專利名稱：腹水腫瘤細(xì)胞致敏dc-cik的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法與DC-CIK的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫治療是即手術(shù)、放療和化療之外腫瘤臨床治療的重要手段，對清除腫瘤患者體內(nèi)殘留和轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)及提高患者的生存率和生存治療具有重要的作用和價值。目前腫瘤的免疫治療手段主要有淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)、自然殺傷細(xì)胞(NK)、經(jīng)修飾的自體樹突狀細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞治療(DC-T)、自體樹突細(xì)胞刺激的CIK免疫治療(DC-CIK)等。DC細(xì)胞是Meinman和Cohn于1973年首先報道的，因其成熟時有樹突樣或偽足樣突起而得名。它是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)，DC在免疫應(yīng)答過程中處于調(diào)控地位①機(jī)體的衛(wèi)士 未成熟的DC主要在分布的原位攝取、加工和處理抗原，然后遷移至淋巴器官激發(fā)免疫應(yīng)答。②免疫應(yīng)答的始動者成熟的DC遞呈抗原并刺激靜息期的初始型和記憶性T細(xì)胞，使其活化。③有刺激T細(xì)胞的強(qiáng)效數(shù)量很少的DC和低水平的抗原就能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答，表達(dá)協(xié)同刺激分子。有研究顯示，絕大多數(shù)腫瘤患者存在 DC數(shù)量減少和功能障礙，DC的浸潤程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的浸潤深度、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、預(yù)后等均有密切的關(guān)系，同時也提示體外誘導(dǎo)足夠數(shù)量的功能強(qiáng)大的DC用于糾正患者的免疫缺陷成為一種可能。CIK細(xì)胞是一種非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。 CIK用于殺傷腫瘤被認(rèn)為是腫瘤過繼免疫治療的首選方案。樹突狀細(xì)胞(DC)在腫瘤細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的相互作用中起到橋梁和樞紐作用。二者共同培養(yǎng)后，不僅提高了 CIK的增殖能力和殺傷活性，并且治療范圍廣泛，對多個系統(tǒng)的腫瘤具有1+1 > 2的療效。目前DC-CIK主要是無抗原致敏的DC-CIK、腫瘤特異性抗原致敏的DC-CIK及腫瘤細(xì)胞株致敏的DC-CIK。大量研究表明，DC與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)后，DC的抗原提呈及激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力得到提高，CIK的增殖活性和細(xì)胞毒作用得以增強(qiáng)。經(jīng)抗原負(fù)載的DC與未經(jīng)抗原負(fù)載的DC均可使CIK細(xì)胞的殺瘤活性提高，但是經(jīng)抗原負(fù)載的DC能夠提成更多的腫瘤抗原，更好地協(xié)同刺激CIK細(xì)胞的活化，具有更高的殺瘤活性，兩者比較有顯著差異 (P < 0. 05)。DC細(xì)胞體外負(fù)載的抗原主要是已知的腫瘤特異性抗原，腫瘤細(xì)胞株裂解物。由于很多腫瘤的特異性抗原尚未明確并且腫瘤發(fā)生的抗原突變能抵抗單一抗原的免疫攻擊，因此用特異性抗原致敏DC細(xì)胞具有一定的局限性。另外腫瘤細(xì)胞株在體外傳代過程中表面抗原可能發(fā)生改變，DC細(xì)胞不能將該腫瘤的所有抗原呈遞給效應(yīng)T細(xì)胞，限制了 DC-CIK的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。傳統(tǒng)的腹水腫瘤細(xì)胞的提取方法有多種，免疫磁珠法較為先進(jìn)，但是需要特異性腫瘤細(xì)胞抗體，價格昂貴；密度梯度離心法操作較為簡單、經(jīng)濟(jì)，但是由于腹水中含有較多的紅細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞等，制備成的細(xì)胞懸液密度較高，不利于腫瘤細(xì)胞的分離；貼壁培養(yǎng)法，將淋巴細(xì)胞分離液分離得到的淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合物共同培養(yǎng)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞易貼壁而淋巴細(xì)胞不貼壁的原理分離腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞需要在體外傳代培養(yǎng)，表面抗原亦可能發(fā)生變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能獲得高增殖活性和殺瘤活性的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下一種腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，包括如下步驟腹水腫瘤抗原的制備用PBS緩沖液重懸腹水腫瘤細(xì)胞，再與終濃度為0. 