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一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法及其所用的培養(yǎng)基的制作方法

文檔序號:528958閱讀:414來源:國知局
專利名稱:一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法及其所用的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法及其所用的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)
可利霉素(曾用名必特螺旋霉素,生技霉素Bitespiramycin)是利用基因重組技術(shù)獲得的基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物,將異戊?;D(zhuǎn)移酶基因(ist),硫鏈絲菌素抗性基因 (str)克隆至溫敏型鏈霉菌/大腸桿菌穿梭質(zhì)粒載體pKC1139 (阿普霉素抗性),而獲得基因工程菌WSJ-1。屬于一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。由于其在國內(nèi)外均為首創(chuàng),于2000年 11月獲得中國發(fā)明專利(專利號ZL97104440. 6)并在大量臨床前試驗研究基礎(chǔ)上,于2001 年7月獲得國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的“新藥臨床研究批件”。目前可利霉素在發(fā)酵罐上平均效價為1800U/mL左右,產(chǎn)量也較低。在可利霉素發(fā)酵后期,較高濃度的銨離子會抑制抗生素的生物合成。因為過量銨會抑制酰基CoA合成酶和?;っ?酰基磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性,降低胞內(nèi)可利用的短鏈脂肪酸,減弱這些前體的供體代謝,從而影響可利霉素的產(chǎn)物合成,進一步影響其產(chǎn)率及效價。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述的技術(shù)問題,而提供了一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法及其所用的培養(yǎng)基。本發(fā)明的技術(shù)原理
利用磷酸鎂可以捕捉銨離子的效應(yīng)。通過在發(fā)酵M小時在發(fā)酵液中補進磷酸鎂鹽,以降低發(fā)酵后期發(fā)酵液中銨離子的濃度,并逐步緩釋磷酸鎂中的磷促進可利霉素的合成,發(fā)酵液的最終平均生物效價提高到2100U/mL。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,包括如下步驟
(1)、菌種的選取
本發(fā)明所用的菌種WSJ-195甘油管為于2002年9月27日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,其保藏編號為CGMCC No. 0801 ;
(2)、培養(yǎng)基配制
①、斜面培養(yǎng)基(g/L)
葡萄糖10
淀粉20
黃豆餅粉10 NaCl 4 CaCO3 5 瓊脂 20
余量為去離子;0. 1 MPa, 121°C 滅菌 30 min 備用;
②、種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10 淀粉 30 黃豆餅粉 20 NaCl 4 CaCO3 5 ; 余量為去離子水;
0. 1 MPa, 121°C 滅菌 30 min 備用;
③、發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)
葡萄糖20淀粉40魚粉20玉米漿10NH4NO36CaCO35KH2PO40.MgSO4 · 7H202NaCl10
余量為自來水;
0. 1 Mpa, 121°C 滅菌 30min 備用;
④、發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基
按其與發(fā)酵液重量比計算即發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基按發(fā)酵液為0. 2^0.6:100 ;
所述的發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基為磷酸鎂;
(3)、斜面種子培養(yǎng)
將茄子瓶中加入40mL斜面培養(yǎng)基,0. 1 ΜΡει,121°C滅菌30 min,冷卻至室溫,用消毒好的移液器從保存的甘油管中取2mL液體菌絲,在斜面培養(yǎng)基上劃線接種,37°C培養(yǎng)13天,得斜面菌絲;
(4)、搖瓶種子培養(yǎng)
將步驟(3)所得的斜面菌絲,用消毒好的接種鏟lcm*2cm大小接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中,置于搖床,控制轉(zhuǎn)速220r / min,培養(yǎng)48h,得搖瓶種子;
(5)、發(fā)酵罐培養(yǎng)
按4%接種量將步驟(4)所得的搖瓶種子接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中,控制轉(zhuǎn)速為400r / min,溫度為自然pH培養(yǎng)至20 2他后,一次性在無菌狀態(tài)下加入補料培養(yǎng)基磷酸鎂,繼續(xù)控制轉(zhuǎn)速為40(Γ600ι· / min,溫度再培養(yǎng)7(T80h,發(fā)酵結(jié)束;
