專利名稱：多參照內標法定量基因表達量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多參照內標法定量基因表達量的方法，屬于分子生物學領域。
背景技術：
反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) (RT-PCR)是指一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增的技術。對基因表達量的檢測，有多種方法。有直接測定RNA的Northern Blot法；有基于反轉錄聚合酶鏈式反應的、通過對PCR終產物進行監(jiān)測的凝膠圖像分析法；以及基于反轉錄聚合酶鏈式反應的、通過對PCR過程進行監(jiān)測的實時定量RT-PCR。Northern Blot是用 RNA探針雜交的方法進行定量，不需要反轉錄，但需要用RNA量較大，制作探針較復雜，而且要得到理想的效果也比較難；實時定量RT-PCR，程序簡單，容易得到好的結果，但儀器較貴，試劑成本大。傳統(tǒng)的RT-PCR凝膠圖像分析法，以RNA用量少、操作簡單、儀器和試劑相對于實時定量RT-PCR便宜，仍然為很多科學研究者用來定量基因表達量。傳統(tǒng)的RT-PCR凝膠圖像分析法，采用圖像分析軟件來比對凝膠圖像上的看家基因和被考察的基因的DNA譜帶，雖然能得出了相對表達量，但誤差極大，甚至出現(xiàn)相反的結論。這是由于圖像的像素點并不完全與DNA的拷貝數(shù)成簡單的直線相關，而且被考察的基因的原始拷貝數(shù)與看家基因的拷貝數(shù)相差甚遠，常常相差4-5個數(shù)量級，因而僅用凝膠圖像上的看家基因和被考察的基因的DNA譜帶的一對圖譜中的圖像參數(shù)進行計算來獲得被考察的基因的相對表達量，誤差極大。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是，提供一種多參照內標法定量基因表達量的方法，以克服傳統(tǒng)的RT-PCR凝膠圖像分析法因參照內標少，對基因表達量定量誤差大等缺陷。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用的技術方案包括以下步驟(1)將總RNA設置成一系列的倍數(shù)，并分別為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以這些互補DNA為模板，以看家基因設計出的引物為引物，以常規(guī)的統(tǒng)一反應體系進行PCR擴增，形成多個參照內標擴增產物；同時，將以稀釋到一定倍數(shù)的RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以此互補DNA為模板，分別以被考察的基因設計出的引物和看家基因設計出的引物為引物，以上述常規(guī)的統(tǒng)一反應體系進行PCR擴增，形成目標基因擴增產物和看家基因擴增產物；(2) 將目標基因擴增產物和看家基因擴增產物以及多個參照內標擴增產物同時電泳，獲得凝膠圖像；(3)將凝膠圖像處理成灰度圖像，經過亮度和對比度的調整，獲得表征圖像；(4)將表征圖像上的多個參照內標擴增產物的DNA圖譜的像素點與總RNA的倍數(shù)擬合成方程 log 7 = ζΓ+ ，這里的X為一個參照內標擴增產物的DNA圖譜區(qū)的像素點值，Y為對應的看家基因的倍數(shù)，a, b分別為方程的常數(shù)；(5)將表征圖像上的目標基因擴增產物和看家基因擴增產物的DNA圖譜的像素點分別帶入方程kg Γ = aX + b，分別計算出目標基因擴增份
額Y 和看家基因擴增份額Ymc ； (6)目標基因擴增份額Y 和看家基因擴增份額Ywc的比值，即為目的基因的相對表達量GE目標。本發(fā)明的優(yōu)點為本發(fā)明采用多參照內標同時擴增，根據(jù)凝膠圖像上的多參照內標擴增產物制定標準曲線，來反演看家基因和被考察的基因的份額，從而來獲取被考察基因的表達量。測定出的基因表達量數(shù)據(jù)具有很高的可靠性和精度，且操作簡單、儀器和試劑相對便宜。
具體實施例方式
具體實施例方式步驟一、將常規(guī)方法提取的待測生物樣本的總RNA設置成一系列的倍數(shù)，如1. 00,0. 1,0. 01,0. 001以及0. 0001。分別以各種倍數(shù)的總RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以這些互補DNA為模板，以看家基因設計出的引物為引物，以常規(guī)的統(tǒng)一反應體系進行PCR擴增，形成多個參照內標擴增產物。與此同時，將以稀釋到一定倍數(shù)，如0. 1倍的總RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以此互補DNA為模板分別以被考察的基因設計出的引物和看家基因設計出的引物為引物，以上述常規(guī)的統(tǒng)一反應體系，進行PCR擴增，形成目標基因擴增產物和看家基因擴增產物。步驟二、將目標基因擴增產物和看家基因擴增產物以及多個參照內標擴增產物同時電泳，獲得凝膠圖像。步驟三、將凝膠圖像處理成灰度圖像，經過亮度和對比度的調整，獲得表征圖像。步驟四、將表征圖像上的多個參照內標擴增產物的DNA圖譜的像素點與總RNA的倍數(shù)擬合成方程log7 = ‘ + A ,這里的χ為一個參照內標擴增產物的DNA圖譜區(qū)的像素點值，Y為對應的看家基因的倍數(shù)，a，b為方程的常數(shù)。步驟五、將表征圖像上的目標基因擴增產物和看家基因擴增產物的DNA圖譜的像素點分別帶入上述方程log Y =讓+b，分別計算出目標基因擴增份額Y目‘和看家基因擴增份額Y 。步驟六、目標基因擴增份額Ygfe和看家基因擴增份額Y看家的比值，即為目的基因的相對表達量GE目標。