1 1. Omg/ml的亮抑蛋白酶抑制劑混合，形成混合液，置于液氮中5 IOmin后，接著置入36 38°C水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)2 5次，然后依次進(jìn)行離心，微孔濾膜過濾，得到腹水腫瘤抗原；臍帶血單個核細(xì)胞的制備將獲取的新鮮臍帶血離心后，分別收集上層的臍帶血漿和下層的臍帶血細(xì)胞，將所述臍帶血細(xì)胞用DPBS緩沖液稀釋，再用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，用DPBS緩沖液清洗，顯微鏡下觀察計(jì)單個核細(xì)胞數(shù)，最后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液 GT-T551調(diào)節(jié)單個核細(xì)胞密度為1 2X IO6個/ml，得到單個核細(xì)胞懸液，其中，所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551含有體積濃度為1 10%所述臍帶血漿；臍帶血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將所述單個核細(xì)胞懸液培養(yǎng)1 1. 5小時，然后沖洗細(xì)胞，獲得沒有粘附的細(xì)胞和粘附細(xì)胞；CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增將所述沒有粘附的細(xì)胞移入含體積濃度1 10%的所述臍帶血漿的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中，并加入終濃度為500 1000IU/ml的重組人γ-干擾素混合，再培養(yǎng)12 36小時后，加入終濃度為50ng/ml 250ng/ml抗胸腺細(xì)胞球蛋白、 終濃度為0. 5 2ng/ml的重組人白細(xì)胞介素_1、終濃度為500 1000IU/ml的重組人白細(xì)胞介素-2進(jìn)行再次培養(yǎng)7 8天，收集CIK細(xì)胞；DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增及DC細(xì)胞負(fù)載腹水腫瘤抗原將所述粘附細(xì)胞加入DC培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 4天后加入終濃度為15 30 μ g/ml的所述腹水腫瘤抗原繼續(xù)培養(yǎng)2 4天后， 加入終濃度為200 lOOOng/ml的腫瘤壞死因子，得到負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞；DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備DC-CIK 將所述負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞與所述CIK 細(xì)胞混合培養(yǎng)，得到腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK。上述腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法制備的DC-CIK增殖活性和殺瘤活性高，其增殖倍數(shù)平均高達(dá)210. 33士 1. 16，是傳統(tǒng)方法獲得的DC-CIK增殖倍數(shù)的2倍，具體數(shù)值參見表1 ；其殺瘤率高達(dá)70 80%，與傳統(tǒng)方法獲得的DC-CIK殺瘤率相比，提高了 10 30%。其中，上述腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法采用腹水腫瘤細(xì)胞獲取腹水腫瘤細(xì)胞抗原，與腫瘤特異性抗原相比，該腹水腫瘤細(xì)胞抗原中抗原肽豐富，有效避免了腫瘤細(xì)胞可能對特異性單一抗原的抵抗作用；與腫瘤細(xì)胞株抗原相比，由于腹水腫瘤細(xì)胞是原代細(xì)胞，可以避免腫瘤細(xì)胞株在體外傳代過程中可能產(chǎn)生的抗原結(jié)構(gòu)的改變；在腹水腫瘤抗原制備的步驟中，蛋白酶抑制劑有效保持了腫瘤抗原的完整性；在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增步驟中的抗胸腺細(xì)胞球蛋白提高了 DC-CIK的增殖效率。另外，上述腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法工序簡單，條件易控，對設(shè)備要求低。由于該方法獲得的DC-CIK增殖效率高，因此， 有效降低了獲取DC-CIK的成本。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例提供了一種能獲得高增殖活性和殺瘤活性的腹水腫瘤細(xì)胞致敏 DC-CIK的制備方法。該腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法的工藝流程如圖1所示，包括如下步驟步驟Si，腹水腫瘤抗原的制備用PBS緩沖液重懸腹水腫瘤細(xì)胞，再與終濃度為 0. 