專利名稱：一種fgfr4高表達的重組hek293細胞及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于重組細胞技術領域，涉及一種FGFR4高表達的重組HEK293細胞及其應用。
背景技術：
受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs)是最大的一類酶聯(lián)受體，它既是受體又是酶，能夠同配體結(jié)合，并將靶蛋白的酪氨酸殘基磷酸化。所有的RTKs都是由三個部分組成的含有配體結(jié)合位點的細胞外結(jié)構域、單次跨膜的疏水α螺旋區(qū)、含有酪氨酸蛋白激酶(RTK)活性的細胞內(nèi)結(jié)構域。受體酪氨酸激酶在沒有同信號分子結(jié)合時是以單體存在的，并且沒有活性；一旦有信號分子與受體的細胞外結(jié)構域結(jié)合，兩個單體受體分子在膜上形成二聚體，兩個受體的細胞內(nèi)結(jié)構域的尾部相互接觸，激活它們的蛋白激酶的功能，結(jié)果使尾部的酪氨酸殘基磷酸化。磷酸化導致受體細胞內(nèi)結(jié)構域的尾部裝配成一個信號復合物(signaling complex)。剛剛磷酸化的酪氨酸部位立即成為細胞內(nèi)信號蛋白 (signaling protein)的結(jié)合位點，可能有10 20種不同的細胞內(nèi)信號蛋白同受體尾部磷酸化部位結(jié)合后被激活。信號復合物通過幾種不同的信號轉(zhuǎn)導途徑，擴大信息，激活細胞內(nèi)一系列的生化反應；或者將不同的信息綜合起來引起細胞的綜合性應答(如細胞增殖)。蛋白酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導異常是多種類型腫瘤細胞區(qū)別于相應正常細胞的關鍵特征之一。已知導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的癌基因約50%的表達產(chǎn)物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它們的異常表達將導致細胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，進而導致腫瘤發(fā)生。此外，酪氨酸激酶及受體的異常表達還與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤新生血管的生成和腫瘤化療的耐藥性密切相關。蛋白酪氨酸激酶受體是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，生長因子(GF)作為配體與其結(jié)合后，刺激GFR單體二聚化(dimerization)，催化ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到酪氨酸殘基上，使其細胞膜胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)(TKD，tyrosine kinase domain)特定位點酪氨酸發(fā)生磷酸化，激活下游信號轉(zhuǎn)導通路，造成細胞發(fā)生相應生物功能變化，尤其在介導惡性腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用。人類成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor FGFRs) 家族和它們的20多個配基對細胞在生理狀況下進行多方位的調(diào)控，包括細胞生長、分化、 移行、血管生成等。FGF/FGFR信號傳遞是血管新生、胚胎發(fā)育、骨骼形成、傷口愈合、纖維化及腫瘤形成的重要原因之一。目前已確定了四種由獨立基因編碼的人FGFRs，即FGFIU FGFR4。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，腫瘤才能生長，并向周圍組織浸潤，進入血液循環(huán)向其他部位轉(zhuǎn)移，成纖維細胞生長因子受體 4(FGFR4)在胚胎組織、成人微小血管壁和乳腺癌、胰腺癌、腎癌等組織中有較高表達，而且特異性表達于成熟的肝細胞。近年來，眾多學者開展FGFR4在腫瘤生長、發(fā)生過程中的研究工作，研究結(jié)果表明FGFR4在黑色素瘤、前列腺癌、頭頸癌、乳腺癌、肝癌中表達量較高，同時，F(xiàn)GFR4介導了腫瘤細胞化療耐藥性(chemoresistance)，因此，F(xiàn)GFR4對細胞生長調(diào)控的作用引起了國內(nèi)外學者的關注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種FGFR4高表達的重組HEK293細胞，及利用該細胞進行抗腫瘤藥物的篩選，可以作為采用小分子抑制劑阻斷FGFR4表達來治療腫瘤耐藥性的細胞模型。