專利名稱：白菜熱誘導(dǎo)miRNA及其鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體涉及白菜保守和新miRNA家族中熱誘導(dǎo)miRNA及其鑒定。
背景技術(shù)：
白菜是一類品種繁多的蔬菜作物，比較基因組學(xué)的工作揭示白菜和擬南芥有著非常保守的線性排列和染色體片段的共線性關(guān)系，推測(cè)它們是在大約13到17百萬(wàn)年前從一個(gè)共同的祖先那里進(jìn)化而來(lái)(Mun et al.，2009)。因?yàn)榘撞嗽谶M(jìn)化中發(fā)生了相當(dāng)于擬南芥全基因組范圍內(nèi)三倍化的事件，所以白菜基因組含有三倍化的擬南芥基因組的相應(yīng)片段的同源對(duì)應(yīng)物。在許多區(qū)域白菜類的蔬菜作物經(jīng)常受到高溫的脅迫。全球范圍內(nèi)，相當(dāng)一部分農(nóng)作物的損失是由于高溫和其伴隨的其他逆境脅迫造成(Mittler，2006)。雖然抗熱分子育種已經(jīng)成為可能，但作物的基因改良因?yàn)槿狈篃峄蛸Y源而受到限制。植物內(nèi)源的小片段非編碼RNA參與到了植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中。小RNA主要分為四大類微小RNA(microRNAs),反式作用干擾小RNA(ta_siRNAs),天然反義轉(zhuǎn)錄小RNA (nat-siRNAs)和重復(fù)序列相關(guān)小 RNA (ra-siRNAs) (Jamalkandi et al. ,2009)。植物典型的miRNA大約21nt,由DCL1/HYL1復(fù)合體從形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體中加工而成(Kuriharaet al.，2006)，進(jìn)入到RISC復(fù)合體中剪切靶基因，發(fā)揮植物發(fā)育和逆境響應(yīng)方面的調(diào)控(Shukla et al.，2008 ；Chen X，2009)。最近幾年的工作揭示了植物和動(dòng)物中miRNA更復(fù)雜的加工機(jī)制。大部分已知miRNA是從基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，但也有小部分來(lái)自基因內(nèi)含子區(qū)域(Babiarz et al. , 2008 ；Zhu et al. , 2008)、或者外顯子區(qū)域(Li et al.,2010)、轉(zhuǎn)座子(Devor E et al. , 2009 ；Piriyapongsa et al, 2008)甚至 tRNA 區(qū)域(Keita. ,2010)。同時(shí)最近也報(bào)導(dǎo)了 miRNA加工途徑和其他小RNA加工途徑之間的交叉互作。例如，長(zhǎng)度22nt的miRNA而非21nt的經(jīng)典miRNA激活了次級(jí)干擾小RNA的產(chǎn)生(Axtell et al.，2006 ；Cuperus et al. ,2010 ；Chen et al.,2010) ;miRNA 的前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)也能進(jìn)入 DCL3/RDR2 加工途徑產(chǎn)生 24nt 的小 RNA (Vazquez et al. ,2008 ；Chellappan et al. , 2010)。miRNA 通常被認(rèn)為發(fā)揮的是剪切祀基因和翻譯抵制的作用(Brodersen et al. , 2008),但最近發(fā)現(xiàn)來(lái)自miRNA前體的24nt小RNA也參與到了在轉(zhuǎn)錄前水平對(duì)靶基因的甲基化作用(Wu et al.，2010, Chellappan et al.,2010)。另一方面,在擬南芥和水稻中通過(guò)高通量的降解組測(cè)序驗(yàn)證了許多受 miRNA 剪切的祀基因(German et al. ,2008 ；Addo-Quaye et al. , 2008 ；Liet al. ,2010 ;)。miRNA 及其靶基因在時(shí)期轉(zhuǎn)換(Wang et al.，2009 ；ffu et al.，2009)、激素信號(hào)傳遞(Mallory et al. , 2005 ；Reyes et al. , 2007)和極性分化方面(Zhou et al.，2007 ；Sieber et al.，2007 ；Liu et al. ,2010 ；Liu et al. ,2011)扮演著重要角色，同時(shí)在抵御逆境比如干旱(Li et al. , 2008,Martin et al. , 2010)、過(guò)氧化(Sunkar et al. , 2006)和缺磷脅迫(Fujii et al.，2005)方面發(fā)揮作用。其中miR398在過(guò)氧化脅迫下顯著下調(diào)。擬南芥中miR398靶向兩個(gè)高度同源的銅鋅超氧化物歧化酶CSDl和CSD2，調(diào)控了植物對(duì)過(guò)氧化脅迫的耐受性(Sunkar et al. ,2006) 但是，在全基因組水平上哪些白菜miRNA響應(yīng)熱脅迫還沒(méi)有被報(bào)導(dǎo)?？偟膩?lái)說(shuō)，在白菜保守和特異miRNA家族中鑒定熱誘導(dǎo)miRNA可進(jìn)一步提聞我們對(duì)植物抗熱機(jī)制的了解。熱激脅迫干擾細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并使葉片黃化，延遲植物的生長(zhǎng)和發(fā)育甚至致死。在熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)調(diào)控下熱激蛋白(HSPs)的積累被認(rèn)為在對(duì)熱激響應(yīng)(HSR)過(guò)程中扮演著中心角色(Kotak et al.，2007)。有些蛋白如 DREB2A (Sakuma et al.，2006)，MBFlC (Suzukiet al. ,2005), CTLl (Kwon et al. ,2007)的累積被認(rèn)為可以提高對(duì)植物抗熱的能力，一些信號(hào)分子如乙烯、脫落酸(Larkindale et al. , 2005)、過(guò)氧化氫和IP3 (Liu et al. , 2006)等也與植物高溫耐受通路有交叉互作。但這些蛋白是否受小RNA的調(diào)控或者是否調(diào)控了相關(guān)的miRNA靶基因是未知的。隨著小RNA深度測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，許多作物的miRNA被發(fā)現(xiàn)(Zhu et al. ,2008 ；Lelandais-Briere et al. ,2009 ；Pantaleo et al. , 2010)。白菜是與模式生物擬南芥最為同源的作物之一(Snowdon et al.，2007)。白菜類的作物對(duì)高溫非常敏感，產(chǎn)量和質(zhì)量因此嚴(yán)重受損，尤其是在夏季和高溫地區(qū)。最近白菜全基因組的測(cè)序和注釋有了非常大的進(jìn)展，使得在全基因組水平調(diào)查miRNA成為可能。鑒定熱誘導(dǎo)miRNA提供了揭示植物響應(yīng)熱激脅迫機(jī)制的一種渠道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供分離的核酸分子，所述核酸分子含有(a) SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)與( a)或(b)具有至少80%序列相同性的核苷酸序列；和/或(d)在嚴(yán)格條件下與(a)、(b)和/或(C)雜交的核苷酸序列。在一優(yōu)選實(shí)施例中，前述(C)中所述序列的相同性為至少85%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1、2和22_40中任
一所示。本發(fā)明提供一種嵌合基因，其含有在植物細(xì)胞中有活性的操作性連接于本發(fā)明所述核酸分子的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子任選地進(jìn)一步操作性連接于3’非翻譯核酸分子。本發(fā)明提供一種載體，其含有本發(fā)明所述的核酸分子或嵌合基因。本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明所述的嵌合基因或載體。在一具體實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明提供含有本發(fā)明所述的植物細(xì)胞的植物或其部分。本發(fā)明提供產(chǎn)生自本發(fā)明所述的植物的種子。