1 1. Omg/ml的亮抑蛋白酶抑制劑混合，形成混合液，置于液氮中5 IOmin后，接著置入36 38°C水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)2 5次，然后依次進(jìn)行離心，微孔濾膜過濾，得到腹水腫瘤抗原；步驟S2，臍帶血單個核細(xì)胞的制備將獲取的新鮮臍帶血離心后，分別收集上層的臍帶血漿和下層的臍帶血細(xì)胞，將該臍帶血細(xì)胞用DPBS緩沖液稀釋，再用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，用DPBS緩沖液清洗，顯微鏡下觀察計(jì)單個核細(xì)胞數(shù)，最后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551調(diào)節(jié)單個核細(xì)胞密度為1 2X IO6個/ml，得到單個核細(xì)胞懸液，其中，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551含有體積濃度為1 10%所述臍帶血漿；步驟S3，臍帶血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將單個核細(xì)胞懸液培養(yǎng)1 1. 5小時，然后沖洗細(xì)胞，獲得沒有粘附的細(xì)胞和粘附細(xì)胞；步驟S4, CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增將沒有粘附的細(xì)胞移入含體積濃度1 10%的臍帶血漿的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中，并加入終濃度為500 1000IU/ml的重組人γ-干擾素混合，再培養(yǎng)12 36小時后，加入終濃度為50ng/ml 250ng/ml抗胸腺細(xì)胞球蛋白、 終濃度為0. 5 2ng/ml的重組人白細(xì)胞介素_1、終濃度為500 1000IU/ml的重組人白細(xì)胞介素-2進(jìn)行再次培養(yǎng)7 8天，收集CIK細(xì)胞；步驟S5，DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增及DC細(xì)胞負(fù)載腫瘤抗原將粘附細(xì)胞加入DC培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 4天后加入終濃度為15 30 μ g/ml的腹水腫瘤抗原繼續(xù)培養(yǎng)2 4天后，加入終濃度為200 lOOOng/ml的腫瘤壞死因子，得到負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞；步驟S6，DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備DC-CIK 將負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞與CIK 細(xì)胞混合培養(yǎng)，得到腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK。這樣，上述腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法制備的DC-CIK增殖活性和殺瘤活性高，其增殖倍數(shù)平均高達(dá)210. 33士 1. 16，是傳統(tǒng)方法獲得的DC-CIK增殖倍數(shù)的2倍， 具體數(shù)值參見表1 ；其殺瘤率高達(dá)70 80%，與傳統(tǒng)方法獲得的DC-CIK殺瘤率相比，提高了 10 30%。其中，該腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法采用腹水腫瘤細(xì)胞獲取腹水腫瘤細(xì)胞抗原，與腫瘤特異性抗原相比，該腹水腫瘤細(xì)胞抗原中抗原肽豐富，有效避免了腫瘤細(xì)胞可能對特異性單一抗原的抵抗作用；與腫瘤細(xì)胞株抗原相比，由于腹水腫瘤細(xì)胞是原代細(xì)胞，可以避免腫瘤細(xì)胞株在體外傳代過程中可能產(chǎn)生的抗原結(jié)構(gòu)的改變；在腹水腫瘤抗原制備的步驟中，蛋白酶抑制劑避免在裂解腹水腫瘤細(xì)胞過程中腹水腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶釋放到胞外對腹水腫瘤細(xì)胞抗原蛋白的降解作用，保持了腹水腫瘤細(xì)胞抗原的完整性，對腹水腫瘤細(xì)胞抗原的具有一定的保護(hù)作用，從而可以通過DC細(xì)胞將更多的腹水腫瘤細(xì)胞抗原提呈給CIK細(xì)胞，協(xié)同刺激CIK細(xì)胞的活化；在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增步驟中的抗胸腺細(xì)胞球蛋白是多克隆的兔免疫球蛋白，有效提高了 DC-CIK的增殖效率。另外，上述腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法工序簡單，條件易控，對設(shè)備要求低。由于該方法獲得的 DC-CIK增殖效率高，因此，有效降低了獲取DC-CIK的成本。具體地，上述步驟Sl中，腹水腫瘤細(xì)胞的獲取方法優(yōu)選為取癌性腹水，用終含量為5 15IU/ml的肝素鈉抗凝，將抗凝后的腹水與羥乙基淀粉按體積比為5 6 1的比例混合，2 8°C下靜置，沉降紅細(xì)胞，取上層液，進(jìn)行第一次離心，收集下層細(xì)胞，用PBS重懸所述細(xì)胞，洗滌、第二次離心，用PBS 二次重懸所述細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液，將所述細(xì)胞懸液加到人腫瘤細(xì)胞分離液的液面上，第三次離心，收集腹水腫瘤細(xì)胞。