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種FGFR4高表達的重組HEK293細胞，該重組細胞是以HEK293細胞為宿主細胞， 轉(zhuǎn)染宿主細胞的外源性表達載體的是包含F(xiàn)GFR4全長基因的表達載體。所述的FGFR4全長基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的包含F(xiàn)GFR4全長基因的表達載體是pcDNA3. 1 (+)_FGFR4，該表達載體是通過BamHI酶切位點將FGFR4全長基因克隆入真核表達載體pcDNA3. 1⑴。所述的FGFR4高表達的HEK293-FGFR1重組細胞應用于抗腫瘤藥物篩選。所述的應用是將FGFR4高表達的HEK293-FGFIU重組細胞構建成細胞膜色譜柱，以保留時間為指示，篩選以FGFR4為靶點的抗腫瘤藥物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果1、本發(fā)明構建了成纖維細胞生長因子受體4(FGFR4)的真核表達載體 pcDNA3. 13. 1 (+) /FGFR4,經(jīng)過克隆測序證實序列同NCBI數(shù)據(jù)庫中的人FGFR4序列一致； 經(jīng)過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細胞，G418抗性篩選獲得能夠穩(wěn)定生長、存活的細胞株，經(jīng)過 Western blot檢測，篩選出穩(wěn)定、高表達FGFR4的重組HEK293/FGFR4細胞株；本發(fā)明構建的包含F(xiàn)GFR4基因全長的重組HEK293/FGFR4細胞株能夠穩(wěn)定表達 FGFR4，具有完整的分子結(jié)構。2、作為宿主細胞的HEK293細胞為原代人胚腎細胞轉(zhuǎn)染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化細胞，該細胞本身還有的各種受體表達量相對較低，而重組后的HEK293/FGFR4細胞表達的FGFR4的相對表達量較HEK293空載明顯升高，相對于其他細胞表面分子占據(jù)優(yōu)勢表達量，處于特異配體結(jié)合優(yōu)勢地位，這樣就大大提高了以FGFR4為藥物篩選靶標的特異性及靈敏性。3、重組后的HEK293/FGFR4細胞表達的FGFR4利用免疫熒光檢測其在細胞膜上的表達情況，顯示細胞膜上有FGFR4表達，并體現(xiàn)出FGFR4的分子活性。4、由于重組細胞所表達的FGFR4的識別能力，而且FGFR4表達量足夠，使得其與配體的結(jié)合能力成為其篩選的依據(jù)成功地建立了穩(wěn)定高表達FGFR4的HEK293/FGFR4細胞膜色譜柱進行的藥物篩選模式，能夠與FGFR4相結(jié)合的化合物或活性成分其保留時間明顯延長，這說明以保留時間為指示，該細胞膜色譜能夠應用于抗腫瘤藥物的篩選，尤其是對活性成分較多的抗腫瘤中藥活性成分的篩選。


圖Ι-a 圖Ι-b是擴增FGFR4基因及線性化載體電泳檢測圖譜；
圖2pcDNA3. 1 (+) /FGFR4重組載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5后，提取質(zhì)粒菌液PCR鑒定結(jié)果；圖3是經(jīng)G418抗性篩選的陽性細胞培養(yǎng)圖；圖4是Wfestern blot分析陽性細胞FGFR4表達量；圖5是免疫熒光分析FGFR4在FGFR4/HEK293細胞表達定位；圖6是HEK293/FGFR4細胞生長曲線；圖7是吉非替尼在HEK293/FGFR4和HEK293細胞膜色譜的色譜圖對比。
具體實施例方式本發(fā)明在構建FGFR4全長基因的真核表達載體pcDNA3. 1 (+)/FGFR4的基礎上，轉(zhuǎn)染HEK293細胞，獲得穩(wěn)定、高表達FGFR4的重組HEK293/FGFR4細胞株，下面是對本方面做得詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明是以pcDNA3. 1 (+)為基礎載體，具體選擇HindIII和BioI酶切位點作為連接外源基因的多克隆位點。1)FGFR4 基因克隆選擇包含F(xiàn)GFR4基因全長cDNA序列p0TB7/FGFR4質(zhì)粒作為模板進行克隆，采用 Primer Premier5. 0軟件設計相應的特異性引物，并在兩端分別加入HindIIlAhoI酶切位點FGFR4-HindIII :5’ -AGTAAGCTTATGCGGCTGCTGCTGGCCCT-3‘FGFR4-XhoI :5’ -GATCTCGAGTCATGTCTGCACCCCAGACC-3’采用Takara公司LA Taq進行擴增，PCR反應體系為DNA聚合酶0. 