專利名稱：從動物加工副產(chǎn)物中提取rna活性物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸技術(shù)領(lǐng)域，尤其是從動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物的方法。
背景技術(shù)：
核糖核酸(Ribonucleic acid)，簡稱RNA，無論是在醫(yī)藥、保健品、食品加工業(yè)，還是在植物生長和預(yù)防病蟲害方面都有非常廣泛的應(yīng)用前景，得到了歐美許多國家的高度重視。在肉食動物加工副產(chǎn)物，如胰臟、脾臟、淋巴、胎盤、胸腺、小腸、肝臟、腦等中存在RNA， 而隨著肉食動物加工副產(chǎn)物數(shù)量日益增多，除了少數(shù)被食用外，大多數(shù)被丟棄，這不僅浪費(fèi)了生物資源，還對生態(tài)環(huán)境造成了一定的污染。因此如何充分利用動物食品加工副產(chǎn)物制成高價值的RNA產(chǎn)品，同時減少環(huán)境污染是一項非常重要的研究工作，具有顯著的社會和經(jīng)濟(jì)意義。由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也很多樣。目前國內(nèi)外主要從微生物、動物中提取RNA。提取制備工藝主要有去污劑法、鹽酸胍法、稀堿法和濃鹽法等，以及申請人早先申請的ZL200310109446. X，“注射用人胎盤核糖核酸的制備方法”發(fā)明專利。只是工業(yè)上目前通常采用稀堿法和濃鹽法提取RNA，但用這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，不具有生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對不足，提出一種從動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物的方法，制得的 RNA具有較高的生物活性，以及含量更高。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種從動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物的方法，包括以下步驟①、配制下述試劑試劑A :0. lmol/1的醋酸鹽緩沖液中包含0. 4 0. 6wt %的十二烷基硫酸鈉、 0. 1 % 0. 3wt %的聚乙烯硫酸酯、0. 1 % 0. 3wt %乙二胺四乙酸二鈉，用醋酸調(diào)節(jié)其PH值至 5.0 ；試劑B 將0. Iwt %的8-羥基喹啉苯酚與試劑A等體積混合，振搖200 400次， 避光靜置8 14小時，取上層液體；試劑C 緩沖液飽和酚將0. Iwt %的8-羥基喹啉苯酚與試劑A等體積混合，振搖 200 400次，避光靜置8 14小時，取下層液體；②、取新鮮的動物加工副產(chǎn)物，于0 8°C下破碎；③、向步驟②破碎物中加入4 6倍重量的試劑B禾Π 4 6倍重量的試劑C，勻漿處理，離心取上清液加入0. 05 0. 30g/L蛋白酶，于30 50°C水浴30 50min ；冷卻至 0 10°C ；④、取步驟③冷卻液的上層，加乙醇醇沉，得產(chǎn)品。優(yōu)選的，步驟②破碎至原料尺寸為5 10 μ m。
優(yōu)選的，步驟③中蛋白酶為木瓜蛋白酶或中性蛋白酶。優(yōu)選的，該方法包括純化過程向步驟④產(chǎn)品中加入0. 3mol/L的醋酸鹽緩沖液， 攪拌，離心分離，取上清液；向上清液中加入2 3倍重的-10 -20°C的無水乙醇，保溫 1 2小時，離心分離，得沉淀物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用復(fù)合溶劑和酶法集成技術(shù)，從來動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物，得到的RNA的生物活性(增色效應(yīng))可達(dá)30%左右，RNA含量達(dá)到60mg/ ml左右。
具體實(shí)施例方式一種從動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物的方法，包括以下步驟①、配制下述試劑試劑A :0. lmol/1的醋酸鹽緩沖液中包含0. 4 0. 6wt %的十二烷基硫酸鈉、 0. 1 % 0. 3wt %的聚乙烯硫酸酯、0. 1 % 0. 3wt %乙二胺四乙酸二鈉，用醋酸調(diào)節(jié)其PH值至 5.0 ；試劑B 將0. Iwt %的8-羥基喹啉苯酚與試劑A等體積混合，振搖200 400次， 避光靜置8 14小時，取上層液體； 試劑C 緩沖液飽和酚將0. Iwt %的8-羥基喹啉苯酚與試劑A等體積混合，振搖 200 400次，避光靜置8 14小時，取下層液體；②、取新鮮的動物加工副產(chǎn)物，于0 8°C下破碎；③、向步驟②破碎物中加入4 6倍重量的試劑B和4 6倍重量的試劑C，勻漿處理，離心取上清液加入0. 05 0. 30g/L蛋白酶，于30 50°C水浴30 50min ；冷卻至 0 10°C ；④、取步驟③冷卻液的上層，加乙醇醇沉，得產(chǎn)品。