該優(yōu)選的腹水腫瘤細(xì)胞獲取方法只需經(jīng)分離、純化處理，不需要在體外培養(yǎng)，工序簡單，采用羥乙基淀粉與抗凝后的腹水混合，有效的除去了腹水中的紅細(xì)胞，使得分離獲取的腹水腫瘤細(xì)胞純度高，從而有效克服了現(xiàn)有的如免疫磁珠法、密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)法等提取方法的不足。其中，肝素鈉的終含量優(yōu)選為10IU/ml，靜置的溫度優(yōu)選為4°C。第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為600g，離心時間優(yōu)選為5 IOmin ；第三次離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為700 900g，更優(yōu)選為 800g,離心時間優(yōu)選為10 25min，更優(yōu)選為15min，經(jīng)第三次離心分離后，整個混合液會分成不同液層，從含有腹水腫瘤細(xì)胞的液層中收集腹水腫瘤細(xì)胞。另外，收集的腹水腫瘤細(xì)胞還可進(jìn)一步的純化處理，如再次用PBS洗滌，在轉(zhuǎn)速為600g的條件下離心5 lOmin。該腹水腫瘤細(xì)胞獲取進(jìn)一步具體的方法請參見下文中實(shí)施例1的步驟S11。其中，該癌性腹水來源于醫(yī)院手術(shù)后廢棄的病人腹水。在該步驟Sl中，混合液中的亮抑蛋白酶抑制劑濃度優(yōu)選為0. 5mg/ml。該優(yōu)選含量的亮抑蛋白酶抑制劑濃度能進(jìn)一步避免在裂解腹水腫瘤細(xì)胞過程中，胞內(nèi)蛋白酶釋放到胞外對腹水腫瘤抗原蛋白的降解作用，保持了腹水腫瘤抗原的完整性，對腹水腫瘤抗原的具有一定的保護(hù)作用，從而可以通過DC細(xì)胞將更多的腹水腫瘤抗原提呈給CIK細(xì)胞，協(xié)同刺激CIK細(xì)胞的活化。在該步驟Sl中，混合液置于液氮中時，腹水腫瘤細(xì)胞發(fā)生裂解，為了使腹水腫瘤細(xì)胞盡可能的全部發(fā)生裂解，釋放全部的抗原，重復(fù)裂解的次數(shù)優(yōu)選為3次。微孔濾膜過濾的孔徑優(yōu)選為0. 15 0. 22 μ m,進(jìn)一步優(yōu)選為0. 22 μ m。上述步驟S2中，新鮮臍帶血分離的優(yōu)選在轉(zhuǎn)速700g的條件下離心20分鐘，經(jīng)離心獲得的上層臍帶血漿優(yōu)選置于2 8°C的溫度下保存?zhèn)溆?。淋巴?xì)胞分離液的比重優(yōu)選為1.077。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中含有的經(jīng)離心獲得的上層臍帶血漿的體積濃度優(yōu)選 5%，該優(yōu)選的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551更有利于下述步驟S3中臍帶血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的培養(yǎng)。其中，該臍帶血從血庫獲取。
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上述步驟S3中，單個核細(xì)胞懸液培養(yǎng)優(yōu)選在37°C、5% CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。沖洗細(xì)胞的方式可以采用移液管沖洗，沖洗的強(qiáng)度應(yīng)該保證粘附細(xì)胞不脫落。上述步驟S4中，沒有粘附的細(xì)胞在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中培養(yǎng)的條件優(yōu)選為培養(yǎng)溫度37°C、5% CO2飽和濕度?？剐叵偌?xì)胞球蛋白(thymoglobulin)是一種多克隆的兔免疫球蛋白，是一種用于治療腎移植排斥反應(yīng)的免疫抑制劑，發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，它能明顯提高DC-CIK的增殖效率，其在整個淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中的終濃度優(yōu)選為IOOng/ ml 200ng/ml，且該抗胸腺細(xì)胞球蛋白優(yōu)選為粘附的細(xì)胞培養(yǎng)M小時后添加。在該步驟S4中，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中含有的經(jīng)離心獲得的上層臍帶血漿的濃度優(yōu)選5V/V%，重組人白細(xì)胞介素-I(IL-I)的終濃度優(yōu)選為lng/ml，所述重組人白細(xì)胞介素-2(IL-2)的終濃度優(yōu)選為1000IU/ml。另外，在該步驟S4中，為了提供足量的所需營養(yǎng)和保持營養(yǎng)的平衡，沒有粘附的細(xì)胞在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551培養(yǎng)過程中，優(yōu)選每隔2 3天補(bǔ)充該培養(yǎng)液GT-T551、臍帶血漿和IL-2。上述步驟S5中，DC培養(yǎng)液優(yōu)選包含1 10%的上述臍帶血漿、80 120ng/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、25 30ng/ml的白細(xì)胞介素_4 (IL-4)。其中，臍帶血漿更優(yōu)選為5%。