2 μ L、 IOXLAbuffer 2. 5 μ L、dNTP 4 μ L、上游弓 | 物(10 μ mol/L) 2 μ L、下游引物(lOymol/ L)2y L、模板 DNA(p0TB7/FGFR4 質(zhì)粒)1 μ L、BSA (5 μ mol/L)、ddH20 11. 3 μ L，共 25 μ L。首次95°C變性3min,再經(jīng)過35個循環(huán)作用(94°C變性Imin，60°C復性Imin，72°C延伸3min)， 最后72°C延伸lOmin，得到大量目的片段，對產(chǎn)物采用商品化PCR純化試劑盒將擴增產(chǎn)物純化，F(xiàn)GFR4cDNA擴增結(jié)果檢測如圖所示，M為marker，結(jié)果表明擴增到了預期的基因。2)重組表達載體構建利用HindIIIAhoI雙酶切真核表達載體pcDNA3. 1 (+)和FGFR4基因純化產(chǎn)物， 酶切體系為HindIII 1 μ L、XhoI 1. 5μ LUOXM buffer 2 μ L、擴增的 FGFR4 片段和環(huán)狀 pcDNA3. 1 (+) 10 μ L、ddH20 5. 5 μ L37°C 反應 3h，對 pcDNA3. 1 (+)載體酶切產(chǎn)物采用商品化 PCR產(chǎn)物純化試劑盒將擴增產(chǎn)物純化，pcDNA3. 1 (+)載體酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖l_b所示， M 為 marker。將線性化載體同酶切后的FGFR4擴增片段4°C條件下，T4DNA Iigase作用下過夜連接，反應體系為，酶切后的線性pcDNA3. 1 (+) 2、酶切后的FGFR4片段6 μ L、T4DNA Iigase 1 μ L、iMbuffer 1 μ L,得到重組 pcDNA3. 1 (+) /FGFR4 表達載體。按照分子克隆實驗指南制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，將重組pcDNA3. 1 (+) / FGFR4質(zhì)粒加入200 μ L感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C熱激90s，加入無氨芐青霉素抗性 LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖lh，3000rpm離心3min，將菌體沉淀吹打均勻，加入含有氨芐青霉素抗性(lOOmg/mL) LB固體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆在含有氨芐青霉素抗性(100mg/mL) LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，采用商品化試劑盒獲得高純度質(zhì)粒，菌液PCR初步鑒定陽性克隆(結(jié)果如圖2所示)，并送ABI PRISM 3730DNA自動測序儀測序，驗證序列堿基，DNAstar Seqman進行序列拼接，得到的測序結(jié)果如SEQ. ID. NO. 1所示，測序結(jié)果與基因庫(NCBI)中比對，序列一致性為100%，含有正確序列即為pcDNA3. l(+)/FGFR4重組表達載體。3)高表達FGFR4重組HEK293細胞構建①使用hvitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000進行轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)HEK293細胞，在6孔板中接種3 X IO5細胞/孔，加入2mL完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37°C 培養(yǎng)過夜，待細胞長至50-80%時進行轉(zhuǎn)染。在無菌離心管中配制如下溶液溶液A 將1-2 μ g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到100 μ L無血清培養(yǎng)基中。溶液B 將2-25 μ LLipofectAMINE稀釋到100 μ L無血清培養(yǎng)基中?；旌先芤篈和B，輕輕混勻，室溫放置15 45min。用2mL無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞，加入0. SmL無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37°C孵育他。