以下提供本發(fā)明具體應用的實施例棉花黑斑病侵染棉花過程中的棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(必/^7>7)的表達量的監(jiān)測。分別種植和培養(yǎng)棉花以及棉花輪紋菌(Altemaria macrospora)0棉花在溫室培養(yǎng)45天后開始輪紋菌的感染。感染采取噴霧的方式，將處在生長對數(shù)期的輪紋菌噴在健康的植株葉片上，放于溫室內培養(yǎng)，溫度，濕度，光照時間分別設置為^°C，60%和15小時，用干凈的塑料袋將整株罩住，培養(yǎng)一周，每隔一天取材。對照組取的是健康的植株噴上蒸餾水，用潔凈的塑料罩住，同樣的條件培養(yǎng)。被感染及對照組棉花總RNA的提取以及棉花多聚半乳糖醛酸酶基因的RT-PCR采用常規(guī)方法(黃華坤，吳沿友，許文祥，周秋月，棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆、序列及表達譜分析，河南農業(yè)科學，2008年第6期， 31-35)?？醇一驗锳ctin?？俁NA被稀釋到1. 00,0. 1,0. 01,0. 001以及0. 0001倍。分別以各種倍數(shù)的總RNA 為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以這些互補DNA為模板，以Actin基因設計出的引物為引物，以常規(guī)的統(tǒng)一反應體系進行PCR擴增(黃華坤，吳沿友，許文祥，周秋月，棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆、序列及表達譜分析，河南農業(yè)科學，2008年第6期，31-35)，形成多個參照內標擴增產物。與此同時，將以稀釋到0. 1倍的總RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以此互補DNA為模板分別以必/7識>1基因設計出的引物和看家基因 Actin設計出的引物為引物，以上述常規(guī)的統(tǒng)一反應體系，進行PCR擴增，形成基因擴增產物和看家基因Actin擴增產物。將GhpgiiA基因擴增產物和看家基因Actin擴增產物以及多個參照內標擴增產物同時電泳，獲得凝膠圖像。將凝膠圖像處理成灰度圖像，經過亮度和對比度的調整，獲得了表征圖像。將表征圖像上的多個參照內標擴增產物的DNA圖譜的像素點與總RNA的倍數(shù)的方程為IogF = 0.0000911-4.93 75 ,R2=0. 98755，這里的R2 為決定系數(shù)的平方。隨后，再將表征圖像上的基因擴增產物和看家基因Actin擴增產物的DNA圖譜的像素點分別帶入上述方程log F = 0.0000911-4.937575，分別計算出
Ghpgipl基因擴增份額Y _和看家基因Actin擴增份額Y ’ Ghpgipl基因擴增份額Y _ 和看家基因Actin擴增份額Ywc的比值，即為GhpgipY基因的相對表達量GE _。應用本發(fā)明分別對感染株與健康株的GhpgipY基因表達進行檢測，結果如表1。表1應用本發(fā)明和傳統(tǒng)傳統(tǒng)的RT-PCR凝膠圖像分析法獲得的基因相對表達量和感染株相對于健康株基因表達量
權利要求
1. 一種多參照內標法定量基因表達量的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將總RNA設置成一系列的倍數(shù)，并分別為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以這些互補DNA 為模板，以看家基因設計出的引物為引物，以常規(guī)的統(tǒng)一反應體系進行PCR擴增，形成多個參照內標擴增產物；同時，將以稀釋到一定倍數(shù)的RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA， 再以此互補DNA為模板，分別以被考察的基因設計出的引物和看家基因設計出的引物為引物，以上述常規(guī)的統(tǒng)一反應體系進行PCR擴增，形成目標基因擴增產物和看家基因擴增產物；(2)將目標基因擴增產物和看家基因擴增產物以及多個參照內標擴增產物同時電泳， 獲得凝膠圖像；(3)將凝膠圖像處理成灰度圖像，經過亮度和對比度的調整，獲得表征圖像；(4)將表征圖像上的多個參照內標擴增產物的DNA圖譜的像素點與總RNA的倍數(shù)擬合成方程log 7 = + ,這里的χ為一個參照內標擴增產物的DNA圖譜區(qū)的像素點值，Y為對應的看家基因的倍數(shù)，a, b分別為方程的常數(shù)；(5)將表征圖像上的目標基因擴增產物和看家基因擴增產物的DNA圖譜的像素點分別帶入方程bgf = ‘ + ，分別計算出目標基因擴增份額Y 和看家基因擴增份額Ywc ； (6)目標基因擴增份額Y 和看家基因擴增份額YMc的比值，即為目的基因的相對表達量GE目標。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多參照內標法定量基因表達量的方法，包括以下步驟(1)形成目標基因擴增產物和看家基因擴增產物；(2)將目標基因擴增產物和看家基因擴增產物以及多個參照內標擴增產物同時電泳，獲得凝膠圖像；(3)將凝膠圖像經圖像處理，獲得表征圖像；(4)將表征圖像上的多個參照內標擴增產物的DNA圖譜的像素點與總RNA的倍數(shù)擬合成方程；(5)將表征圖像上的目標基因擴增產物和看家基因擴增產物的DNA圖譜的像素點分別帶入方程，計算出目標基因擴增份額Y目標和看家基因擴增份額Y看家；(6)目標基因擴增份額Y目標和看家基因擴增份額Y看家的比值為目的基因的相對表達量GE目標。
文檔編號C12Q1/68GK102352414SQ20111031662
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權日2011年10月18日
發(fā)明者吳沿友, 李海濤, 黃華坤 申請人:中國科學院地球化學研究所