該優(yōu)選配方的DC培養(yǎng)液能有利于DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增DC細(xì)胞負(fù)載腹水腫瘤抗原。優(yōu)選將粘附細(xì)胞在該DC培養(yǎng)液中培養(yǎng)第3天，再補(bǔ)加GM-CSF和IL-4， 使得兩者濃度恢復(fù)原配方含量，保持各組分含量在DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增過程中保持平衡。在該步驟S5中，加入腹水腫瘤抗原在該DC培養(yǎng)液的中濃度優(yōu)選為20 μ g/ml，加入的腫瘤壞死因子的終濃度優(yōu)選為500ng/ml。該優(yōu)選的腹水腫瘤抗原的濃度能使得其更高效的負(fù)載在DC細(xì)胞上，該濃度的腫瘤壞死因子能有效的誘導(dǎo)DC成熟。在該步驟S5中，粘附細(xì)胞在DC培養(yǎng)液中的培養(yǎng)優(yōu)選在37°C、5 % CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)。上述步驟S6中，DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞優(yōu)選按1 10 3的比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，更優(yōu)選的DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞個數(shù)混合培養(yǎng)的比例為1 5。該DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞按混合培養(yǎng)優(yōu)選是在含有5V/V%的上述臍帶血漿、1000IU/ml重組人白細(xì)胞介素_2的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中培養(yǎng)。該優(yōu)選的培養(yǎng)液更有利于提高DC-CIK的產(chǎn)率。該培養(yǎng)的條件與上述步驟S5中培養(yǎng)條件相同。另外，為了提供足量的所需營養(yǎng)和保持營養(yǎng)的平衡，在DC細(xì)胞與 CIK細(xì)胞按混合培養(yǎng)過程中，優(yōu)選每隔2 3天補(bǔ)充該培養(yǎng)液。本發(fā)明中，上述“V/V%”均表示體積百分含量。另外，上述步驟Sl也可以與步驟 S2至步驟S4同時進(jìn)行，或者摻插在步驟S2至步驟S4之間的任相鄰的兩步驟之間進(jìn)行?，F(xiàn)以具體的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，參見圖1所示，包括如下步驟Sll.腹水腫瘤抗原的制備方法(1)從腹水中分離獲得腫瘤細(xì)胞取癌性腹水400ml，用10IU/ml肝素鈉抗凝，將抗凝腹水與6%的羥乙基淀粉以5 1的比例混合均勻，4°C靜置lh，沉降紅細(xì)胞，取上層液， 600g，離心5-10min,棄上清，用PBS重懸細(xì)胞，洗滌1次，600g,離心5—lOmin，再用50ml PBS重懸細(xì)胞；取15ml離心管，分別加入5ml人腫瘤細(xì)胞分離液，密度1. 055，小心沿管壁將細(xì)胞懸液5ml加到人腫瘤細(xì)胞分離液的上方，注意不要搖晃離心管，800g，離心15min，從人腫瘤細(xì)胞液界面上的液層中收集腫瘤細(xì)胞，用PBS洗滌1次，600g，離心5-lOmin。(2)腫瘤抗原的制備收集上述步驟O)中獲得的107個細(xì)胞，用Iml PBS重懸細(xì)胞，加入終濃度0. 5mg/ml的亮抑蛋白酶抑制劑，混勻，置液氮中進(jìn)行裂解，8min后迅速置入屬37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)3次，900g,離心20min，0. 22 μ m微孔濾膜過濾，測定蛋白質(zhì)濃度，于-20°C保存，備用。S12.臍帶血單個核細(xì)胞的制備獲取新鮮臍帶血80ml，離心(700g，20min)，離心后分為兩層，上層為臍帶血漿，下層為臍帶血細(xì)胞，將上層臍帶血漿經(jīng)處理后，放置于2-8°C 保存?zhèn)溆?；將下層臍帶血?xì)胞用DPBS稀釋至80ml，用比重為1. 077的淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，用DPBS清洗兩次，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，最后用含體積含量5%的上述制備好的血漿的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度1-2X IO6個/ml。S13.臍帶血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將上述細(xì)胞懸液移入75cm2培養(yǎng)瓶，置于37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中1-1. 