用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)。HEK293細胞的篩選濃度為600yg/ mL。轉(zhuǎn)染72小時后按1 10的比例將轉(zhuǎn)染細胞在6孔板中傳代，換為含G418的選擇培養(yǎng)基。在6孔板內(nèi)可見單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)14天左右，可見單個細胞分裂增殖形成單個抗性集落，如圖3所示。②有限稀釋法抗性集落細胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋(10_2 10_1(1)，將每一稀釋度的細胞滴加到96孔板中培養(yǎng)，15天左右細胞長滿整個孔，胰酶消化，傳代至大瓶培養(yǎng)，反復凍存、培養(yǎng)細胞兩次。4)高表達FGFR4重組HEK293鑒定①Western Blot :4°C條件下，將轉(zhuǎn)染 FGFR4、轉(zhuǎn)染 pcDNA3. 1(+)的 HEK293 細胞和 HuH7細胞株，按1.5 X IO6個細胞加入200 μ L細胞裂解液(加入蛋白酶抑制劑PMSF)的比例裂解細胞，加入150 μ Lloading buffer，沸水浴lOmin，提取細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳，用PVDF膜完成全濕電轉(zhuǎn)印，后用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF膜，經(jīng) TBST洗滌加經(jīng)過5% BSA的TBST稀釋的特異性一抗與靶蛋白4°C過夜孵育，TBST洗滌3次后，再加5% BSA的TBST稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，用ECL化學發(fā)光檢測蛋白表達，檢測HEK293/FGFR4細胞FGFR4蛋白表達。經(jīng)檢測，如圖4所示，F(xiàn)6、F9、F12、F24、F28 為篩選的轉(zhuǎn)染了 pcDNA3. l(+)/FGFR4的細胞克隆，P13為轉(zhuǎn)染空載的重組HEK293細胞，克隆F28、克隆F24、克隆F6的FGFR4表達量較克隆P13的表達量均有提高，而以克隆F28的 FGFR4表達量最高。②免疫熒光分析FGFR4表達定位取對數(shù)生長期的pcDNA3. 1(+)空載細胞和 pcDNA3. 1⑴/FGFR4細胞，0. 25 %胰蛋白酶消化，按1 X IO5個/孔左右接種于放有多聚賴氨酸預處理的無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌爬有細胞的蓋玻片三次。4%以PBS (pH= 7.4)溶解多聚甲醛ImL固定細胞15min，后棄去。 PBS輕柔洗滌細胞2次，加入ImL含牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBST 孵育細胞30min。用含牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBST以1 50 稀釋兔抗人FGFR4多克隆抗體，加到蓋玻片上，室溫孵育45min。PBS輕輕洗滌三次。每次 5min。用含BSA的PBST以1 100稀釋FITC標記山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室溫避光孵育lh。于暗處，PBS洗滌三次，每次5min。在載玻片上滴加90%甘油封片，注意不要產(chǎn)生氣泡。用熒光顯微鏡觀察并拍照，結(jié)果如圖5所示，其中A為pcDNA3. 1 (+)/FGFR4 細胞克隆觀免疫熒光結(jié)果，B為pcDNA3. 1(+)細胞免疫熒光結(jié)果，兩者對比明顯發(fā)現(xiàn)前者具有FGFR4免疫熒光的綠色熒光，而后者沒有；這表明重組細胞中FGFR4得到了有效的表達。④取生長良好接近匯合的細胞，用0. 25%胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液，計數(shù)。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果稀釋細胞懸液至濃度為1 X IO4個/mL，每25mL小瓶接種2mL細胞懸液，共接種30瓶細胞。24h后開始計數(shù)細胞，以后每隔24h計數(shù)一次，連續(xù)計數(shù)10d。每次取3瓶細胞，分別計數(shù)，計算平均值。每隔3d給未計數(shù)的細胞換液。