國(guó)特產(chǎn)資源，產(chǎn)量豐富、成本低廉；2、該β-葡聚糖提取工藝簡(jiǎn)單，提取過程容易控制；3、該β -葡聚糖抑制NO和TNF- α效率高，可達(dá)70 %以上；抑制IL_1 α和 IL-I γ α 可達(dá) 100%。4、該β -葡聚糖無(wú)毒副作用，生物相容性好。


圖1.香菇β -葡聚糖LNT-S的13CNMR, IR,和GC圖譜。圖2.香菇β -葡聚糖LNT-S對(duì)LPS體外誘導(dǎo)的炎癥因子__Ν0(圖2Α)和 TNF-a (圖2B)的抑制率。圖3. LNT-S對(duì)炎癥因子合成酶iNOS (圖3A)、炎癥基因iNOSmRNA (圖3B)和 TNF-amRNA(圖3C)表達(dá)的抑制。圖4. LNT-S對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL_1 α和IL_1 γ α的抑制率。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的生化試劑為市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1購(gòu)買市售的湖北隨州產(chǎn)香菇子實(shí)體，取香菇子實(shí)體200g，粉碎至5目，依次用乙酸乙酯600ml、丙酮600ml進(jìn)行索氏提取各8小時(shí)。然后用0. 9% NaCl水溶液在室溫下攪拌過夜，離心，收集殘?jiān)貜?fù)三次。殘?jiān)?倍體積的熱水(100°C )浸提三次，每次半小時(shí)， 離心，收集殘?jiān)?；殘?jiān)诩兯羞M(jìn)行超聲波提取(25°C，20KHZ，600W，16min)離心得提取液； 上清提取液用H2A脫色，6次Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)后，分別用清水和二次蒸餾水透析 (cutoff Mw = 8，000)，濃縮，冷凍干燥得到香菇β -葡聚糖(LNT-S)。用NMR, IR, GC-MS等證明LNT-S為—:3)-D-葡聚糖，平均每10個(gè)主鏈葡萄糖殘基含3個(gè)(1 — 6)鍵接的葡萄糖側(cè)基。用粘度計(jì)、光散射及其與尺寸排除色譜聯(lián)用儀檢測(cè)各多糖試樣的特性粘數(shù)、重均分子量和均方旋轉(zhuǎn)半徑，按照高分子溶液理論和方法及計(jì)算機(jī)模擬，計(jì)算出表征高分子在溶液中鏈的分子參數(shù)，由此推斷出LNT-S在水溶液中呈現(xiàn)棒狀鏈構(gòu)象。香菇β -葡聚糖LNT-S對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子——NO和TNF- α的抑制率見圖2。 (NO用Griess試劑檢測(cè)，TNF- α用Elisa Kit檢測(cè))顯然，該多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子具有抑制率具有劑量依賴性。高劑量時(shí)顯示較高抗炎癥活性，NO和TNF- α抑制率分別達(dá)70%以上。同時(shí)，LNT-S顯著抑制了 LPS誘導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)酶iNOS和炎癥基因iNOS mRNA、TNF- α mRNA的表達(dá)，抑制率達(dá)70 %以上，結(jié)果見圖3。實(shí)施例2購(gòu)買市售的湖北隨州產(chǎn)香菇子實(shí)體，取香菇子實(shí)體200g，粉碎至3目，依次用乙酸乙酯500ml、丙酮500ml進(jìn)行索氏提取各6小時(shí)。然后用生理鹽水在室溫下攪拌8小時(shí)，離心，收集殘?jiān)?，重?fù)4次。殘?jiān)?倍量的熱水(120°C )浸提4次，每次20min，離心，收集殘?jiān)?；殘?jiān)诩兯羞M(jìn)行超聲波提取(3(TC，18KHZ，500W，20min)離心得提取液；上清提取液用H2A脫色，5次Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)后，分別用清水和二次蒸餾水透析(cutoff Mw = 8，000)，濃縮，冷凍干燥得到香菇β -葡聚糖(LNT-幻。經(jīng)鑒定，其與實(shí)施例1制得的香菇β-葡聚糖(LNT-S)相同。實(shí)施例3購(gòu)買市售的湖北隨州產(chǎn)香菇子實(shí)體，取香菇子實(shí)體200g，粉碎至3目，依次用乙酸乙酯500ml、丙酮500ml進(jìn)行索氏提取各10小時(shí)。然后用生理鹽水在室溫下攪拌M小時(shí)， 離心，收集殘?jiān)?，重?fù)2次。殘?jiān)?倍量的熱水(120°C )浸提2次，每次40min，離心，收集殘?jiān)粴堅(jiān)诩兯羞M(jìn)行超聲波提取(2(TC，30KHZ，500W，18min)離心得提取液；上清提取液用H2A脫色，10次Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)后，分別用清水和二次蒸餾水透析(cutoff Mw = 8，000)，濃縮，冷凍干燥得到香菇β -葡聚糖(LNT-幻。