(6)、可利霉素的分離及純化
取步驟(5)所得的發(fā)酵液,用聚合氯化鋁凝絮發(fā)酵液中的蛋白質(zhì),以降低發(fā)酵液粘度,然后用板框過濾,將所得濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到8. 5-9. 0,然后用丁酯萃萃取所用的丁酯量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算,即每10000U可利霉素添加ImL 丁酯萃??;
萃取所得的酯相依次經(jīng)蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液依次洗滌后,再加入濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,其加入量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算, 即每20000U可利霉素添加ImL濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH到 2. 0-2. 5,將產(chǎn)物反相萃取到水相中;
洗滌所用的蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液的量按體積計算分別為所用丁酯體積量的1/4 ;
(7)、可利霉素的干燥
將步驟(6)所得的水相,用2M氫氧化鈉調(diào)pH到4. 5-5. 0進行中和,然后通入空氣吹掉水相中殘留的丁酯,丁酯吹干凈的判斷標準為通入氣體可將水相吹出大量泡泡, 然后用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8. 5-9. 0得到結(jié)晶液,結(jié)晶液抽濾后得到濕品,50_55°C真空干燥即得到可利霉素。
本發(fā)明的技術(shù)效果
本發(fā)明的一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,由于利用發(fā)酵過程M小時時一次性添加的補料培養(yǎng)基磷酸鎂,利用其化學螯合作用捕捉發(fā)酵液中銨離子,解除了發(fā)酵過程中過量銨對?;鵆oA合成酶和?;っ??;姿徂D(zhuǎn)移酶的活性的抑制,從而促進了胞內(nèi)可利用的短鏈脂肪酸的合成,從而有利于可利霉素的合成,使得發(fā)酵后最終可利霉素的發(fā)酵液的生物效價達到2100U/mL,相對提高了 16. 7%。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進-本發(fā)明檢測所用主要的儀器雙層培養(yǎng)搖床SPTOO
溫控微孔板培養(yǎng)搖床SCS-M PH計
DMQ立式滅菌鍋臺式離心機 TDL80-2B 水平層流潔凈工作臺SA-1480-2 電子天平 BS-1500L 型智能生化培養(yǎng)箱SHX 酶標儀 MK3 發(fā)酵罐 FUS-15L (A) 本發(fā)明所使用主要試劑原料黃豆粉魚粉豆油
硝酸銨(分析純) 磷酸鎂(分析純)
-步闡釋,但并不限制本發(fā)明。
上海市離心機械研究所
上海市離心機械研究所上海精密儀器儀表公司山東新療器械股份有限公司上海安亭科學儀器廠上海上凈凈化設(shè)備有限公司上海友聲衡器有限公司上海華連醫(yī)療器械有限公司奧賽飛世爾(上海)儀器有限公司上海國強生化公司
沈陽抗生素廠浙江正大魚粉沈陽抗生素廠上海統(tǒng)亞化工科技發(fā)展有限公司上海新寶精細化工廠磷酸二氫鉀(分析純)上海凌峰化學試劑有限公司氯化鈉(分析純)上海凌峰化學試劑有限公司硫酸鎂(分析純)上海凌峰化學試劑有限公司碳酸鈣同聯(lián)集團生產(chǎn)用蛋白胨(生化試劑)上海中洋海洋生物工程有限公司葡萄糖(分析純)中國惠興生化試劑有限公司酵母粉安琪酵母股份有限公司蛋白聚胨日本制藥株式會社牛肉膏(生化試劑)北京奧特里生物技術(shù)責任有限公司瓊脂(生化試劑)中國惠興生化試劑有限公司乙酸乙酯(分析純)上海凌峰化學試劑有限公司甲醇(分析純)上海振興化工一廠鹽酸(分析純)上海凌峰化學試劑有限公司氫氧化鈉(分析純)上海凌峰化學試劑有限公司碘化鉀(分析純)國藥集團化學試劑有限公司硫酸銅(分析純)上海凌峰化學試劑有限公司酒石酸鉀鈉(分析純)國藥集團化學試劑有限公司甲醛(分析純)宜興市亞茂化工原料廠甲基紅(分析純)中國遠航試劑廠酚酞(指示劑)中國醫(yī)藥(集團)上?;瘜W試劑公司硫酸(分析純)國藥集團化學試劑有限公司可溶性淀粉國藥集團化學試劑有限公司。 本發(fā)明的可利霉素的效價測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明所得的可利霉素發(fā)酵液的生物效價的測定方法,采用比濁法,其測定的具體步驟如下
(1)、檢測用枯草芽孢桿菌(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏,其保藏編號為 CICC 22946)的菌懸液制備
茄瓶斜面37°C培養(yǎng)7天,革蘭氏染色芽孢率為85 %以上后,50mL無菌水洗下,65°C水浴,殺死營養(yǎng)體,置于4°C的冰箱保存; 茄瓶所用的斜面培養(yǎng)基(g/L) 牛肉膏1.5
蛋白胨6
葡萄糖2
酵母膏6
瓊脂..................20
余量為去離子水;
(2)、將本發(fā)明所得的發(fā)酵液稀釋100倍后得稀釋后的發(fā)酵液;
(3)、取步驟(2)稀釋后的發(fā)酵液30μ 接入到270μ 的液體培養(yǎng)基中37°C,220r/ min 在孔板搖床上培養(yǎng)4小時,然后在0D600下測定液體培養(yǎng)基的吸光值,計算生物效價;上述所用的液體培養(yǎng)基(g/L)
