專利名稱：鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的引物對及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的引物對及其應用。
背景技術：
禽流感和新城疫分別是由禽流感病毒和新城疫病毒引起的兩種病毒性傳染病。兩種傳染病發(fā)病急，傳播快，發(fā)病率高，對養(yǎng)殖業(yè)可造成致命性的打擊。流行于我國雞群的禽流感病毒的亞型主要為H5和H9亞型。流感病毒極易發(fā)生基因變異，從而導致抗原性的改變。因此，雖然我國已全面采取免疫措施，但H5和H9亞型流感病毒仍然在雞群中反復發(fā)生。 H5和H9亞型禽流感病毒基因和抗原特性的變異，導致常規(guī)血清學方法及分子生物學監(jiān)測方法無法檢出流行毒株，因此需要建立一種能夠檢出當前流行毒株的通用性良好的檢測方法。此外，流行病學調(diào)查表明，我國大部分地區(qū)雞群存在H3亞型流感病毒的血清陽性抗體， 且有從雞群中分離到H3亞型禽流感病毒的報道，因此，H3亞型禽流感病毒也應作為流感病毒監(jiān)測的對象之一。近年來，新城疫病毒和禽流感病毒引起雞群發(fā)病的臨床癥狀趨于相似， 無法用常規(guī)臨床診斷方法進行確診，迫切需要建立一種檢測方法用于新城疫和禽流感的鑒別診斷。對于傳統(tǒng)的檢測方法，如病毒分離、血凝抑制試驗、神經(jīng)氨酸酶試驗等，費時、費力，不能做出快速而及時的診斷；而且不能在同一檢測反應中檢測不同的對象，即無法同時進行鑒別診斷。RT-PCR方法具有敏感性高、特異性好、省時等特點，而且多重RT-PCR方法可以在一個反應中同時檢測多種病原。目前，國內(nèi)外還沒有能夠同時檢測新城疫和H3、H5、H9 亞型禽流感病毒的多重RT-PCR方法。因此，臨床上，迫切需要一種能快速鑒別診斷新城疫和不同亞型禽流感病毒的檢測方法，不但能夠確定病毒是否為新城疫病毒或禽流感病毒， 還能夠確定禽流感病毒的亞型，而且對當前的流行毒株具有很好的檢測覆蓋性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的引物對及其應用。本發(fā)明所提供的鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的引物對為PCR引物對組合物A，是下述1)-4)中的任意一種1)所述PCR引物對組合物A由如下4個引物對組成引物對NDV、引物對H3V、引物對H5V和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種；所述引物對NDV、引物對H3V、引物對H5V和引物對H9V均由兩條單鏈DNA組成；所述引物對NDV為序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈 DNA組成的引物對；所述引物對H3V為序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列表中序列4所示的單鏈 DNA組成的引物對；
所述引物對H5V為序列表中序列5所示的單鏈DNA和序列表中序列6所示的單鏈 DNA組成的引物對；所述引物對H9V為序列表中序列7所示的單鏈DNA和序列表中序列8所示的單鏈 DNA組成的引物對；2)所述PCR引物對組合物A由如下3個引物對組成所述引物對NDV、引物對H3V 和引物對H5V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H5亞型禽流感病毒中的至少一種；3)所述PCR引物對組合物A由如下3個引物對組成所述引物對NDV、引物對H3V 和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種；4)所述PCR引物對組合物A由如下3個引物對組成所述引物對NDV、引物對H5V 和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種。本發(fā)明還提供一種鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒的PCR引物對組合物B，是下述5)-8)中的任意一種5)所述PCR引物對組合物B由如下3個引物對組成所述引物對H3V、引物對H5V 和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種；6)所述PCR引物對組合物B由如下2個引物對組成所述引物對H3V和引物對 H5V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H5亞型禽流感病毒中的至少一種；7)所述PCR引物對組合物B由如下2個引物對組成所述引物對H3V和引物對 H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種；8)所述PCR引物對組合物B由如下2個引物對組成所述引物對H5V和引物對 H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種。本發(fā)明還保護鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的所述引物對H5V。