專利名稱：豬氟烷基因快速分型試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬氟烷基因快速分型試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氟烷基因(Hal)又稱蘭尼定受體基因(RYRl)或鈣離子釋放通道基因，是導(dǎo)致豬應(yīng)激綜合征(Porcine stress syndrome，PSS)的主效基因。該基因定位在豬染色體6pll_q21上，它是由RYRl中C1843突變?yōu)門1843，使受體蛋白第615位精氨酸變成了半胱氨酸，引起結(jié)構(gòu)與功能的改變。當(dāng)應(yīng)激因子作用時(shí)，Ca2+大量非正常釋放，引起肌肉持續(xù)收縮，從而產(chǎn)生PSS，其表現(xiàn)為呼吸急促、心跳加快、肌肉僵直、后肢呈現(xiàn)痙攣性收縮，甚至死亡，屠宰后產(chǎn)^PSE(Pale, soft, exudative)肉或 DFD(Dark，firm, dry)肉，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)研究，氟烷基因陽(yáng)性純合子豬(rm)，即使采用最優(yōu)處理?xiàng)l件，其產(chǎn)生PSE肉的比率也高達(dá)80%以上。雜合子豬(Nn)產(chǎn)生各種劣質(zhì)肉的比率達(dá)到36.8%，顯著高于陰性純合子(NN) 22. 5%的水平。氟烷基因作為影響肉質(zhì)的主效基因已經(jīng)廣泛用于豬的標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection)，據(jù)歐盟2008年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在歐盟25國(guó)，每年有120 480萬(wàn)只豬接受氟烷基因的篩選，在中國(guó)雖然沒(méi)有詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)調(diào)查，但是氟烷基因標(biāo)記輔助選擇也廣泛應(yīng)用于各大商業(yè)豬場(chǎng)。隨著氟烷基因標(biāo)記輔助選擇的普及，迫切需要一種高效率，高通量且高準(zhǔn)確率的技術(shù)來(lái)解決如此龐大規(guī)模的基因分型。高分辨率熔解(High Resolution Melt,HRM)是一種最新的遺傳學(xué)分析方法，主要是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)度，GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，其分辨精度可以達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。主要是依賴于精確的檢測(cè)DNA雙鏈熔解熒光曲線，如同許多熒光PCR技術(shù)一樣，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，從而對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，HRM源于熔解曲線，原理與普通熔解曲線分析是一致的，二者不同之處主要表現(xiàn)在升溫速率和所用的染料。HRM用的是飽和染料(dye EvaGreen)，高濃度的染料飽和了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過(guò)程中就不會(huì)發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。HRM技術(shù)特別適用于樣本量多、檢測(cè)位點(diǎn)較少的SNP、突變或甲基化分析，是不同于基因芯片檢測(cè)方法(檢測(cè)位點(diǎn)多，樣本少)的高通量方法。HRM檢測(cè)SNP是依據(jù)在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行變性，期間實(shí)時(shí)檢測(cè)體系內(nèi)熒光信號(hào)。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨(dú)特的序列，因而也就有了獨(dú)特的熔解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子、雜合子和突變性純合子。HRM的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)是無(wú)需序列特異性探針；操作簡(jiǎn)便、快速，使用成本低；可對(duì)未知位點(diǎn)進(jìn)行篩查；較高通量；高靈敏度；特異性、重復(fù)性好；適用范圍廣。