牛肉膏1.5
蛋白胨6
葡萄糖2
酵母膏6
余量為去離子水;
消前用2M氫氧化鈉調(diào)pH 8. 5,0. 1 MPa,即121°C滅菌30min備用; 所述的生物效價的計算方法如下
y=59. 88*C*10_X,其中,Y為可利霉素的發(fā)酵液的生物效價,單位U/mL ;C為稀釋倍數(shù), 本發(fā)明為100 ;X為0D600下測定的吸光值。
實施例1
一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,包括如下步驟
(1)、實驗用菌種WSJ-195甘油管;
(2)、配置斜面培養(yǎng)基500mL,搖瓶種子培養(yǎng)基lOOOmL,發(fā)酵罐培養(yǎng)基10L,培養(yǎng)基成分配制如下
①、斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10淀粉20黃豆餅粉10NaCl4CaCO35瓊脂20余量為去離子;0. 1 MPajp 121°C 滅菌 30 min②、種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10淀粉30黃豆餅粉20NaCl4CaCO35 ;余量為去離子水 0. IMPa,即 121°C,滅菌 30min ③、發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20淀粉40魚粉20玉米漿10NH4NO36CaCO,5KH2PO40. 5
MgSO4 · 7H202
NaCl10
余量為自來水;
在發(fā)酵罐中121°C滅菌30min備用; ④、發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基
按其與發(fā)酵液重量比計算即發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基發(fā)酵液為0. 2 100 ; 所述的發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基為磷酸鎂,稱取磷酸鎂20克,0. 1 MPa,即121°C滅菌30min備用;
(3)、斜面種子培養(yǎng)
將茄子瓶中加入40 mL斜面培養(yǎng)基,0. 1 MPaJP 121°C滅菌30 min,冷卻至室溫。保存的菌株為甘油管,用消毒好的移液器從保存的甘油管中取2mL液體菌絲,在斜面培養(yǎng)基上劃線接種,37°C培養(yǎng)13天,得斜面菌絲;
(4)、將步驟(3)所得的斜面菌絲,用消毒好的接種鏟將lcm*2cm大小菌絲塊接種裝有 50mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中,共10瓶,置于搖床上,控制轉(zhuǎn)速為220r / min,溫度為
培養(yǎng)48h,得搖瓶種子;
(5)、發(fā)酵罐培養(yǎng)
按4%接種量將步驟(4)所得的搖瓶種子400mL接種于裝有IOL發(fā)酵培養(yǎng)基的15L自動發(fā)酵罐中,控制轉(zhuǎn)速為400r / min,溫度為自然pH培養(yǎng)至24h后,一次性在無菌狀態(tài)下加入補料培養(yǎng)基磷酸鎂20克,繼續(xù)控制轉(zhuǎn)速為400r / min,溫度再培養(yǎng)72h,發(fā)酵結(jié)束;
(6)、產(chǎn)物的分離及純化
取步驟(5)所得的發(fā)酵液,用聚合氯化鋁凝絮發(fā)酵液中的蛋白質(zhì),以降低發(fā)酵液粘度, 然后用板框過濾,將所得濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到8. 5-9. 0,然后用丁酯萃??;
萃取所用的丁酯量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算,即每10000U可利霉素添加ImL 丁酯萃?。?br> 萃取所得的酯相依次經(jīng)蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液依次洗滌后,再加入濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,其加入量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算, 即每20000U可利霉素添加ImL濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH到 2. 0-2. 5,將產(chǎn)物反相萃取到水相中;
洗滌所用的蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液的量按體積計算分別為所用丁酯體積量的1/4 ;
(7)、可利霉素的干燥
將步驟(6)所得的水相,用2M氫氧化鈉調(diào)pH到4. 5-5. 0進行中和,然后通入空氣吹掉水相中殘留的丁酯,丁酯吹干凈的判斷標準為通入氣體可將水相吹出大量泡泡,然后用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8. 5-9. 0得到結(jié)晶液,結(jié)晶液抽濾后得到濕品,50-55°C真空干燥即得到可利霉素。 取步驟(5)所得的發(fā)酵液進行生物效價測定,最終所得的可利霉素的發(fā)酵液的生物效價為2100U/mL。
對比實施例1
發(fā)酵過程不加入補料培養(yǎng)基的一種可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,包括如下步驟
(1)、實驗用菌種為WSJ-195甘油管;