所述1)的PCR引物對組合物A中序列表序列1、2、3、4、5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 1 1 1 1;所述2)的PCR引物對組合物A中序列表序列 1、2、3、4、5和6所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 1 1 ；所述3)的PCR引物對組合物A中序列表序列1、2、3、4、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 1 1; 所述4)的PCR引物對組合物A中序列表序列1、2、5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為 1:1:1:1:1:1。所述5)的PCR引物對組合物B中序列表序列3、4、5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 1 1;所述6)的PCR引物對組合物B中序列表序列3、4、5和6 所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 ；所述7)的PCR引物對組合物B中序列表序列3、 4、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 ；所述8)的PCR引物對組合物B中序列表序列5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1。本發(fā)明保護下述a)_f)中的任意一種用途a)所述PCR弓|物對組合物A在制備診斷或輔助診斷新城疫和禽流感試劑或試劑盒中的應用；
6
b)所述PCR引物對組合物B在制備診斷或輔助診斷禽流感試劑或試劑盒中的應用；c)所述PCR引物對H5V在制備診斷或輔助診斷H5亞型禽流感試劑或試劑盒中的應用。d)所述PCR引物對組合物A在制備鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用；e)所述PCR引物對組合物B在制備鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用；f)所述PCR引物對H5V在制備鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用。本發(fā)明還保護下述A)_C)中的任意一種試劑A)鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的試劑，所述試劑中含有所述 PCR引物對組合物A ；B)鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒的試劑，所述試劑中含有所述PCR引物對組合物B ；C)鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的試劑，所述試劑中含有所述PCR引物對 H5V。本發(fā)明還保護下述D) -F)中的任意一種PCR試劑盒D)鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒中含有所述A)試劑；E)鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒中含有所述
B)試劑；F)鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒中含有所述
C)試劑。本發(fā)明還保護下述G)_I)中的任意一種制備方法G)所述制備方法包括將所述PCR引物對組合物A的單鏈DNA分別單獨包裝的步驟；H)所述制備方法包括將所述PCR引物對組合物B的單鏈DNA分別單獨包裝的步驟；I)所述制備方法包括將所述引物對H5V的單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。本發(fā)明還保護所述PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將所述PCR引物對組合物A、所述PCR引物對組合物B或所述PCR引物對H5V的單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)包裝在同一試劑盒內(nèi)DNA聚合酶和下述4種dNTP :dATP, dTTP， dCTP 和 dGTPo本發(fā)明所提供的PCR引物對可檢測的病毒種類及其分支或基因型分別如下PCR 引物對NDV可檢測不同基因型的新城疫病毒，具體可為II型、III型、VII型或IX型新城疫病毒；PCR引物對H3V可檢測不同類型的H3亞型禽流感病毒，具體可為H3N8亞型禽流感病毒；PCR引物對H5V可檢測不同類型及不同分支的H5亞型禽流感病毒，具體可為2. 3. 2分支、2. 3. 4分支或7分支的H5W亞型禽流感病毒；PCR引物對H9V可檢測不同類型及不同分支的H9亞型禽流感病毒，具體可為Gl-Iike分支或BJ/94-like分支的H9N2亞型禽流感病毒；但不限于上述病毒的上述類型及其分支或基因型。本發(fā)明所提供的PCR引物對可檢測的病毒來源分別如下PCR引物對NDV可檢測雞源和鴨源的新城疫病毒，PCR引物對H3V可檢測鴨源的H3亞型禽流感病毒，PCR引物對 H5V可檢測雞源、鴨源和麻雀源的H5亞型禽流感病毒；PCR引物對H9V可檢測雞源、鴨源或鵪鶉源的H9亞型禽流感病毒；但不限于上述病毒的上述來源。使用本發(fā)明所提供的4種引物對同時用于檢測新城疫病毒、H3、H5和H9亞型禽流感病毒的特異性強，靈敏度分別為ieid50/ioo μ 1,ieid50/ioo μ 1UX 10"2eid50/100 μ 1 和1EID5(I/I00y 1，與病毒分離和血凝抑制實驗等常規(guī)實驗方法的鑒定結果相比，符合率達 100%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有單一 RT-PCR技術的靈敏度高、特異性強、準確率高， 一次RT-PCR可以實現(xiàn)對臨床樣品中4種病毒即新城疫病毒、H3、H5和H9亞型禽流感病毒的檢測，且能夠檢出近年來我國禽群中的流行毒株，成本更低，適合開發(fā)相應的多重RT-PCR 試劑盒，以用于新城疫和禽流感的臨床診斷和流行病控制。


