專利名稱：一種引物及利用該引物檢測gⅰ型gⅱ型諾如病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引物及利用該引物檢測G I型G II型諾如病毒的方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
諾如病毒(Noroviruses，NVs)屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是全世界引發(fā)非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)和散發(fā)的重要病原。目前根據(jù)病毒基因RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)和主要衣殼蛋白VPl的核苷酸序列差異，諾如病毒可分為5個遺傳組 (Genogroup I V，G I V )，其中引起人類感染的主要是G I型和G II型諾如病毒，每個遺傳組又可進(jìn)一步分為若干個基因型。由于該病毒抵抗力強(qiáng)、致病劑量低、各年齡階段人群對其普遍易感，?？赏ㄟ^污染食物或水源等傳播途徑在一些公共場所如學(xué)校、幼兒園、醫(yī)院等引發(fā)大范圍的暴發(fā)流行。因此建立簡單、快速、特異靈敏的檢測方法，以及區(qū)分諾如病毒G I型和G II型對該病的防控具有重要意義。由于諾如病毒不能進(jìn)行細(xì)胞和組織培養(yǎng)，也沒有合適的動物模型，其檢測方法受到很大限制。目前用于該病毒的檢測方法主要有電鏡法、免疫學(xué)法及分子生物學(xué)法。電鏡法具有直接、可靠的優(yōu)點，但檢測靈敏度較低，通常糞便標(biāo)本病毒滴度達(dá)到io6/g才能達(dá)到檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問題，提供一種引物。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的。一種引物，它的序列如下
Nov-F 5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3 (nt5353-nt5372) Nov-R 5-GTHAGffATCCAGGGGTCAAT-3 (nt5528_nt5510)。括號中所述為該引物對應(yīng)目的片段的核苷酸位置。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用上述引物檢測G I型G II型諾如病毒的方法。利用上述引物檢測G I型G II型諾如病毒的方法，包括以下步驟
①提取待測樣品RNA，以待測樣品RNA為模板，在具有序列為Nov-F 5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3 Nov-R 5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 的引物的 RT-PCR 反應(yīng)體系中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；
②取5ml RT-PCR產(chǎn)物在含溴化乙啶的洲瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳，電泳后根據(jù)有無特異性條帶和長度判斷待檢標(biāo)本中是否含有G I型和G II型諾如病毒核酸。本發(fā)明采用RT-PCR檢測方法，利用一對諾如病毒檢測分型通用引物可實現(xiàn)一次性處理樣本即可同時檢測并區(qū)分諾如病毒G I型和G II型，并成功的應(yīng)用于臨床糞便標(biāo)本的實驗室檢測。
本發(fā)明關(guān)鍵在于引物序列的設(shè)計，RT-PCR反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件選擇和反應(yīng)結(jié)果判斷均可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。所述樣品RNA提取可按常規(guī)方法進(jìn)行，如采用德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取。所述RT-PCR反應(yīng)體系每25 μ 1組成如下
權(quán)利要求
1.一種引物，其特征在于，所述引物序列如下 Nov-F 5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3Nov-R 5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 。
2.利用權(quán)利要求1所述引物檢測GI型G II型諾如病毒的方法，包括以下步驟①提取待測樣品RNA，以待測樣品RNA為模板，在具有序列為Nov-F 5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3Nov-R 5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 的引物的 RT-PCR 反應(yīng)體系中進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)；②取5ml RT-PCR產(chǎn)物在含溴化乙啶的洲瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳，電泳后根據(jù)有無特異性條帶和長度，判斷待檢標(biāo)本中是否含有G I型和G II型諾如病毒核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測GI型G II型諾如病毒的方法，其特征在于所述RT-PCR 反應(yīng)體系每25 μ 1組成如下RT-PCR 緩沖液(10 X )2.5mlMgCl2 (25mM)5mldNTP(IOmM)2. 5mlRnase (40U/ml)0..5mlAMV (5U/ml)0..5mlEx Taq HS (5U/ml)0..5mlH2O7. 5ml上游與下游引物OOmM)各 0. 5ml模板 RNA5ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測G I型G II型諾如病毒的方法，其特征在于RT-PCR 反應(yīng)條件為50°C 30min,94°C !Bmin 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C Imin 共進(jìn)行35個循環(huán)，72°C 10min，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種引物及利用該引物檢測GⅠ型GⅡ型諾如病毒的方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。一種引物，它的序列如下Nov-F5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3，Nov-R5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 。本發(fā)明關(guān)鍵在于引物序列的設(shè)計，RT-PCR反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件選擇和反應(yīng)結(jié)果判斷均可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。本發(fā)明可實現(xiàn)一對引物在同一反應(yīng)管同時檢測并區(qū)分GⅠ型和GⅡ型諾如病毒，既簡化了操作步驟、又可縮短檢測時間。
文檔編號C12R1/93GK102304514SQ20111029755
公開日2012年1月4日 申請日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者吳曉芳, 張紅河, 徐德順, 湯仁樹, 紀(jì)蕾, 韓建康 申請人:湖州市疾病預(yù)防控制中心