(2)、配置斜面培養(yǎng)基500mL,搖瓶種子培養(yǎng)基lOOOmL,發(fā)酵罐培養(yǎng)基10L,培養(yǎng)基成分配制如下
①、斜面培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10 淀粉 20 黃豆餅粉 10 NaCl 4 CaCO3 5 瓊脂 20 余量為去離子;
0. 1 MPa,即 121 滅菌 30 min 備用;
②、種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10 淀粉 30 黃豆餅粉 20 NaCl 4 CaCO3 5 ; 余量為去離子水;
0. 1 MPa,即 121°C 滅菌 30 min 備用;
③、發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20 淀粉 40 魚粉 20 玉米漿 10 NH4NO3 6 CaCO3 5 KH2PO4 0. 5 MgSO4 · 7H20 2 NaCl 10 余量為自來水;
在發(fā)酵罐中消毒備用。(3)、斜面種子培養(yǎng)
將茄子瓶中加入40mL斜面培養(yǎng)基,0. 1 MPa,即121°C滅菌30 min,冷卻至室溫,用消毒好的移液器從保存的甘油管中取2mL液體菌絲,在斜面培養(yǎng)基上劃線接種,37°C培養(yǎng)13天, 得斜面菌絲;
(4)、將步驟(3)所得的斜面菌絲,用消毒好的接種鏟將lcm*2cm大小菌絲塊接種裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中,共10瓶,置于搖床上控制轉(zhuǎn)速為220r / min,溫度為培養(yǎng)48h,得搖瓶種子;
(5)、發(fā)酵罐培養(yǎng)
按4%接種量將步驟(4)所得的搖瓶種子400mL接種于裝有IOL發(fā)酵培養(yǎng)基的15L自動發(fā)酵罐中,控制轉(zhuǎn)速為400r / min,溫度為自然pH培養(yǎng)96h,發(fā)酵結(jié)束;
(6)、產(chǎn)物的分離及純化
取步驟(5)所得的發(fā)酵液,用聚合氯化鋁凝絮發(fā)酵液中的蛋白質(zhì),以降低發(fā)酵液粘度, 然后用板框過濾,將所得濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到8. 5-9. 0,然后用丁酯萃??;
萃取所用的丁酯量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算,即每10000U可利霉素添加ImL 丁酯萃取;
萃取所得的酯相依次經(jīng)蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液依次洗滌后,再加入濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,其加入量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價計算, 即每20000U可利霉素添加ImL濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH到 2. 0-2. 5,將產(chǎn)物反相萃取到水相中;
洗滌所用的蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液的量按體積計算分別為所用丁酯體積量的1/4 ;
(7)、可利霉素的干燥
將步驟(6)所得的水相,用2M氫氧化鈉調(diào)pH到4. 5-5. 0進行中和,然后通入空氣吹掉水相中殘留的丁酯,丁酯吹干凈的判斷標準為通入氣體可將水相吹出大量泡泡,然后用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8. 5-9. 0得到結(jié)晶液,結(jié)晶液抽濾后得到濕品,50-55°C真空干燥即得到可利霉素。取步驟(5)所得的發(fā)酵液進行生物效價測定,最終所得的可利霉素的發(fā)酵液的生物效價為1806U/mL。實施例2
一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,包括如下步驟
(1)、實驗用菌種為WSJ-195甘油管;
(2)、配置斜面培養(yǎng)基500mL,搖瓶種子培養(yǎng)基IOOOmL,發(fā)酵罐培養(yǎng)基10L,培養(yǎng)基成分配制如下
①、斜面培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10 淀粉 20 黃豆餅粉 10 NaCl 4 CaCO3 5 瓊脂 20 余量為去離子;
0. 1 MPa (121 °C )滅菌 30 min 備用;
②、種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10淀粉30黃豆餅粉20NaCl4CaCO35 ;余量為去離子水 0. IMPa,即 121°C 滅菌 30min③、發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20淀粉40魚粉20玉米漿10NH4NO36CaCO35KH2PO40. 5MgSO4 · 7H202NaCl10余量為自來水;在發(fā)酵罐中消毒備用;
④、發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基
按其與發(fā)酵液重量比計算即發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基發(fā)酵液為0. 6100;