圖1為引物對NDV的特異性檢測。其中，M為Maker，1-6分別為感染新城疫病毒 F48E9、Chicken/Henan/2009、Chicken/ShangDong/2010、Chicken/Hebei/2010、Duck/ ShangDong/2011或HG/Beijing/2009的樣品，7-11分別為感染H4N6亞型禽流感病毒A/ Duck/ShangDong/1/2010、H6N1 亞型禽流感病毒 A/Duck/Bei jing/1/2003、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)或呼腸孤病毒(REO)的樣品，12為陰性雞胚尿囊液對照。圖2為引物對H3V的特異性檢測。其中，M為Maker，1-6分別為感染H3亞型禽流感病毒 A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/BeiJing/40/2004、A/Duck/BeiJing/44/2004、 A/Duck/BeiJing/56/2005、A/Duck/BeiJing/59/2005 或 A/Duck/BeiJing/61/2005 的樣品， 7-11分別為感染H4N6亞型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亞型禽流感病毒 A/Duck/Bei jing/1/2003、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)或呼腸孤病毒(REO)的樣品，12為陰性雞胚尿囊液對照。圖3為引物對H5V的特異性檢測。其中，M為Maker，1-6分別為感染H5亞型 # ^胃 _ # A/Chicken/Huabei/202/2010> A/Duck/Huabei/1/201U A/treesparrow/ Jiangsu/1/2008、A/Chicken/Huabei/204/2010、A/Duck/Huabei/7/2009 或 A/Chicken/ Huabei/7/2011 的樣品，7_11 分別為感染 H4N6 亞型禽流感病毒 A/Duck/ShangDong/1/2010、 H6N1亞型禽流感病毒A/Duck/Bei jing/1/2003、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)或呼腸孤病毒(REO)的樣品，12為陰性雞胚尿囊液對照。圖4為引物對H9V的特異性檢測。其中，M為Maker，1-6分別為感染H9亞型禽流感病毒 A/Quail/HongKong/Gl/1997、A/Chicken/Beijing/3/1999、A/Chicken/FX/01/2010、 A/Duck/ShangDong/2CP/2010、A/Chicken/Sichuan/8/2011 或 A/Duck/ZhuCheng/1/2011 的樣品，7-11分別為感染H4N6亞型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/l/2010、H6m亞型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)或呼腸孤病毒(REO)的樣品，12為陰性雞胚尿囊液對照。
圖5為四重RT-PCR的特異性檢測。其中，M為Maker，1為分別感染H9亞型禽流胃__ A/Chicken/Beijing/3/1999>H5^胃__ A/treesparrow/Jiangsu/l/2008> H3亞型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004和新城疫病毒HG/Beijing/2009的cDNA樣品的混合物，2-5分別為感染H9亞型禽流感病毒A/Chicken/Bei jing/3/1999、H5亞型禽流感病毒 A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008、新城疫病毒 HG/Beijing/2009 和 H3 亞型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004的cDNA樣品，6-10分別為感染H4N6亞型禽流感病毒A/Duck/ ShangDong/l/2010,H6Nl 亞型禽流感病毒 A/Duck/Bei jing/1/2003、IBV、IBDV 和呼腸孤病毒的樣品，11為陰性雞胚尿囊液對照。圖6為四重RT-PCR分別檢測新城疫、H3、H5或H9亞型禽流感病毒的不同毒株感染的雞胚尿囊液樣品結果。其中圖(a)為H3亞型禽流感病毒，圖(b)為H5亞型禽流感病毒，圖(c)為H9亞型禽流感病毒，圖(d)為新城疫病毒；圖(a)-(d)中的M為分子量Maker， 1同圖5中1的樣品；圖(a)-(d)中的2-7分別同圖2、3、4、1中1_6的樣品；8為陰性雞胚尿囊液對照。圖7為引物對H3V、H5V、H9V及NDV分別對H3、H5、H9亞型禽流感病毒及新城疫病毒的靈敏度測定。其中，H3代表H3亞型禽流感病毒，H5代表H5亞型禽流感病毒，H9代表 H9亞型禽流感病毒，ND代表新城疫病毒；圖中1-7分別為不同含量的H3、H5、H9亞型禽流感病毒或新城疫病毒，依次為 1 X 104EID50/100 μ 1U X 103EID50/100 μ 1U X 102EID50/100 μ 1, 1X10EID50/I00y 1UEID50/I00y 1,1 X 10_1EID50/100 μ 1、1 X 1(T2EID5。