5h，然后用移液管輕輕沖洗細(xì)胞，將沒有粘附的細(xì)胞收集備用，粘附細(xì)胞用做DC細(xì)胞的制備；S14. CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增將上述收集的沒有粘附的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一 75cm2培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶盛裝含有體積濃度為5%的臍帶血漿的GT-T551培養(yǎng)基，再加入終濃度為1000IU/ml的重組人Y-干擾素(INF-γ)，置于37 °C、5V/V% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入終濃度為lOOng/ml的抗胸腺細(xì)胞球蛋白(thymoglobulin)、終濃度為Ing/ ml的重組人白細(xì)胞介素-I(IL-I)和終濃度為1000IU/ml的重組人白細(xì)胞介素_2(IL_2)， 并每2天給細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)液，含有GT-T551培養(yǎng)基、5%血漿、1000IU/ml重組人白細(xì)胞介素-2 (IL-2)。培養(yǎng)至8天時，收集CIK細(xì)胞待用；S15. DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增及DC細(xì)胞負(fù)載腹水腫瘤抗原將上述粘附細(xì)胞加入50ml 的DC培養(yǎng)液，該DC培養(yǎng)液含有血漿、重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)，終濃度分別為 5%、80-120ng/ml 和 25_30ng/ml，置于 37°C、5v/v% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天時，補(bǔ)加重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素_4(IL-4)，終濃度分別為80-120ng/ml和25-30ng/ml，并加入上述在步驟Sll中制備的腹水腫瘤抗原，使終濃度為20μ g/ml，繼續(xù)于飽和濕度、37°C、5. 0v/v% CO2培養(yǎng)。第 6天，加入腫瘤壞死因子(TNF- α )，使終濃度為500ng/ml ；S16.負(fù)載腫瘤抗原的DC與CIK共培養(yǎng)制備DC-CIK細(xì)胞步驟S15中的粘附細(xì)胞培養(yǎng)第8天，將負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞吹打下來，與CIK混合培養(yǎng)，該DC與CIK共培養(yǎng)的培養(yǎng)液為含有體積濃度為5%的所述臍帶血漿、1000IU/ml的重組人白細(xì)胞介素_2的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551，在之后的培養(yǎng)過程中每3天給DC-CIK細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)液，含有GT-T551 培養(yǎng)基、5 %血漿、1000IU/ml重組人白細(xì)胞介素_2 (IL-2)。按照本實(shí)施例1制備的DC-CIK細(xì)胞的方法，共進(jìn)行10組實(shí)驗(yàn)，并將該10組實(shí)驗(yàn)制備的DC-CIK細(xì)胞的相關(guān)性能進(jìn)行了檢測分析，檢測的關(guān)于該10組實(shí)驗(yàn)制備的DC-CIK細(xì)胞的相關(guān)性能指標(biāo)具體參見下文“實(shí)施例1和對比實(shí)例1制備DC-CIK細(xì)胞相關(guān)性能指標(biāo)檢測”。對比實(shí)例1
現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，包括如下步驟S21.傳統(tǒng)腫瘤抗原的制備(1)傳統(tǒng)方法獲得腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇凍存的腫瘤細(xì)胞，常規(guī)方法培養(yǎng)，胰酶消化收集腫瘤細(xì)胞；(2)腫瘤抗原的制備收集IO7個腫瘤細(xì)胞，用Iml PBS重懸細(xì)胞，置液氮中，IOmin 后迅速置入屬37°C水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)3次，900g,離心20min， 0. 22 μ m微孔濾膜過濾，測定蛋白質(zhì)濃度，于_20°C保存，備用；S22.單個核細(xì)胞的制備用生理鹽水稀釋50ml人臍帶血，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，離心2000rpm，20_25min，用Hanks液洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用AIM-V調(diào)成細(xì)胞密度3 5X 106/ml懸液。S23.淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將上述細(xì)胞懸液移入6孔板瓶，置于37°C、5v/ v% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中池，然后用移液管輕輕沖洗細(xì)胞，將沒有粘附的細(xì)胞收集備用，粘附細(xì)胞用做DC細(xì)胞的制備；SM. CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增將上述收集的沒有粘附的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)瓶中， 加入重組人Y-干擾素(INF-Y)，終濃度為1000IU/ml，置于37°C、5v/v% 0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，24h后加入鼠抗人⑶3單克隆，終濃度為lOOng/ml ；重組人白細(xì)胞介素-1 (IL-I)，終濃度為lu/ml ；重組人白細(xì)胞介素-2 (IL-2)，終濃度為500U/ml。