所述的發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基為磷酸鎂,稱取磷酸鎂60克,0. 1 MPadP 121°C滅菌30min備用;
(3)、斜面種子培養(yǎng)
將茄子瓶中加入40 mL斜面培養(yǎng)基,0. IMPa,即121°C滅菌30 min,冷卻至室溫,用消毒好的移液器從保存的甘油管中取2mL液體菌絲,在斜面培養(yǎng)基上劃線接種,37°C培養(yǎng)13天, 得斜面菌絲;
(4)、將步驟(3)所得的斜面菌絲,用消毒好的接種鏟將lcm*2cm大小菌絲塊接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中,共10瓶,置于搖床上控制轉(zhuǎn)速為220r / min,溫度為
培養(yǎng)48h,得搖瓶種子;
(5)、發(fā)酵罐培養(yǎng)
按4%接種量將步驟(4)所得的搖瓶種子400mL接種于裝有10 L發(fā)酵培養(yǎng)基的15L自動發(fā)酵罐中,控制轉(zhuǎn)速為600r / min,溫度為自然pH培養(yǎng)至2 后,一次性在無菌狀態(tài)下加入補料培養(yǎng)基磷酸鎂60克,繼續(xù)控制轉(zhuǎn)速為600r / min,溫度為再培養(yǎng)70h,發(fā)酵結(jié)束;
(6)、產(chǎn)物的分離及純化
取步驟(5)所得的發(fā)酵液,用聚合氯化鋁凝絮發(fā)酵液中的蛋白質(zhì),以降低發(fā)酵液粘度, 然后用板框過濾,將所得濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到8. 5-9. 0,然后用丁酯萃?。?br> 萃取所用的丁酯量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算,即每10000U可利霉素添加ImL 丁酯萃??;萃取所得的酯相依次經(jīng)蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液依次洗滌后,再加入濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,其加入量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算, 即每20000U可利霉素添加ImL濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH到 2. 0-2. 5,將產(chǎn)物反相萃取到水相中;
洗滌所用的蒸餾水、0. 5%磷酸二氫鈉水溶液的量按體積計算分別為所用丁酯體積量的
1/4 ;
(7)、可利霉素的干燥
將步驟(6)所得的水相,用2M氫氧化鈉調(diào)pH到4. 5-5. 0進行中和,然后通入空氣吹掉水相中殘留的丁酯,丁酯吹干凈的判斷標準為通入氣體可將水相吹出大量泡泡,然后用2M 氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH到8. 5-9. 0得到結(jié)晶液,結(jié)晶液抽濾后得到濕品,50-55°C真空干燥即得到
可利霉素。取步驟(5)所得的發(fā)酵液進行生物效價測定,最終所得的可利霉素的發(fā)酵液生物效價為2160U/mL。通過上述的實施例1、對比實施例1和實施例2可以看出。在對比實施例1不加入補料培養(yǎng)基磷酸鎂,可利霉素的發(fā)酵液的生物效價只有1806U/mL。而在實施例1中,由于在發(fā)酵M小時添加0.洲濃度磷酸鎂的方法,可利霉素的發(fā)酵液的生物效價提高到2100U/ mL。在實施例2中,由于在發(fā)酵M小時添加0. 6%濃度磷酸鎂的方法,可利霉素的發(fā)酵液的生物效價提高到2160 U/mL。由此表明本發(fā)明在發(fā)酵至2016小時,一次性添加0. 2%-0. 6% 的磷酸鎂可以有效的提高可利霉素的發(fā)酵液的生物效價,增加產(chǎn)量。以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明,而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所做的任何等效變換,均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種高效價可利霉素發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基,包括斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于還包括發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基;所述的發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基按其與發(fā)酵培養(yǎng)基重量比計算即補料培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基為0. 2^0.6 100 ;所述的發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基為磷酸鎂。
2.如權(quán)利要求1所述的一種高效價可利霉素發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基,其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基(g/L)如下葡萄糖10.0淀粉20.0黃豆餅粉10.0NaCl4CaCO35瓊脂20余量為去離子水 所述的種子培養(yǎng)基(g/L)如下葡萄糖10淀粉30黃豆餅粉20NaCl4CaCO35 ;余量為去離子水 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)如下葡萄糖20淀粉40魚粉20玉米漿10NH4NO36CaCO35KH2PO40. 5MgSO4 · 7H202NaCl10余量為自來水。