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以時間為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標，繪制生長曲線，結(jié)果如圖6所示，與沒有轉(zhuǎn)染FGFR4的對照細胞相比較，轉(zhuǎn)染了 FGFR4的細胞在培養(yǎng)6d后生長速度明顯加快，表現(xiàn)出FGFR4特有的刺激效果，進一步可以證明重組細胞的基于FGFR4信號通路也能夠被相應的激活，從而體現(xiàn)在生長速度的加快；另一方面說明在經(jīng)過較短的時間培養(yǎng)之后就可以獲得一定數(shù)量的重組細胞。5)細胞膜色譜檢測HEK293/FGFR4和HEK293對吉非替尼的保留時間由于作為宿主細胞的HEK293細胞為原代人胚腎細胞轉(zhuǎn)染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化細胞，該細胞本身還有的各種受體表達量相對較低，而重組后的HEK293/FGFR4細胞表達的FGFR4的相對表達量較HEK293空載明顯升高，相對于其他細胞表面分子占據(jù)優(yōu)勢表達量，處于特異配體結(jié)合優(yōu)勢地位，這樣就大大提高了以FGFR4為藥物篩選靶標的特異性及靈敏性。而且重組的細胞表現(xiàn)出FGFR4相應的活性。那么，高表達FGFR4的HEK293/FGFR4細胞可以作為采用小分子抑制劑阻斷FGFR4 表達來治療腫瘤耐藥性的細胞模型，更進一步，可以應用于抗腫瘤藥物的篩選將FGFR4高表達的HEK293-FGFIU重組細胞構建成細胞膜色譜柱，以保留時間為指示，篩選以FGFR4為靶點的抗腫瘤藥物。高表達FGFR4的HEK293/FGFR4細胞膜色譜柱平衡后進行樣品檢測(用包含吉非替尼(1.16mg/ml)的甲醇上樣)，以5mmol/L (pH 7.4)醋酸銨緩沖液為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉非替尼在該細胞膜上有很好的保留，同時以未轉(zhuǎn)染的HEK293細胞作為陰性對照。吉非替尼在HEK293/FGFR4和HEK293細胞膜固定相的保留色譜圖對比如圖7所示所示，橫坐標為時間(分鐘)。以5mmol/L(pH 7. 4)醋酸銨緩沖液為流動相，吉非替尼在兩者的的保留時間分別為12min和6min。這是由于HEK293/FGFR4細胞膜色譜柱上高表達的 FGFR4與吉非替尼發(fā)生了結(jié)合，延遲了吉非替尼被洗脫的時間，表現(xiàn)出了對能夠與FGFR4相結(jié)合的抗腫瘤藥物的特異性的結(jié)合的能力，并且以保留時間作為指示，可以作為篩選的標記。因此，HEK293/FGFR4細胞株在細胞膜色譜分析篩選活性化合物上，具有靈敏性高、 結(jié)合力強的優(yōu)點，可以應用于針對FGFR4靶點的抗腫瘤藥物的篩選，尤其是應用于活性成分較多的抗腫瘤中藥活性成分的篩選上。
權利要求
1.一種FGFR4高表達的重組HEK293細胞，其特征在于，該重組細胞是以HEK293細胞為宿主細胞，轉(zhuǎn)染宿主細胞的外源性表達載體的是包含F(xiàn)GFR4全長基因的表達載體。
2.如權利要求1所述的FGFR4高表達的重組HEK293細胞，其特征在于，所述的FGFR4 全長基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如權利要求1所述的FGFR4高表達的重組HEK293細胞，其特征在于，所述的包含 FGFR4全長基因的表達載體是pcDNA3. 1 (+) -FGFR4，該表達載體是通過BamHI酶切位點將 FGFR4全長基因克隆入真核表達載體pcDNA3. 1⑴。
4.權利要求3所述的FGFR4高表達的HEK293-FGFIU重組細胞應用于抗腫瘤藥物篩選。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，將FGFR4高表達的HEK293-FGFIU重組細胞構建成細胞膜色譜柱，以保留時間為指示，篩選以FGFR4為靶點的抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種FGFR4高表達的重組HEK293細胞及其應用，該重組細胞是以HEK293細胞為宿主細胞，轉(zhuǎn)染宿主細胞的外源性表達載體的是包含F(xiàn)GFR4全長基因的表達載體。FGFR4高表達的HEK293-FGFRl重組細胞應用于抗腫瘤藥物篩選。
文檔編號C12N5/10GK102337247SQ20111026967
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權日2011年9月13日
發(fā)明者侯曉芳, 張濤, 李淼, 杜暉, 王嗣岑, 賀浪沖 申請人:西安交通大學