它僅僅通過(guò)PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測(cè)PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)用在突變掃描、序列配對(duì)和基因分型等多個(gè)方面。憑借其速度和簡(jiǎn)便性，高分辨率熔解這種方法正在迅速普及。對(duì)于豬氟烷基因C1843T突變進(jìn)行基因分型的傳統(tǒng)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性法(PCR-SSCP)，其中PCR-RFLP法最為常用，該方法通常按照以下步驟進(jìn)行步驟一、對(duì)待檢樣本進(jìn)行預(yù)處理，提取基因組DNA ；步驟二、特異性引物的制備設(shè)計(jì)和合成上、下游引物一對(duì)，用于PCR擴(kuò)增特定片斷(片段必須包括氟烷基因的1843位點(diǎn))；步驟三、PCR擴(kuò)增目的DNA片段；步驟四、根據(jù)擴(kuò)增片段上的限制性酶切位點(diǎn)，用特異的限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切；步驟五、對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，分析待測(cè)樣本的基因型。PCR-RFLP法由于步驟繁瑣且酶切反應(yīng)后需要進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，使其耗時(shí)長(zhǎng)、通量小且準(zhǔn)確性受主觀因素影響，一直很難適用于大規(guī)模的氟烷基因篩選。僅對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，傳統(tǒng)的PCR-RFLP法需要14 16小時(shí)，如果對(duì)于大批量的樣本進(jìn)行掃描分型，工作量和耗時(shí)都是無(wú)法想象的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服上述傳統(tǒng)方法的技術(shù)缺陷，基于HRM技術(shù)，提供一種豬氟烷基因快速分型試劑盒及其檢測(cè)方法。該方法通量大，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高且鑒定簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明中的這種豬氟烷基因快速分型試劑盒，其試劑包括引物預(yù)混液、HRM PCR預(yù)混液禾口 Nuclease-free dH20o其中引物預(yù)混液混合液中兩條引物濃度均為10 μ M，引物序列如下上游引物GTTCCCTGTGTGTGTGCAATGGT下游引物GCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAATGHRM PCR預(yù)混液成分及體積比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) 10XPCRBuffer (Mg2+Plus) dNTPMixture (各 2. 5mM) EvaGreen dye (1. 2 μ Μ) = 1 1 2 6。本發(fā)明提供的一種豬氟烷基因快速分型檢測(cè)方法，包括以下步驟步驟1 將引物預(yù)混液、HRM PCR預(yù)混液、Nuclease-free dH20以及提前抽提好的DNA樣本從_20°C冰箱中取出并在冰上融化；步驟2 配制反應(yīng)預(yù)混液；預(yù)混液體積根據(jù)待檢樣本的數(shù)量而定；步驟3 將反應(yīng)預(yù)混液混合均勻，并根據(jù)所需的體積分裝到PCR管中；步驟4 向分裝好反應(yīng)預(yù)混液的PCR中添加樣本DNA模板，并輕輕混勻；步驟5 根據(jù)優(yōu)化程序，調(diào)置好熒光定量?jī)x的工作程序；步驟6 將配制好的PCR管放到熒光定量PCR儀上，啟動(dòng)HRM程序；步驟7:數(shù)據(jù)分析本發(fā)明利用高分辨率溶解曲線技術(shù)，結(jié)合優(yōu)化設(shè)計(jì)的引物和反應(yīng)程序，能夠準(zhǔn)確地對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行氟烷基因分型，通過(guò)詳細(xì)的測(cè)試，本方法的準(zhǔn)確率為98. 67%，高于傳統(tǒng)的 PCR-RFLP 法(97. 33% ).該發(fā)明高效迅速，操作步驟簡(jiǎn)單，只需要一個(gè)PCR反應(yīng)和半個(gè)小時(shí)的溶解曲線分析即可完成，大大縮短了氟烷基因分型所需要的時(shí)間。對(duì)于單個(gè)樣本，傳統(tǒng)的PCR-RFLP法需要12-16小時(shí)，而本方法將所需時(shí)長(zhǎng)縮短到2小時(shí)以內(nèi)。本發(fā)明方法價(jià)格與傳統(tǒng)PCR-RFLP法相當(dāng)，所需費(fèi)用不到2. 5元/樣品，而傳統(tǒng)的方法也需要約2.1元/樣品。