/100 μ 1,8 為陰性雞胚尿囊液對照。圖8為四重RT-PCR方法的靈敏度檢測。其中，圖(a)為四重RT-PCR分別對不同含量的H3、H5、H9亞型禽流感病毒或新城疫病毒的樣品檢測，其中的H3代表H3亞型禽流感病毒，H5代表H5亞型禽流感病毒，H9代表H9亞型禽流感病毒，ND代表新城疫病毒，1-7 分別為不同含量的H3、H5、H9亞型禽流感病毒或新城疫病毒的樣品，樣品的各病毒含量依次為 ι χ io4eid50/ioo μ ι、ι χ io3eid50/ioo μ ι、ι χ io2eid50/ioo μ ι、ι χ Io1Eid5cZioo μ ι、 1EID5Q/100 μ IuxiO-1EID5cZlOOy 1、1 X 10_2EID5(1/100 μ 1，8 為陰性雞胚尿囊液對照；圖 (b)為四重RT-PCR方法對含H3、H5、H9亞型禽流感病毒或新城疫病毒的樣品的混合物的靈敏度檢測，M為Maker ;1-5分別為不同稀釋度的病毒樣品混合物，每種樣品混合物中各病毒的含量依次為 1X103EID50/I00y 1、1X102EID5。/I00y IuxiO1EID5cZlOOy 1、 ieid50/ioo μ 1 u X io^eid50/ioo μ 1,6 為陰性雞胚尿囊液對照。圖9為二重和三重RT-PCR方法對禽流感病毒和新城疫病毒的檢測。其中，M為 Maker ；1為引物對H9V、H5V和NDV組合，2為引物對H9V、H3V和NDV組合，3為引物對H5V、 H3V和NDV組合，4為引物對H9V、H5V和H3V組合，5為引物對H5V和H3V組合，6為引物對 H9V和H3V組合，7為引物對H3V和NDV組合，8為引物對H9V和H5V組合，9為引物對H5V 和NDV組合，10為引物對H9V和NDV組合，11為陰性雞胚尿囊液對照。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例所使用的病毒毒株信息如下
表1本發(fā)明所使用的毒株信息
權利要求
1.鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的PCR引物對組合物A，是下述 1)-4)中的任意一種1)所述PCR弓丨物對組合物A由如下4個引物對組成弓丨物對NDV、弓丨物對H3V、弓丨物對 H5V和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒和H9 亞型禽流感病毒中的至少一種；所述引物對NDV、引物對H3V、引物對H5V和引物對H9V均由兩條單鏈DNA組成；所述引物對NDV為序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA 組成的引物對；所述引物對H3V為序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列表中序列4所示的單鏈DNA 組成的引物對；所述引物對H5V為序列表中序列5所示的單鏈DNA和序列表中序列6所示的單鏈DNA 組成的引物對；所述引物對H9V為序列表中序列7所示的單鏈DNA和序列表中序列8所示的單鏈DNA 組成的引物對；2)所述PCR引物對組合物A由如下3個引物對組成所述引物對NDV、引物對H3V和引物對H5V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H5亞型禽流感病毒中的至少一種；3)所述PCR引物對組合物A由如下3個引物對組成所述引物對NDV、引物對H3V和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種；4)所述PCR引物對組合物A由如下3個引物對組成所述引物對NDV、引物對H5V和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種。
2.鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒的PCR引物對組合物B，是下述5)-8)中的任意一種5)所述PCR引物對組合物B由如下3個引物對組成所述引物對H3V、引物對H5V和引物對H9V ；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種；6)所述PCR引物對組合物B由如下2個引物對組成所述引物對H3V和引物對H5V；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H5亞型禽流感病毒中的至少一種；7)所述PCR引物對組合物B由如下2個引物對組成所述引物對H3V和引物對H9V；所述多亞型禽流感病毒為H3亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種；8)所述PCR引物對組合物B由如下2個引物對組成所述引物對H5V和引物對H9V；所述多亞型禽流感病毒為H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒中的至少一種。