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。實(shí)施例1以牛胰臟制備RNA活性物為例，其工藝優(yōu)化情況簡要介紹如下1)提取牛胰臟組織，經(jīng)5°C低溫細(xì)胞破碎處理至5 μ m,加入4倍重量的試劑B和6倍重量的試劑C，勻漿處理，離心取上清液加入0. 05g/L木瓜蛋白酶，于50°C水浴30min ；冷卻至 IO0C ；在30°C下將原料處理約30min，處理結(jié)束后冷卻分層，上層為核酸層，中間為蛋白層， 下層為溶劑層。2)分離純化方法、濃縮方法取上層核酸層，通過乙醇沉淀濃縮，除去乙醇得到半固體純品。加入0.3mol/L的醋酸鹽緩沖液，攪拌，離心分離，取上清液；向上清液中加入2倍重的-20°C的無水乙醇，保溫1小時，離心分離，得沉淀物。實(shí)施例2以牛胎盤制備RNA活性物為例，其工藝優(yōu)化情況簡要介紹如下1)提取
胎盤組織，經(jīng)0°C低溫細(xì)胞破碎至10 μ m后，加入6倍重量的試劑B和4倍重量的試劑C，勻漿處理，離心取上清液加入0. 30g/L中性蛋白酶，于30°C水浴50min ；冷卻至0°C ； 分層，上層為核酸層，中間為蛋白層，下層為溶劑層。2)分離純化方法、濃縮方法取上層核酸層，通過乙醇沉淀濃縮，除去乙醇得到半固體純品。加入0.3mol/L的醋酸鹽緩沖液，攪拌，離心分離，取上清液；向上清液中加入3倍重的-10°C的無水乙醇，保溫2小時，離心分離，得沉淀物。實(shí)施例3以豬肝臟制備RNA活性物為例，其工藝優(yōu)化情況簡要介紹如下1)提取肝臟組織，經(jīng)0°C低溫細(xì)胞破碎至10 μ m后，加入6倍重量的試劑B和4倍重量的試劑C，勻漿處理，離心取上清液加入0. 30g/L中性蛋白酶，于30°C水浴50min ；冷卻至0°C ； 分層，上層為核酸層，中間為蛋白層，下層為溶劑層。2)分離純化方法、濃縮方法取上層核酸層，通過乙醇沉淀濃縮，除去乙醇得到半固體純品。加入0.3mol/L的醋酸鹽緩沖液，攪拌，離心分離，取上清液；向上清液中加入2. 3倍重的-12°C的無水乙醇， 保溫1. 6小時，離心分離，得沉淀物。對上述實(shí)施例產(chǎn)品進(jìn)行檢測，其結(jié)果如下表1所示表IRNA活性物產(chǎn)品檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種從動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物的方法，包括以下步驟①、配制下述試劑試劑A :0. lmol/1的醋酸鹽緩沖液中包含0. 4 0. 6wt %的十二烷基硫酸鈉、0. 0. 3wt%的聚乙烯硫酸酯、0. 0. 3wt%乙二胺四乙酸二鈉，用醋酸調(diào)節(jié)其pH值至5. 0 ； 試劑B 將0. Iwt %的8-羥基喹啉苯酚與試劑A等體積混合，振搖200 400次，避光靜置8 14小時，取上層液體；試劑C 緩沖液飽和酚將0. Iwt %的8-羥基喹啉苯酚與試劑A等體積混合，振搖 200 400次，避光靜置8 14小時，取下層液體；②、取新鮮的動物加工副產(chǎn)物，于0 8°C下破碎；③、向步驟②破碎物中加入4 6倍重量的試劑B和4 6倍重量的試劑C，勻漿處理，離心取上清液加入0. 05 0. 30g/L蛋白酶，于30 50°C水浴30 50min ；冷卻至0 1O0C ；④、取步驟③冷卻液的上層，加乙醇醇沉，得產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟②破碎至原料尺寸為5 10μ m。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟③中蛋白酶為木瓜蛋白酶或中性蛋白酶。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法包括純化過程向步驟④產(chǎn)品中加入0. 3mol/L的醋酸鹽緩沖液，攪拌，離心分離，取上清液；向上清液中加入2 3倍重的-10 -20°C的無水乙醇，保溫1 2小時，離心分離，得沉淀物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物的方法，包括以下步驟①配制下述試劑；②取新鮮的動物加工副產(chǎn)物，于0～8℃下破碎；③向步驟②破碎物中加入4～6倍重量的試劑B和4～6倍重量的試劑C，勻漿處理，離心取上清液加入0.05～0.30g/L蛋白酶，于30～50℃水浴30～50min；冷卻至0～10℃；④取步驟③冷卻液的上層，加乙醇醇沉，得產(chǎn)品。本發(fā)明采用復(fù)合溶劑和酶法集成技術(shù)，從動物加工副產(chǎn)物中提取RNA活性物，得到的RNA的生物活性(增色效應(yīng))可達(dá)30％左右，RNA含量達(dá)到60mg/ml左右。
文檔編號C12N15/10GK102321614SQ201110268448
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者俞保彬, 劉顯東, 周天瓊, 周正兵 申請人:杭州華津藥業(yè)股份有限公司