本發(fā)明提供本發(fā)明所述的載體在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以提供耐熱植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括降低所述植物中具有SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述降低所述植物中具有SEQ ID NO 1和22_40任一所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)步驟將一核苷酸序列導(dǎo)入所述植物，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO :1和22_40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，或是與SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少80%相同性的核酸序列；下調(diào)編碼SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因的表達(dá)；使編碼SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因突變，以降低或消除SEQ ID NO :1和22-40中任一序列與其mRNA靶標(biāo)的結(jié)合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1和22-40中任一序列結(jié)合上后該mRNA靶標(biāo)的切割；和使所述植物與能抑制SEQ ID NO :1和22-40中任一核苷酸序列、SEQ ID NO 2所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :1和22-40中任一核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80 %相同性的核苷酸序列的化合物接觸。本發(fā)明提 供一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括提高所述植物中具有SEQ ID NO 3或55所示核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或55的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :5所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO :5所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。在一具體實(shí)施例中，所述提高所述植物中具有SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或55的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO 5或56所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO :5或56所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)步驟在所述植物中過(guò)表達(dá)一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO :5或56所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或編碼具有與SEQ ID NO 5或56所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和使SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或55具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO 3或55或所述與SEQID NO 3或55具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結(jié)合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO :3或55或所述與SEQ ID NO :3或55具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結(jié)合后該mRNA的切割。本發(fā)明提供一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法提高所述植物中具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO 4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO 6所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。在一具體實(shí)施例中,所述提高所述植物中具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)步驟在所述植物中過(guò)表達(dá)一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQID NO 4所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或編碼具有與SEQ ID NO :6所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和使SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO 4或所述與SEQ ID NO 4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結(jié)合，和/或降低或消除SEQ ID NO 1與由SEQID NO 4或所述與SEQ ID NO 4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結(jié)合后該mRNA的切割。 本發(fā)明提供本發(fā)明所述的核酸分子在調(diào)節(jié)植物耐熱性中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的核酸分子在提供耐熱性植物的遺傳分析或標(biāo)記物輔助的選擇方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的核酸分子在提供耐熱性植物的植物育種方法中的應(yīng)用。


圖1顯示常溫或熱處理的白菜四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中小RNA的長(zhǎng)度分布。NTl和HTl是實(shí)驗(yàn)I中分別進(jìn)行了 NT和HT處理后測(cè)序得到的小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)；NT2和HT2是實(shí)驗(yàn)2中分別進(jìn)行了 NT和HT處理后測(cè)序得到的小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)。㈧NT和HT小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)小RNA總數(shù)的長(zhǎng)度分布；(B)NT和HT小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)小RNA各類的長(zhǎng)度分布。圖2顯示熱激脅迫下bra_miR398a的累積和其靶基因BracCSDl的表達(dá)變化。(A)bra-miR398和BracCSDl靶位點(diǎn)的比對(duì)；(B) Northern雜交檢測(cè)白菜兩個(gè)NT和HT生物學(xué)重復(fù)中的bra-miR398a ； (C)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)BracCSDl的表達(dá)變化。圖3顯示來(lái)自miRNA前體中熱響應(yīng)小RNA。成熟序列用帶有正向箭頭的下劃線標(biāo)出，miRNA*用帶有反向箭頭的下劃線標(biāo)出。阿拉伯?dāng)?shù)字依次代表均一化后小RNA在NT1，HTl，NT2, HT2數(shù)據(jù)庫(kù)中的讀數(shù)。(A)bra-miR156h_2前體上產(chǎn)生的小RNA的匹配位點(diǎn)和豐度；(B)bra-miR167a-2前體上產(chǎn)生的小RNA的匹配位點(diǎn)和豐度；(C)bra_miR400前體上產(chǎn)生的小RNA的匹配位點(diǎn)和豐度。圖4顯示熱處理?xiàng)l件下bra_miR9. 3b和其祀基因的表達(dá)變化。(A)從miR9b前體中產(chǎn)生的三對(duì)miRNA/miRNA* ； (B)從miR9b前體中產(chǎn)生的三對(duì)miRNA/miRNA在四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的豐度；(C)bra-miR9. 3b和其潛在靶基因互補(bǔ)位點(diǎn)的比對(duì)；(D)Norhtern雜交檢測(cè)熱激條件下的bra_miR9. 3b ； (E) RT-PCR檢測(cè)熱激條件下bra_miR9. 3b潛在祀基因的表達(dá)情況。圖5顯示bra-miRlO和其靶基因的進(jìn)化關(guān)系及熱響應(yīng)情況。(A)braniRlO前體和BracPAPlO的序列比對(duì)。bra-miR10成熟序列的反義鏈及方法用帶有反向箭頭的下劃線標(biāo)出，BracPAPlO互補(bǔ)位點(diǎn)用正向箭頭的下劃線標(biāo)出；(B)從miRlO前體中產(chǎn)生的熱響應(yīng)小RNA ;阿拉伯?dāng)?shù)字依次代表均一化后小RNA在NT1，HTl, NT2, HT2數(shù)據(jù)庫(kù)中的讀數(shù)；(C)RT-PCR檢測(cè)BracPAPlO在熱處理?xiàng)l件下的表達(dá)變化；(D) 5’ -RACE PCR顯示BracPAPlO斷點(diǎn)落在bra-miR10與BracPAPlO互補(bǔ)的位點(diǎn)。圖6顯示兩個(gè)新miRNA和實(shí)證靶基因的進(jìn)化關(guān)系。(A)bra_miR4前體和BracDRLl的序列比對(duì)；bra-miR10成熟序列及方法用帶有正向箭頭的下劃線標(biāo)出，BracPAPlO互補(bǔ)位點(diǎn)反義序列用反向箭頭的下劃線標(biāo)出；(B)5’ -RACE PCR顯示BraVELl斷點(diǎn)落在bra-miR4-5p 和 BracVELl 的互補(bǔ)位點(diǎn)，BracDRLl 斷點(diǎn)落在 bra-miR4_3p 和 BracDRLl 的互補(bǔ)位點(diǎn)；(C)bra-miR9b前體和BracTAOl的序列比對(duì)，bra_miR9b成熟序列及方法用帶有正向箭頭的下劃線標(biāo)出，BracTAOl互補(bǔ)位點(diǎn)反義序列用反向箭頭的下劃線標(biāo)出；(D)5’ -RACEPCR顯示fcaTAOl斷點(diǎn)落在bra_miR9.1和fcacTAOl的互補(bǔ)位點(diǎn)。圖7顯示p35S:amiR1885b. 3載體的構(gòu)建。圖8 顯示了另一種 p35S:amiR1885b. 3+p35S:BracQQTl 載體的構(gòu)建。圖9顯示了 p35S:fcacQQTl載體的構(gòu)建。圖10 顯示了 p35S:amiR1885b. 3 載體的構(gòu)建。