3.根據(jù)權利要求1所述的PCR引物對組合物A，其特征在于所述1)的PCR 引物對組合物A中序列表序列1、2、3、4、5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為 1:1:1:1:1:1:1: 1;所述2)的PCR引物對組合物A中序列表序列1、2、3、 4、5和6所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 1 1 ；所述3)的PCR引物對組合物A中序列表序列1、2、3、4、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 1 1;所述4)的PCR引物對組合物A中序列表序列1、2、5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為 1:1:1:1:1:1。
4.根據(jù)權利要求2所述的PCR引物對組合物B，其特征在于所述5)的PCR引物對組合物B中序列表序列3、4、5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 1 1; 所述6)的PCR引物對組合物B中序列表序列3、4、5和6所示單鏈DNA的摩爾比為 1:1:1:1 ；所述7)的PCR引物對組合物B中序列表序列3、4、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1 ；所述8)的PCR引物對組合物B中序列表序列5、6、7和8所示單鏈DNA的摩爾比為1 1 1 1。
5.鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的所述引物對H5V。
6.下述a)_f)中的任意一種用途a)權利要求1或3所述的PCR引物對組合物A在制備診斷或輔助診斷新城疫和禽流感試劑或試劑盒中的應用；b)權利要求2或4所述的PCR引物對組合物B在制備診斷或輔助診斷禽流感試劑或試劑盒中的應用；c)權利要求5所述的引物對H5V在制備診斷或輔助診斷H5亞型禽流感試劑或試劑盒中的應用；d)權利要求1或3所述的PCR引物對組合物A在制備鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用；e)權利要求2或4所述的PCR引物對組合物B在制備鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用；f)權利要求5所述的引物對H5V在制備鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用。
7.下述A)-C)中的任意一種試劑A)鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的試劑，所述試劑中含有權利要求 1或3所述的PCR引物對組合物A ；B)鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒的試劑，所述試劑中含有權利要求2或4所述的 PCR引物對組合物B ；C)鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的試劑，所述試劑中含有權利要求5所述的引物對 H5V。
8.下述D)-F)中的任意一種PCR試劑盒D)鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒中含有權利要求7中A)所述的試劑；E)鑒定或輔助鑒定多亞型禽流感病毒的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒中含有權利要求 7中B)所述的試劑；F)鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒中含有權利要求 7中C)所述的試劑。
9.下述G)-I)中的任意一種制備方法G)所述制備方法包括將權利要求1或3所述的PCR引物對組合物A的單鏈DNA分別單獨包裝的步驟；H)所述制備方法包括將權利要求2或4所述的PCR引物對組合物B的單鏈DNA分別單獨包裝的步驟；I)所述制備方法包括將權利要求5所述的引物對H5V的單鏈DNA分別單獨包裝的步馬聚ο
10.權利要求8所述的PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權利要求1或3所述的PCR引物對組合物A、權利要求2或4所述的PCR引物對組合物B或權利要求5所述的引物對H5V的單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)包裝在同一試劑盒內(nèi) DNA 聚合酶和下述 4 種 dNTP :dATP，dTTP, dCTP 和 dGTP。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒的引物對及其應用。本發(fā)明提供的PCR引物對組合物由引物對NDV、引物對H3V、引物對H5V和引物對H9V組成；該PCR引物對組合物可用于制備診斷或輔助診斷新城疫和禽流感試劑，或制備鑒定或輔助鑒定新城疫病毒和多亞型禽流感病毒試劑。使用本發(fā)明所提供的PCR引物對組合物同時檢測新城疫病毒、H3、H5和H9亞型禽流感病毒的特異性強，靈敏度分別為1EID50/100μl、1EID50/100μl、1×10-2EID50/100μl和1EID50/100μl，與病毒分離和血凝抑制實驗等常規(guī)實驗方法的鑒定結果相比，符合率達100％，適合開發(fā)相應的多重RT-PCR試劑盒，以用于新城疫和禽流感的臨床診斷和流行病控制。
文檔編號C12Q1/70GK102321769SQ20111030346
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權日2011年10月9日
發(fā)明者劉金華, 包靜楠, 唐慶冬, 孫洪磊, 王金亮, 蒲娟 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學