經(jīng)鑒定，其與實(shí)施例1制得的香菇β-葡聚糖(LNT-S)相同。實(shí)施例4所用香菇子實(shí)體為福建產(chǎn)。將香菇子實(shí)體200g粉碎至7目依次用乙酸乙酯500mL、 丙酮700mL進(jìn)行索氏提取各8小時(shí)。然后用0. 9% NaCl水溶液在室溫下提取三次浸泡在0.9% NaCl水溶液中過夜，離心，收集殘?jiān)?。殘?jiān)脽崴?130°C)提取三次，每次半小時(shí)，離心，收集殘?jiān)?；殘?jiān)诩兯羞M(jìn)行超聲波提取(25°C，30KHZ，400W，20min)，離心得提取液；上清提取液用H2A脫色，8次Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)后，分別用清水和二次蒸餾水透析，濃縮，冷凍干燥得到香菇β -葡聚糖(LNT-S)。用NMR、IR、GC-MS等證明LNT-S為 β _(1 — ；3)-D-葡聚糖，平均每7個(gè)主鏈葡萄糖殘基含2個(gè)(1 — 6)鍵接的葡萄糖側(cè)基。多糖構(gòu)象表征方法同實(shí)施例1。結(jié)果表明該多糖在水溶液中呈現(xiàn)棒狀鏈構(gòu)象，而在DMSO中均呈現(xiàn)單股無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象。LNT-S對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)因子的抑制作用見圖4。由圖4可知，LNT-S完全抑制了 LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-I α和IL-I γ α的釋放， 即抑制率達(dá)到100%。因此，香菇β-葡聚糖可用于制備抗炎癥藥物和提高機(jī)體免疫功能的保健品，具有極大的推廣和應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種具有抗炎癥活性的香菇β-葡聚糖，主鏈為—；3)-葡聚糖，平均每7 10個(gè)主鏈葡萄糖殘基含2 3個(gè)(1 — 6)鍵接的葡萄糖側(cè)基。
2.權(quán)利要求1所述香菇葡聚糖的制備方法，其包括如下步驟將香菇子實(shí)體粉碎， 脫脂，用生理鹽水浸泡，離心，收集殘?jiān)?；取殘?jiān)?00 130°C沸水下提取，離心，收集殘?jiān)诩兯羞M(jìn)行超聲提取，離心得提取液；提取液脫色后，除去游離的蛋白質(zhì)，用水透析，濃縮，冷凍干燥得到香菇葡聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述脫脂的方法是依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，生理鹽水浸泡時(shí)間為8 M小時(shí)，重復(fù) 1 4次。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述沸水提取方法是用殘?jiān)? 5倍體積的水煮20 40分鐘，重復(fù)1 4次。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，超聲提取的條件為20 30°C，頻率18 30KHz，功率 400 600W,時(shí)間 16 20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述脫色是用H2A脫色。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求1所述的香菇葡聚糖在制備抗炎癥或提高免疫機(jī)能的藥物或保健品中的應(yīng)用。
10.含有權(quán)利要求1所述香菇β-葡聚糖的抗炎癥或提高免疫機(jī)能的藥物或保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香菇β-葡聚糖，其主鏈為β-(1→3)-D-葡聚糖，平均每7～10個(gè)主鏈葡萄糖殘基含2～3個(gè)(1→6)鍵接的葡萄糖側(cè)基，它在水中呈棒狀鏈。其制法是，將香菇子實(shí)體粉碎，脫脂，用生理鹽水浸泡，離心，收集殘?jiān)蝗堅(jiān)?00～130℃沸水下提取，離心，收集殘?jiān)诩兯羞M(jìn)行超聲提取，離心得提取液；提取液脫色后，除去游離的蛋白質(zhì)，用水透析，濃縮，冷凍干燥得到香菇β-葡聚糖。本發(fā)明香菇β-葡聚糖具有顯著的激活巨噬細(xì)胞作用，以及較高的抑制炎癥調(diào)節(jié)因子NO和TNF-α釋放的效應(yīng)，可用于制備提高免疫機(jī)能和抗炎癥的藥物或保健品。
文檔編號(hào)A23L1/09GK102408495SQ20111044958
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者張俐娜, 許小娟, 賈學(xué)偉, 陳攀 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)