具體實(shí)施例方式本文中，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”可包括任何嘧啶堿基和嘌呤堿基的聚合物或寡聚物，優(yōu)選是胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鳥嘌呤(見AlbertL. Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub. 1982),本文將其全文以引用的方式納入本文)。本發(fā)明包括脫氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸組分，以及它們的任何化學(xué)變體，如這些堿基的甲基化、羥甲基化或糖基化形式等。所述聚合物或寡聚物在組成上可以是同源或 異源的，且可從天然來(lái)源分離得到，或可人工合成產(chǎn)生。此外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，可以單鏈或雙鏈形式(包括同源雙鏈、異源雙鏈或雜合狀態(tài))永久或暫時(shí)存在。術(shù)語(yǔ)“基因”指含有一區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū))的DNA序列，該區(qū)域操作性連接于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)區(qū)域(如啟動(dòng)子)，在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(如mRNA)?；虻霓D(zhuǎn)錄區(qū)可以是編碼氨基酸序列或功能RNA如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA和反義RNA的核苷酸序列。因此，基因可含有幾個(gè)操作性連接的序列，如啟動(dòng)子、含例如參與啟動(dòng)翻譯的序列的5’前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄區(qū)、內(nèi)含子、和含如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的3’非翻譯序列。“嵌合基因”(或重組基因)指在物種中天然不存在的任何基因，尤其指其核酸序列的一個(gè)或多個(gè)部分在自然界中以互不相關(guān)的形式存在的基因。例如，啟動(dòng)子在自然界中與部分或所有轉(zhuǎn)錄區(qū)域或其它調(diào)節(jié)區(qū)域不關(guān)聯(lián)。術(shù)語(yǔ)“嵌合基因”應(yīng)理解為包括表達(dá)構(gòu)建物，其中啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列操作性連接于一個(gè)或多個(gè)編碼序列或反義序列(有義鏈的反向互補(bǔ)鏈)或反向重復(fù)序列(有義和反義，從而轉(zhuǎn)錄后RNA轉(zhuǎn)錄物形成雙鏈RNA)?！?’ UTR”或“3’非翻譯序列”(也常稱為3’非翻譯區(qū)或3’端)指基因的編碼序列下游的核酸序列，其包含例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和(大多數(shù)情況下，但不是全部的真核mRNA)聚腺苷酸化信號(hào)(如AAUAAA或其變體)。轉(zhuǎn)錄終止后，mRNA轉(zhuǎn)錄物在聚腺苷酸化信號(hào)下游被切割，并加入poly (A)尾,該poly (A)尾參與該mRNA向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)(在那發(fā)生翻譯)。
“基因表達(dá)”指操作性連接于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)區(qū)域(尤其是啟動(dòng)子)的DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)錄成RNA的過(guò)程，該RNA是有生物學(xué)活性的，即該RNA能被翻譯成生物學(xué)活性蛋白或肽(或活性肽片段)，或該RNA自身具有活性(如在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNAi中)。某些實(shí)施方式中的活性蛋白指組成型活性的蛋白。編碼序列優(yōu)選是有義取向，并編碼所需的生物學(xué)活性蛋白或肽，或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列優(yōu)選以反義DNA或反向重復(fù)DNA的方式存在，含有反義取向或有義和反義取向的短序列的靶基因?！爱愇槐磉_(dá)”指在通常不表達(dá)的組織中表達(dá)。“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”在本文中定義為能調(diào)節(jié)操作性連接于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的(編碼)序列的轉(zhuǎn)錄速率(rate of transcription)的核酸序列。本文所定義的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包含啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄(啟動(dòng)子元件)、維持和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄所需的所有序列元件，包括弱化子和增強(qiáng)子。雖然大多數(shù)情況下指編碼序列的上游(5，)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，但此定義也包括編碼序列下游(3’ )所發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)序列。本文中，“啟動(dòng)子”指起到控制一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄的核酸片段，根據(jù)轉(zhuǎn)錄方向，啟動(dòng)子位于所述基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，結(jié)構(gòu)上由DNA依賴性RNA聚合物的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其它DNA序列(包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、阻遏子和激活子蛋白結(jié)合位點(diǎn)，以及本領(lǐng)域周知的直接或間接調(diào)節(jié)由該啟動(dòng)子引起的轉(zhuǎn)錄量的核苷酸序列)所鑒定。“組成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)組織中在生理學(xué)和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子例如包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，衍生自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA的I'-或2'-啟 動(dòng)子，遍在蛋白I啟動(dòng)子，Smas啟動(dòng)子，肉桂基醇脫氫酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利No. 5, 683, 439), Nos啟動(dòng)子，pEmu啟動(dòng)子，rubisco啟動(dòng)子，GRP1-8啟動(dòng)子及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種植物基因的其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。如果希望低水平表達(dá)，則可以使用弱啟動(dòng)子。弱組成型啟動(dòng)子包括例如，Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子(W099/43838及美國(guó)專利No. 6，072，050)，核心 35S CaMV 啟動(dòng)子等。“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子是可從生理學(xué)(如通過(guò)外部施與某些化合物)或發(fā)育上進(jìn)行調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子是Hsp70啟動(dòng)子，其是可由熱刺激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。