之后每2_3 天給細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)液，含有AIM-V培養(yǎng)基、500IU/ml重組人白細(xì)胞介素_2 (IL-幻，培養(yǎng)至第 8天時，收集CIK細(xì)胞待用；S25. DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增及DC細(xì)胞負(fù)載腫瘤抗原將上述粘附的細(xì)胞每孔加入 DC培養(yǎng)液:3ml，DC培養(yǎng)液含有重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)，終濃度分別為800u/ml和500u/ml，置于37°C、5v/v% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第5天，加入腫瘤抗原使終濃度為10-50 μ g/ml ；S26.負(fù)載腫瘤抗原的DC與CIK共培養(yǎng)制備DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)第8天，將負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞吹打下來，與CIK混合培養(yǎng)，之后每2-3天給DC-CIK細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)液。按照本對比實(shí)例1制備的DC-CIK細(xì)胞的方法，共進(jìn)行10組實(shí)驗(yàn)，并將該10組實(shí)驗(yàn)制備的DC-CIK細(xì)胞的相關(guān)性能進(jìn)行了檢測分析，檢測的關(guān)于該10組實(shí)驗(yàn)制備的DC-CIK 細(xì)胞的相關(guān)性能指標(biāo)具體參見下文“實(shí)施例1和對比實(shí)例1制備DC-CIK細(xì)胞相關(guān)性能指標(biāo)檢測”。實(shí)施例1和對比實(shí)例1制備DC-CIK細(xì)胞相關(guān)性能指標(biāo)檢測1.無菌和熱源檢測經(jīng)測得，實(shí)施例1對比實(shí)例1所制備的DC-CIK細(xì)胞無菌試驗(yàn)和熱源試驗(yàn)均為陰性。2.表型檢測用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型，實(shí)施例1制備的DC-CIK細(xì)胞表型結(jié)果為T淋巴細(xì)胞(⑶3+細(xì)胞)占細(xì)胞總數(shù)的98%以上，以及少量DC。其中，T淋巴細(xì)胞亞群比例因個體差異有一定的變化范圍⑶3+⑶56+細(xì)胞比例為40 60%，⑶3+⑶8+細(xì)胞比例為60 80%。 對比實(shí)例1制備的DC-CIK中CD3+CD56+細(xì)胞比例為20 50%，CD3+CD8+細(xì)胞比例為40 65%。
3.細(xì)胞增殖活性檢測
權(quán)利要求
1.一種腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，包括如下步驟腹水腫瘤抗原的制備用PBS緩沖液重懸腹水腫瘤細(xì)胞，再與終濃度為0. 1 1. Omg/ ml的亮抑蛋白酶抑制劑混合，形成混合液，置于液氮中5 IOmin后，接著置入36 38°C 水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)2 5次，然后依次進(jìn)行離心，微孔濾膜過濾，得到腹水腫瘤抗原；臍帶血單個核細(xì)胞的制備將獲取的新鮮臍帶血離心后，分別收集上層的臍帶血漿和下層的臍帶血細(xì)胞，將所述臍帶血細(xì)胞用DPBS緩沖液稀釋，再用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，用DPBS緩沖液清洗，顯微鏡下觀察計(jì)單個核細(xì)胞數(shù)，最后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液 GT-T551調(diào)節(jié)單個核細(xì)胞密度為1 2X IO6個/ml，得到單個核細(xì)胞懸液，其中，所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551含有體積濃度為1 10%所述臍帶血漿；臍帶血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將所述單個核細(xì)胞懸液培養(yǎng)1 1. 5小時，然后沖洗細(xì)胞，獲得沒有粘附的細(xì)胞和粘附細(xì)胞；CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增將所述沒有粘附的細(xì)胞移入含體積濃度1 10%的所述臍帶血漿的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中，并加入終濃度為500 1000IU/ml的重組人Y -干擾素混合，再培養(yǎng)12 36小時后，加入終濃度為50ng/ml 250ng/ml抗胸腺細(xì)胞球蛋白、終濃度為0. 