本發(fā)明的方法完全閉管操作，可以避免繁瑣的開(kāi)管操作帶來(lái)的外源污染，大大降低了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。本發(fā)明方法通量大，一次可以同時(shí)對(duì)96或者384個(gè)樣本進(jìn)行基因分型檢測(cè)，適用于豬氟烷基因的大規(guī)模篩查，特別適用于大型商業(yè)豬場(chǎng)。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)化后的溶解曲線圖；圖2為用本發(fā)明中特異性引物對(duì)氟烷基因三種基因型進(jìn)行擴(kuò)增后的溶解峰3為20個(gè)樣品的氟烷基因分型結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1豬氟烷基因快速分型試劑盒，其試劑包括引物預(yù)混液、HRM PCR預(yù)混液和Nuclease-free dH20o其中引物預(yù)混液混合液中兩條引物濃度均為10 μ M，引物序列如下上游引物GTTCCCTGTGTGTGTGCAATGGT；下游引物GCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAATG；HRM PCR預(yù)混液成分及體積比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) 10XPCRBuffer (Mg2+Plus) dNTPMixture (各 2. 5mM) EvaGreen dye (1. 2 μ Μ) = 1 1 2 6。實(shí)施例2用上述試劑盒對(duì)豬氟烷基因快速分型步驟如下步驟1 將引物預(yù)混液、HRM PCR預(yù)混液、Nuclease-free dH20以及提前抽提好的DNA樣本(需要自行抽提，本試劑盒不提供抽提試劑和方法)從-20°C冰箱中取出并在冰上融化；步驟2 按照表1配制反應(yīng)預(yù)混液。預(yù)混液體積根據(jù)待檢樣本的數(shù)量而定，但是考慮配制分裝過(guò)程中無(wú)法避免的損耗，建議在理論體積基礎(chǔ)上多配置10%的反應(yīng)預(yù)混液；表1反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種豬氟烷基因快速分型試劑盒，其特征在于，包括引物預(yù)混液、HRM PCR預(yù)混液和Nuelease-free dH20 ；其中所述引物預(yù)混液混合液中兩條引物濃度均為 ο μ M，引物序列如下上游引物GTTCCCTGTGTGTGTGCAATGGT下游弓丨物GCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAATG所述HRM PCR預(yù)混液成分及體積比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) IOXPCRBuffer (Mg2+Plus) dNTPMixture (各 2. 5mM) EvaGreen dye (1. 2 μ Μ) = 1 1 2 6。
2.一種豬氟烷基因快速分型檢測(cè)方法，包括以下步驟步驟1 將引物預(yù)混液、HRM PCR預(yù)混液、Nuclease-free dH20以及提前抽提好的DNA樣本從-20°C冰箱中取出并在冰上融化；步驟2 配制反應(yīng)預(yù)混液；預(yù)混液體積根據(jù)待檢樣本的數(shù)量而定；步驟3 將反應(yīng)預(yù)混液混合均勻，并根據(jù)所需的體積分裝到PCR管中；步驟4 向分裝好反應(yīng)預(yù)混液的PCR中添加樣本DNA模板，并輕輕混勻；步驟5 根據(jù)優(yōu)化程序，調(diào)置好熒光定量?jī)x的工作程序；步驟6 將配制好的PCR管放到熒光定量PCR儀上，啟動(dòng)HRM程序；步驟7:數(shù)據(jù)分析。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬氟烷基因快速分型試劑盒，其試劑包括引物預(yù)混液、HRM PCR預(yù)混液和Nuclease-free dH2O。本發(fā)明還提供一種豬氟烷基因快速分型檢測(cè)方法；本發(fā)明方法通量大，一次可以同時(shí)對(duì)96或者384個(gè)樣本進(jìn)行基因分型檢測(cè)，適用于豬氟烷基因的大規(guī)模篩查，特別適用于大型商業(yè)豬場(chǎng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559865SQ201110313908
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者李學(xué)偉, 李明洲, 馬繼登 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)