也可以使用可由化學(xué)物質(zhì)、雌激素或植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子等等?！敖M織特異性”啟動(dòng)子是僅在特定類型的組織或細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子?！皢?dòng)子在植物或植物細(xì)胞中有活性”是指啟動(dòng)子在植物或植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一般能力，它并不暗含關(guān)于啟動(dòng)子時(shí)空活性的內(nèi)容。本文中，“操作性連接”指處于功能關(guān)系的多核苷酸連接。當(dāng)核酸與其它序列以功能關(guān)系連接時(shí)，該核酸與其它核酸序列“操作性連接”。例如，如果啟動(dòng)子，或甚至是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列能影響到編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它們與該編碼序列操作性連接。操作性連接意味著被連接的DNA序列通常是連續(xù)的。本文中，“核酸構(gòu)建物”或“載體”指采用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的人造的核酸分子，用于遞送外源DNA到宿主細(xì)胞中。載體骨架可以是,例如雙運(yùn)載體或超雙運(yùn)載體(superbinaryvector)(見 US5591616、US2002138879 和 W095/06722)、共整合載體或 T-DNA 載體，如本領(lǐng)域已知的且在本文其它部分也有描述，在該骨架中可整合入嵌合基因，或者，如果其已存在合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，僅需在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列下游整合入所需的核酸序列(如編碼序列、反義或反向重復(fù)序列)。載體通常還含有有利于他們?cè)诜肿涌寺≈袘?yīng)用的遺傳元件，如可選擇標(biāo)記物、多克隆位點(diǎn)等(見下文)。本文中，“宿主細(xì)胞”可指天然存在的細(xì)胞或含有載體并支持該載體復(fù)制的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞、外植體、體內(nèi)細(xì)胞等。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞?！皣?yán)格雜交條件”可用于鑒別與給定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中將不同。通常，嚴(yán)格條件選為在規(guī)定離子強(qiáng)度和pH下比特定序列的解鏈溫度(Tm)低約5°C。Tm是在規(guī)定離子強(qiáng)度和pH下50%的靶序列雜交到最佳匹配探針的溫度。通常，嚴(yán)格條件將選擇為，鹽濃度約O. 02摩爾，pH為7，和溫度至少為60°C。降低鹽濃度和/或升高溫度會(huì)增加嚴(yán)格性。RNA-DNA雜交(使用如IOOnt探針進(jìn)行的Northern印跡)的嚴(yán)格條件是，例如包括至少一次在63°C、0. 2X SSC中進(jìn)行20分鐘的洗漆的條件或其同等條件。DNA-DNA雜交(使用如IOOnt探針進(jìn)行的Southern印跡)的嚴(yán)格條件是，例如包括至少一次(通常2次)在至少50°C (通常約55°C )、0· 2X SSC中進(jìn)行20分鐘的洗漆的條件或其同等條件。可參見Sambrook等，(1989),和Sambrook和Russell (2001)。 “序列相同性”和“序列相似性”可通過(guò)使用全球或本地比對(duì)算法比對(duì)兩條肽或兩條核苷酸序列而確定。然后，當(dāng)它們具有至少某個(gè)最低百分比的序列相同性(如下文所述)時(shí)(最佳采用例如GAP或BESTFIT程序進(jìn)行比對(duì)，使用它們的默認(rèn)參數(shù))，可將序列稱為“基本上相同”或“基本上相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全球比對(duì)算法比對(duì)兩條序列的全長(zhǎng)序列，使匹配的數(shù)量最大化，并將空隙數(shù)量最小化。通常使用GAP默認(rèn)參數(shù)，空隙產(chǎn)生罰分(gap creation penalty) = 50 (核苷酸)/8 (蛋白)，空隙延伸罰分(gap extentionpenalty) = 3(核苷酸)/2(蛋白)。對(duì)于核苷酸,使用的默認(rèn)的計(jì)分矩陣是nwsgapdna,對(duì)于蛋白，使用的默認(rèn)的計(jì)分矩陣是 Blosum62 (Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)?？墒褂糜?jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列比對(duì)和序列相同性百分比計(jì)分，例如使用Accelrys Inc.(9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752USA)的 GCG Wisconsin Package，第 10.3版，或EmbossWin version 2· 10. O (使用“needle”程序)?；蛘?，可使用算法如FASTA和BLAST等檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)定相似性百分比或相同性百分比。優(yōu)選地，序列相同性指整條序列長(zhǎng)度上的序列相同性?！八拗骷?xì)胞”或“重組細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”指至少一種核酸分子，尤其是含有編碼所需蛋白的嵌合基因或轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生反義RNA或反向重復(fù)RNA (或發(fā)夾RNA)以用于使靶基因/基因家族沉默的核酸序列的核酸分子，被導(dǎo)入細(xì)胞后所產(chǎn)生的新的獨(dú)立細(xì)胞(或有機(jī)體)。宿主細(xì)胞優(yōu)選是植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可含有作為染色體外(游離基因)復(fù)制分子的核酸構(gòu)建物，或更佳地，含有整合到該宿主細(xì)胞的核內(nèi)或質(zhì)體基因組中的嵌合基因。本文中，術(shù)語(yǔ)“宿主”還指病原體能侵入或感染的宿主植物物種，但根據(jù)上下文，該定義是清楚的。植物物種依病原體而分為“宿主”或“非宿主”物種。“非宿主”物種是即使在最適疾病發(fā)生的條件下也對(duì)所有種類的病原體感染都完全免疫的物種?！八拗鳌蔽锓N也稱為病原體的“宿主范圍”，對(duì)優(yōu)選種類(但不是全部)的病原體免疫。術(shù)語(yǔ)“可選擇標(biāo)記物”與本領(lǐng)域常規(guī)的術(shù)語(yǔ)含義類似，在本文中指任意遺傳物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)表達(dá)時(shí)，可用于選擇含有該可選擇標(biāo)記物的細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記物基因產(chǎn)物賦予例如抗生素抗性，或更優(yōu)選的，除草劑抗性或其它可選擇性狀，例如表型性狀(如著色上的變化)或營(yíng)養(yǎng)需求。術(shù)語(yǔ)“報(bào)告子”主要指可視標(biāo)記物，例如綠色熒光蛋白(GFP)、eGFP、熒光素酶、GUS等。術(shù)語(yǔ)“同源”或“異源”指核酸或氨基酸序列與它們的宿主細(xì)胞或有機(jī)體(尤其是在轉(zhuǎn)基因有機(jī)體中)之間的關(guān)系。同源序列指在宿主物種中天然存在的序列(如用番爺基因轉(zhuǎn)化番茄)，而異源序列指在宿主細(xì)胞中天然不存在的序列(如用來(lái)自馬鈴薯的序列轉(zhuǎn)化番茄)。根據(jù)上下文，術(shù)語(yǔ)“同源物”或“同源的”可互換使用，指都是來(lái)自共同祖先序列的后代的序列。本文中，術(shù)語(yǔ)“等位基因”指基因在特定位點(diǎn)上的一種或多種可替換形式。在生物體的二倍體細(xì)胞中，給定基因的等位基因位于染色體上特定的位置或位點(diǎn)上。一個(gè)等位基因存在于一對(duì)同源染色體的各個(gè)染色體上。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”或“多肽”在本文中可互換使用，指由氨基酸鏈構(gòu)成的分子，與特定的作用模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來(lái)源無(wú)關(guān)。因此，蛋白質(zhì)的“片段”或“部分”仍然可稱為“蛋白質(zhì)”。“分離的蛋白質(zhì)”指不再存在于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如是體外的，或不在重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中。本文中，“植物(作物)”包括各種農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是(不限于)雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。