5 2ng/ml的重組人白細(xì)胞介素_1、終濃度為500 1000IU/ml的重組人白細(xì)胞介素-2進(jìn)行再次培養(yǎng)7 8天，收集CIK細(xì)胞；DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增及DC細(xì)胞負(fù)載腹水腫瘤抗原將所述粘附細(xì)胞加入DC培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 4天后加入終濃度為15 30 μ g/ml的所述腹水腫瘤抗原繼續(xù)培養(yǎng)2 4天后，加入終濃度為200 lOOOng/ml的腫瘤壞死因子，得到負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞；DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備DC-CIK 將所述負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞與所述CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)，得到腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述腹水腫瘤抗原的制備的步驟中，所述腹水腫瘤細(xì)胞的獲取方法為取癌性腹水，用終含量為 5 15IU/ml的肝素鈉抗凝，將抗凝后的腹水與羥乙基淀粉按體積比為5 6 1的比例混合，2 8°C下靜置，沉降紅細(xì)胞，取上層液，進(jìn)行第一次離心，收集下層細(xì)胞，用PBS重懸所述細(xì)胞，洗滌、第二次離心，用PBS 二次重懸所述細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液，將所述細(xì)胞懸液加到人腫瘤細(xì)胞分離液的液面上，第三次離心，收集腹水腫瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述腹水腫瘤抗原的制備的步驟中，所述混合液中的亮抑蛋白酶抑制劑濃度為0. 5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述腹水腫瘤抗原的制備的步驟中，所述微孔濾膜過濾的孔徑為0. 15 0. 22 μ m0
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增的步驟中，所述抗胸腺細(xì)胞球蛋白的終濃度為lOOng/ml 200ng/ ml ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增的步驟中，所述重組人白細(xì)胞介素-1的終濃度為lng/ml，所述重組人白細(xì)胞介素-2的終濃度為1000IU/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增及DC細(xì)胞負(fù)載腹水腫瘤抗原的步驟中，所述DC培養(yǎng)液包含體積濃度為1 10%的所述臍帶血漿、80 120ng/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、25 30ng/ml的白細(xì)胞介素_4。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備DC-CIK的步驟中，所述DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞按1 10 3的比例進(jìn)行混合培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法，其特征在于，所述DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備DC-CIK的步驟中，所述DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)是在含有體積濃度為5%的所述臍帶血漿、1000IU/ml的重組人白細(xì)胞介素_2的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液GT-T551中進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法以及DC-CIK的應(yīng)用。該腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法包括的步驟有腹水腫瘤抗原的制備；臍帶血單個核細(xì)胞的制備；臍帶血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離；CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增；DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增及DC細(xì)胞負(fù)載腹水腫瘤抗原；DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備DC-CIK。本發(fā)明腹水腫瘤細(xì)胞致敏DC-CIK的制備方法制備的DC-CIK增殖活性和殺瘤活性高，其該方法工序簡單，條件易控，對設(shè)備要求低。
文檔編號C12N5/0783GK102321581SQ20111026923
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者劉韜 申請人:深圳市博泰生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司