作為一種優(yōu)選方式，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜等，十字花科鼠耳芥屬的擬南芥等，禾本科的水稻，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科蕓薹屬或鼠耳芥屬的植物?！爸参铩卑ㄖ参锛?xì)胞，植物組織或器官，植物原生質(zhì)體，可再生植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物，植物愈傷組織，植物細(xì)胞塊，和植物中完整的植物細(xì)胞，或植物的部分，如胚芽、花粉、胚珠、果實(shí)(如收獲的番茄)、花、葉、種子、根、根尖等。術(shù)語(yǔ)“增加的水平”和“降低的水平”在本文中指明顯增加的水平或明顯降低的水平。通常，當(dāng)測(cè)試樣品 中的水平是對(duì)照樣品或參比樣品中的相應(yīng)水平的至少5%，例如10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%以上或更低，該水平增加或降低。本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“含有”為開放式的限定方式，指包括其后所限定的內(nèi)容，但并沒(méi)有排除沒(méi)有明確列出的內(nèi)容。此外，“由……組成”與“基本上由……組成”是可互換的，指除具體指明的成分外，本發(fā)明的組合物可含有額外的成分，所述額外的成分不改變本發(fā)明的獨(dú)特特征。此外，“一種”、“一個(gè)”等不排除包括多于一個(gè)的可能性，除非文中以清楚表明僅有一個(gè)或一種。因此，“一種”、“一個(gè)”通常指“至少一種”、“至少一個(gè)”。如本文所用，“豐度”就是一種序列的小RNA存在的總數(shù)量(如序列的條數(shù))，也即相同序列的小RNA的總數(shù)量。豐度的測(cè)定可通過(guò)小RNA高通量測(cè)序(Illumina GAII)的方法測(cè)定，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的其它方法進(jìn)行。小RNA的表達(dá)量可通過(guò)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)獲得，常規(guī)的例如通過(guò)Northern印跡技術(shù)，例如可設(shè)計(jì)特異性針對(duì)該小RNA的探針(攜帶可檢測(cè)信號(hào)，如熒光)來(lái)測(cè)定。本發(fā)明已鑒定了新穎的白菜(Brassica rapa)熱響應(yīng)miRNA,miR-9. 3 (如SEQ IDNO :1所示)，其響應(yīng)熱應(yīng)力而下調(diào)，而它的兩個(gè)靶標(biāo)(QQT1和FRA-8)響應(yīng)熱應(yīng)力而上調(diào)。本發(fā)明進(jìn)一步證實(shí)，擬南芥(Arabidopsis thaliana)中miR_9· 3的下調(diào)和祀標(biāo)QQTl的過(guò)表達(dá)提聞的耐熱性。本發(fā)明的核酸分子本發(fā)明提供一種分離的、重組或合成核酸分子，含有(a)SEQ ID NO :1所示的核酸序列或SEQ ID NO 2所示的前體序列；(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)具有至少80%序列相同性的核苷酸序列；和/或(d)在嚴(yán)格條件下與(a)、(b)和/或(c)雜交的核苷酸序列。SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列是miR_9. 3 (本文中也用miR-1885. 3表示)的成熟序列，長(zhǎng)20個(gè)核苷酸。已顯示在熱應(yīng)力中miR-9. 3下調(diào),而它的兩個(gè)祀標(biāo)上調(diào)。miR_9. 3與目前已鑒別的miRNA家族都不同源。miR-9. 3可被它的互補(bǔ)核苷酸序列下調(diào)。本發(fā)明者已進(jìn)一步證實(shí)，在擬南芥中miR-9. 3的下調(diào)和其靶標(biāo)之一 QQTl的過(guò)表達(dá)增加了該植物的耐熱性。本發(fā)明還包括具有與SEQ ID NO :1的核苷酸序列互補(bǔ)的序列的核酸分子，如反義RNA或其它抑制性RNAjB RNA i中使用的核酸分子；或在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 1的一部分雜交的核酸分子。這些互補(bǔ)的或雜交的序列可以是任意長(zhǎng)度的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解序列的適當(dāng)長(zhǎng)度應(yīng)與其使用目的相符。優(yōu)選地，這些互補(bǔ)的或雜交的序列長(zhǎng)度至少為15、16、17、18或19個(gè)核苷酸。更優(yōu)選地，這些互補(bǔ)細(xì)胞和雜交序列的長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸。預(yù)期與SEQ ID NO 1的核苷酸序列具有80%相同性將能確保所設(shè)有互補(bǔ)的和/或雜交的序列與SEQ ID NO :1結(jié)合。優(yōu)選地，所述互補(bǔ)序列和雜交序列與SEQ ID NO :1的核苷酸序列具有至少80%的相同性，例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，優(yōu)選基于其全長(zhǎng)序列。本發(fā)明還涉及與(a)或(b)的序列具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、96^^97^^98%或99%)的相同性的核苷酸序列?？刹捎帽疚纳鲜霾糠痔峒暗姆椒y(cè)定兩條核苷酸序列的相同性。本發(fā)明還包括SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，其代表了 miR_9. 3的前體miRNA。本發(fā)明也包括具有與SEQ ID NO :2的核苷酸序列互補(bǔ)的序列的核酸分子，如反義RNA或其它抑制性RNA，如用于RNAi中的核酸分子；或在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 2的一部分雜交的核酸分子。這些互補(bǔ)序列和雜交序列可以是任意長(zhǎng)度，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解序列的適當(dāng)長(zhǎng)度應(yīng)與其使用目的相符。優(yōu)選地，這些互補(bǔ)的或雜交的序列長(zhǎng)度至少為15、16、17、18或19個(gè)核苷酸。預(yù)期與SEQ ID NO :2的核苷酸序列具有80%相同性將能確保所設(shè)有互補(bǔ)的和/或雜交的序列與SEQ ID N0:2結(jié)合。優(yōu)選地，所述互補(bǔ)序列和雜交序列與SEQ IDNO 2的核苷酸序列具有至少80%的相同性，例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99 %，優(yōu)選基于所述互補(bǔ)或雜交序列的全長(zhǎng)序列。應(yīng)理解，本發(fā)明包括與本文所列所有序列(引物序列除外)，例如SEQ ID NO :1_6、22-40和53-56具有上文所述序列相同性(至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% )的序列，或嚴(yán)格條件下與所有這些序列(包括具有所述相同性的序列)雜交的序列。本發(fā)明的載體另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明核酸分子的載體。所述載體可以是表達(dá)載體。表達(dá)載體通常還含有啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性?？捎欣褂玫妮d體包括已知的植物載體，例如pK7GWIG2 (I)和pGreen，以及本領(lǐng)域用于在微生物中轉(zhuǎn)化和表達(dá)蛋白質(zhì)的載體?？蓞⒁夾rabidopsis, A laboratory manualEds. Weigel&Glazebrook,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Lab Press) (2002),和Maniatis等，Molecular Cloning,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1982)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞又一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明核酸、嵌合基因或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的合適宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、人細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。合適的植物細(xì)胞的例子包括但不限于Brassica和Arabidopsis的細(xì)胞。合適的酵母細(xì)胞包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。合適的真菌細(xì)胞包括曲霉(Aspergillus)。合適的動(dòng)物細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞,如來(lái)自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞,如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或PERC6細(xì)胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域現(xiàn)有的各種細(xì)胞系，如Flp-1n細(xì)胞系(Invitrogen)。如上文所述,可使用用于將本發(fā)明核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的各種載體。這些載體可以是克隆載體、表達(dá)載體、沉默載體，可選自例如質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(如腺病毒或腺相關(guān)載體)、病毒RNA載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)或病毒植物載體(如煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus)和馬鈴薯X病毒(potato virusX))。在另一實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

植物miRNA可從前體miRNA加工而來(lái)，所述的前體miRNA可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)，所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度一般在60-330bp之間。通常，前體miRNA可在植物細(xì)胞內(nèi)被剪切成成熟的miRNA分子。成熟的miRNA通常具有18-26個(gè)核苷酸(一般約22個(gè)核苷酸)，然而也不排除具有其它數(shù)目核苷酸的miRNA分子。miRNA通?？杀籒orthern印跡檢測(cè)到。植物來(lái)源的miRNA是在植物細(xì)胞中由前體miRNA加工獲得的miRNA。前體miRNA也可從植物中分離出來(lái)或由人工合成合成。如本文所用，“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)也被稱作“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，是指一種核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區(qū)域(莖部)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該核苷酸分子的兩個(gè)區(qū)域(位于同一分子上)形成，兩個(gè)區(qū)域分列雙鏈部分的兩側(cè)；其還包括至少一個(gè)“環(huán)”結(jié)構(gòu)，包括非互補(bǔ)的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。即使該核苷酸分子的兩個(gè)區(qū)域不是完全互補(bǔ)的，核苷酸的雙鏈部分也可保持雙鏈狀態(tài)。例如，插入、缺失、取代等可導(dǎo)致一個(gè)小區(qū)域的不互補(bǔ)或該小區(qū)域自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或其它形式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然而，該兩個(gè)區(qū)域仍可基本上互補(bǔ)，并在可預(yù)見的方式中發(fā)生相互作用，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈區(qū)域。莖環(huán)結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級(jí)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的核酸后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該核酸是否能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明所提供的miRNA序列，可設(shè)計(jì)出在被導(dǎo)入植物中后可被植物加工成可影響相應(yīng)的mRNA表達(dá)的miRNA的核酸構(gòu)建物。因此，本發(fā)明提供了一種分離的核酸構(gòu)建物，所述的核酸構(gòu)建物可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被植物細(xì)胞裂解且表達(dá)成所述的miRNA。在本發(fā)明中，將所述的核酸構(gòu)建物導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，該核酸構(gòu)建物在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄成前體miRNA,之后所述的前體miRNA被加工成miRNA,所述的miRNA可與相應(yīng)的mRNA的部分序列相互補(bǔ)，從而抑制該mRNA相應(yīng)的目的基因的表達(dá)。所述植物細(xì)胞再生成植物后，該轉(zhuǎn)基因植物中相應(yīng)的目的基因的表達(dá)與野生型不同。在一些實(shí)施方案中，希望進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。在這些情況中，可以使用標(biāo)準(zhǔn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)。這種方法包括但不限于病毒轉(zhuǎn)化方法、DNA或RNA顯微注射以及本領(lǐng)域熟知的其它方法。序列說(shuō)明本發(fā)明涉及以下序列SEQ ID NO 1-成熟的 miR_9. 3 序列SEQ ID NO 2-miR-9. 3 前體序列SEQ ID NO 3——擬南芥 QQTl 的編碼序列(AT5G22370. 2)SEQ ID NO 4——擬南芥 FRA-8 的編碼序列(At2g28110.1)SEQ ID NO 5——擬南芥QQTl的蛋白序列SEQ ID NO 6——擬南芥FRA-8的蛋白序列SEQ ID NO :7_21表示5’ -RACE-PCR和實(shí)時(shí)PCR中使用到的引物SEQ ID NO :22-40分別表示本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新miRNASEQ ID NO :41_52顯示實(shí)施例2構(gòu)建質(zhì)粒所用引物SEQ ID NO : 53顯示IPS I的序列，該序列中的第236-259位堿基在構(gòu)建p35S:MIMbra-398a 質(zhì)粒時(shí)被 ACTTCCTTCTTCTATGTCCACAAT (MIM1885b. 3)替換SEQ ID NO : 54顯示pRS300的序列，該序列中的第803-822位堿基構(gòu)建p35S:amiR398a 質(zhì)粒時(shí)，被 ATTGTGGACAAAGAAGGAAG (對(duì)應(yīng)于 miR1885*)替換，而第 953-972位被 CTCCCTTCTTTGTGCACAAT (對(duì)應(yīng)于 miR1885)替換SEQ ID NO 55 顯不非結(jié)球白菜(B. rapa. ssp. chinensis)QQTl 的 CDS 序列SEQ ID NO 56 顯不非結(jié)球白菜(B. rapa. ssp. chinensis)QQTl 的氛基酸序列下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1 :白菜中響應(yīng)熱應(yīng)力的miRNA的鑒別一.材料與方法小RNA深度測(cè)序構(gòu)建小RNA文庫(kù)的材料是一種非結(jié)球白菜(B. rapa. ssp. chinensis)的品種Wu-11。所有材料都種植在22°C 16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗的長(zhǎng)日照條件下；三周后部分材料進(jìn)行46°C I個(gè)小時(shí)的熱激處理。收集地上部分的植物材料后用Alternativevl. 5Protocol (Illumina, 2009)提取 RNA 樣品，使用 mirVana miRNA 分離試劑盒(Ambion,Inc)進(jìn)行小RNA分離，Illumina GAII測(cè)序儀進(jìn)行深度測(cè)序。保守miRNA的分析我們將測(cè)序得到的小RNA序列與miRbase中擬南芥miRNA家族的成熟序列進(jìn)行比對(duì)，然后將所有不超過(guò)四個(gè)堿基錯(cuò)配的miRNA序列匹配到白菜全基因組的scaffold序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org)或者表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)(EST) (http://brassica.bbsrc. ac.uk/),提取出miRNA成熟序列存基因組或者EST上的600bp旁鄰序列。進(jìn)一步用下載到本地的RNAfold軟件對(duì)旁鄰序列進(jìn)行批量折疊；最后我們用peri腳本語(yǔ)言檢查這些前體是否符合miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)(Meyers et al. ,2008)。白菜新miRNA的預(yù)測(cè)我們將所有小RNA序列匹配到白菜全基因組的scaffold序列數(shù)據(jù)庫(kù)或者表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)(EST)。小RNA匹配到的基因組位點(diǎn)不超過(guò)10個(gè)的被保留下來(lái)，600bp的旁鄰序列被提取出來(lái)用RNAfold進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。進(jìn)一步我們根據(jù)miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)判定該小RNA是否落在預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的莖上，且不超過(guò)4個(gè)不匹配的位點(diǎn)(連續(xù)3個(gè)不匹配的位點(diǎn)也是不允許的)(Meyers et al.，2008)。為了調(diào)查這些符合標(biāo)準(zhǔn)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體來(lái)自基因組的哪個(gè)區(qū)域，我們使用BLASTN將這些前體序列比對(duì)TAIR9的擬南芥cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)。最后我們將小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的小RNA匹配到這些前體上顯示出siRNA在前體的分布圖。與核糖體RNA或轉(zhuǎn)座子高度同源的前體序列大部分被排除。根據(jù)是否同時(shí)實(shí)測(cè)到預(yù)測(cè)的miRNA*這一個(gè)核心標(biāo)準(zhǔn)最終判定出新miRNA。新miRNA靶基因預(yù)測(cè)將miRNA序列與 白菜EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST互補(bǔ)序列做比對(duì)，保留堿基不匹配低于四個(gè)以下的EST序列；匹配結(jié)果用打分矩陣的形式給出，完全匹配給I分，G-U配對(duì)O. 5分，不匹配的給-1分，在第10或第11位不匹配給-2分。如果有連續(xù)兩個(gè)的不匹配、在前十個(gè)堿基有2個(gè)以上不匹配、在后面的堿基中有3個(gè)以上的不匹配，這三種情況均不保留。最后我們把潛在靶基因的EST序列與擬南芥TAIR9的cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確認(rèn)它在擬南芥的同源基因。Northern 雜交30-50 μ g RNA樣品在19%的聚丙烯酰胺上以IOOV穩(wěn)壓電泳3_4小時(shí)分離，然后以200mA穩(wěn)流2小時(shí)轉(zhuǎn)至雜交膜上(Amersham biosciences-GE healthcare) ;3分鐘的紫外交聯(lián)后，將膜與miRNA互補(bǔ)的生物素標(biāo)記DNA探針雜交過(guò)夜；雜交膜用2XSSC、0. 1% SDS在42度洗兩次(每次五分鐘)，再用0.1 X SSC、+0.1 % SDS在42度洗兩次(每次十分鐘)。接著在核酸檢測(cè)封閉緩沖液中加入穩(wěn)定的親和素偶聯(lián)物(Thermo)，然后用IX洗滌緩沖液洗五次(每次五分鐘)；最后，在底物平衡緩沖液洗脫后的雜交膜中加入穩(wěn)定的過(guò)氧化物溶液和增強(qiáng)液，將膜壓片后，用顯影液對(duì)底片進(jìn)行顯影。另外用U6探針作為上樣量的內(nèi)參。DNA探針序列由Invitrogen公司合成并進(jìn)行3’末端的生物素修飾。5’ -RACE PCR使用5’全長(zhǎng)RACE PCR試劑盒，省略去堿性磷酸酶(CAIP)和TAP (Tobacco AcidPyrophosphatase)處理,將RNA直接連接5’末端接頭,使用oligo_dT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。每個(gè)基因使用兩條基因特異嵌套引物(表I)，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMD18T載體(Takara)上進(jìn)行測(cè)序。實(shí)時(shí)PCR 和 RT-PCRRNA 用 TRIzol(Invitrogen)提取后,進(jìn)行 DNase I (Takara)處理,用 4 μ g 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)PCR和RT-PCR使用基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增(表I)。實(shí)時(shí)PCR用相對(duì)Ct值方法來(lái)衡量轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量，RT-PCR通過(guò)電泳方法判斷。白菜中與擬南芥ACT4的同源基因BrcACT4用來(lái)做內(nèi)參。每個(gè)實(shí)驗(yàn)采用三次生物學(xué)重復(fù),三次技術(shù)重復(fù)。表1: 5 ’ -RACE-PCR和實(shí)時(shí)PCR中使用到的引物

引物序列(序列編號(hào)依次為SEQ ID NO:7-21) 實(shí)驗(yàn)
FJ842796-744A (BraTAOl) CCCAACTAACCCGTCAAAATCA5'RACE PCR
FJ842796-595A (BraTAOl) TCCATCTCTCAATGTTTTCCTTCG5'RACE PCR
BracDRLl-1085ACAATTTGTCCACAACTTTTCACTG5'RACE PCR
BracDRLl-107IACTTTTCACTGAAGAGCACAAAGTGT5'RACE PCR
EE521879-613A (BracVELl) CCAGGTTCTTGCAGTAGGTAGTCTT5'RACE PCR
EE521879-560A (BracVELl) GTTGGAGCCACGTAGCGAGTAG5'RACE PCR
5'RACE PCR
bra-PAP 10 -42 SCGTCTGGAAGGACC A AATCTAT
和 RT-PCR
bra-PAP 10-5IOAGCACATCAGGACCGACTTCA5'RACE PCR
和 RT-PCR
bra-PAP 10-174ATATCGAGTGGCATATCAACCG5'RACE PCR
Brac-CSD1-54SCCCTGAGATCACAAAGGATATACAA 實(shí)時(shí) PCR
Brac-CSD1-143ATGAAGAAGATAGTCCCCTTAACACC 實(shí)時(shí) PCR
DY029374-41SAACTTCTCCACCTTTCACCATTCRT-PCR
DY029374-561AGTTGCTGCATCTCTCGTTGGRT-PCR
EE423375-157STTACCGTATGAGTGTGCTGTGART-PCR
EE423375-633AGTAGTTCTGCAAGTATGACAAGTCRT-PCR

二.結(jié)果與分析 全基因組水平分析熱響應(yīng)小RNA高溫抑制植物的生長(zhǎng)，引起葉片黃化甚至死亡。葉片黃化的嚴(yán)重程度與處理的溫度梯度及時(shí)間梯度有關(guān)。為了找出在苗期生長(zhǎng)過(guò)程中基礎(chǔ)耐熱溫度和受熱時(shí)間的臨界點(diǎn)，我們將白菜用44、45、46、47和48°C五個(gè)溫度梯度處理O. 5，I和2小時(shí)三個(gè)時(shí)間梯度(Wanget al. ,2011)。我們發(fā)現(xiàn)白菜基因型為Wu-1l的溫度臨界點(diǎn)為46°C I小時(shí)，在這個(gè)條件處理后移至常溫(22°C)的苗停止生長(zhǎng)，12天后表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象。我們預(yù)期該條件影響了早期響應(yīng)小RNA的生成，但不會(huì)帶來(lái)過(guò)多因形態(tài)和生理的改變而引起的次級(jí)效應(yīng)。為檢測(cè)熱響應(yīng)的小RNA，我們對(duì)苗齡三周的非結(jié)球型白菜Wu-11進(jìn)行了兩次獨(dú)立的熱處理實(shí)驗(yàn)。第一次實(shí)驗(yàn)中，兩組白菜分別進(jìn)行了 46°C I小時(shí)的熱處理(HTl)和22°C I小時(shí)的常溫處理(NTl)。處理過(guò)后，我們對(duì)植株的整個(gè)地上部分進(jìn)行取樣。片段大小從9nt到36nt的小RNA被分離出來(lái)構(gòu)建小RNA文庫(kù)，分別命名為HTl和NTl文庫(kù)。為確認(rèn)HTl和NTl文庫(kù)的質(zhì)量，我們采用了同樣的方法進(jìn)行了第二次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將得到的文庫(kù)分別命名為HT2和NT2文庫(kù)。NTl和HTl文庫(kù)中分別包含了 14. 67百萬(wàn)和12. 77百萬(wàn)條的小RNA讀數(shù)，NT2和HT2文庫(kù)中分別包含了 11. 25百萬(wàn)和14. 61百萬(wàn)條的小RNA讀數(shù)(表2)。表I顯示了白菜各小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)的總讀數(shù)，其中，特異的小RNA指代只在一種處理類型的數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的小RNA，共有的小RNA指代在兩種處理類型的數(shù)據(jù)庫(kù)中都存在的小RNA。因?yàn)樵诿總€(gè)實(shí)驗(yàn)中NT和HT的小RNA總數(shù)豐度不一樣，我們將每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中小RNA的讀數(shù)均一化為總數(shù)一千萬(wàn)時(shí)的讀數(shù)[每千萬(wàn)總數(shù)包含的轉(zhuǎn)錄量(TPlOM)]。表2 白菜各小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)的總讀數(shù)
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有 (a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列； (b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列； (c)與(a)或(b)具有至少80%序列相同性的核苷酸序列；和/或 (d)在嚴(yán)格條件下與(a)、(b)和/或(C)雜交的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，(c)中所述序列的相同性為至少85 %，優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %。
3.一種嵌合基因，其含有在植物細(xì)胞中有活性的操作性連接于權(quán)利要求1或2所述核酸分子的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子任選地進(jìn)一步操作性連接于3’非翻譯核酸分子。
4.一種載體，其含有權(quán)利要求1或2所述的核酸分子或權(quán)利要求3所述的嵌合基因。
5.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的嵌合基因或權(quán)利要求4所述的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
7.含有權(quán)利要求6所述的植物細(xì)胞的植物或其部分。
8.產(chǎn)生自權(quán)利要求7所述的植物的種子。
9.權(quán)利要求4所述的載體在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以提供耐熱植物中的應(yīng)用。
10.一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括降低所述植物中具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述降低所述植物中具有SEQID ΝΟ:1所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)步驟 將一核苷酸序列導(dǎo)入所述植物，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO :1所不的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，或是與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少80%相同性的核酸序列； 下調(diào)編碼SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或與SEQ IDNO:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因的表達(dá)； 使編碼SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與其mRNA靶標(biāo)的結(jié)合，和/或降低或消除SEQ ID NO I結(jié)合上后該mRNA靶標(biāo)的切割；和 使所述植物與能抑制SEQ ID NO :1所示核苷酸序列、SEQ ID NO 2所示核苷酸序列或與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的化合物接觸。
12.—種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括提高所述植物中具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :5所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO 5所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述提高所述植物中具有SEQID NO :3所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :5所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO 5所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)步驟 在所述植物中過(guò)表達(dá)一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列或具有與SEQID NO 3所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO 5所不氣基酸序列的蛋白序列，或編碼具有與SEQ ID NO :5所不氣基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的蛋白序列；和 使SEQ ID NO :3所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO :3或所述與SEQ ID NO :3具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結(jié)合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO:3或所述與SEQ ID NO 3具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結(jié)合后該mRNA的切割。
14.一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法提高所述植物中具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO :6所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述提高所述植物中具有SEQID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)步驟 在所述植物中過(guò)表達(dá)一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ IDNO :4所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或編碼具有與SEQ ID NO :6所示氨基酸序列具有至少70 %相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和 使SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO :4或所述與SEQ ID NO :4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結(jié)合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO:4或所述與SEQ ID NO 4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結(jié)合后該mRNA的切割。
16.權(quán)利要求1或2所述的核酸分子在調(diào)節(jié)植物耐熱性中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求1或2所述的核酸分子在提供耐熱性植物的遺傳分析或標(biāo)記物輔助的選擇方法中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求1或2所述的核酸分子在提供耐熱性植物的植物育種方法中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及白菜熱誘導(dǎo)miRNA及其鑒定。本發(fā)明鑒定了新穎的白菜熱響應(yīng)miRNA，miR-9.3(miR-1885.3)(如SEQ ID NO1所示)，其響應(yīng)熱應(yīng)力而下調(diào)，而它的兩個(gè)靶標(biāo)(QQT1和FRA-8)響應(yīng)熱應(yīng)力而上調(diào)。本發(fā)明進(jìn)一步證實(shí)，擬南芥中miR-9.3的下調(diào)和靶標(biāo)QQT1的過(guò)表達(dá)提高的耐熱性。因而本發(fā)明包括這類新的核酸分子、含有這些分子的載體、宿主細(xì)胞，以及這些分子、載體在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以提供耐熱植物中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及利用上述序列制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103031301SQ201110298399
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者何玉科, 馬賽爾·普瑞斯, 余祥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 荷蘭科因公司