3.如權(quán)利要求2所述的一種高效價可利霉素發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基,其特征在于所用的補料培養(yǎng)基按其與發(fā)酵培養(yǎng)基重量比計算即補料培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基為0. 2:100。
4.如權(quán)利要求2所述的一種高效價可利霉素發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基,其特征在于所用的補料培養(yǎng)基按其與發(fā)酵培養(yǎng)基重量比計算即補料培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基為0. 6 :100。
5.一種利用如權(quán)利要求1、2、3或4任一權(quán)利要求所述的一種高效價可利霉素發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基進行高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于包括如下步驟(1)、菌種的選取本發(fā)明所用的菌種WSJ-195甘油管為于2002年9月27日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,其保藏編號為CGMCC No. 0801 ;(2)、培養(yǎng)基配制①、斜面培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10 淀粉 20 黃豆餅粉 10 NaCl 4 CaCO3 5 瓊脂 20 余量為去離子;0. 1 MPa,即 121°C 滅菌 30min 備用;②、種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10 淀粉 30 黃豆餅粉 20 NaCl 4 CaCO3 5 ; 余量為去離子水;0. IMPa,即 121°C 滅菌 30min 備用;③、發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20 淀粉 40 魚粉 20 玉米漿 10 NH4NO3 6 CaCO3 5 KH2PO4 0. 5 MgSO4 · 7H20 2 NaCl 10 余量為自來水;0. IMpa,即 121°C滅菌 30min 備用;④、發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基按其與發(fā)酵液重量比計算即發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基發(fā)酵液為0. 2^0. 6100; 所述的發(fā)酵過程所用的補料培養(yǎng)基為磷酸鎂;(3)、斜面種子培養(yǎng)往茄子瓶中裝入40mL斜面培養(yǎng)基,0. 1 MPa,即121°C滅菌30 min,冷卻至室溫,用消毒好的移液器從保存的菌種WSJ-195甘油管中取2mL液體菌絲,在斜面培養(yǎng)基上劃線接種, 37°C培養(yǎng)13天得斜面菌絲;(4)、搖瓶種子培養(yǎng)將步驟(3)所得的斜面菌絲,用消毒好的接種鏟取lcm*2cm大小接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中,置于搖床上控制轉(zhuǎn)速為220r / min,溫度為培養(yǎng)4 得到搖瓶種子;(5)、發(fā)酵罐培養(yǎng)按4%接種量將步驟(4)所得的搖瓶種子接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,控制轉(zhuǎn)速為40(T600r / min,溫度為28 V自然pH培養(yǎng)至20 2他后,一次性在無菌狀態(tài)下加入補料培養(yǎng)基磷酸鎂,繼續(xù)控制轉(zhuǎn)速為40(T600r / min,溫度為再培養(yǎng)7(T80h,發(fā)酵結(jié)束;(6)、可利霉素的分離及純化取步驟(5)所得的發(fā)酵液,用聚合氯化鋁凝絮發(fā)酵液中的蛋白質(zhì),以降低發(fā)酵液粘度, 然后用板框過濾,將所得濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到8. 5-9. 0,然后用丁酯萃??;萃取所得的酯相依次經(jīng)蒸餾水、濃度為0. 5%的磷酸二氫鈉水溶液依次洗滌后,再加入濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液,然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH到2. 0-2. 5,將產(chǎn)物反相萃取到水相中;(7)、可利霉素的干燥將步驟(6)所得的水相,用2M氫氧化鈉調(diào)pH到4. 5-5. 0進行中和后通入空氣吹掉水相中殘留的丁酯,然后用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8. 5-9. 0得到結(jié)晶液,結(jié)晶液抽濾后得到濕品,50-55°C真空干燥即得到可利霉素。
6.如權(quán)利要求5所述的一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于步驟(5) 中所述的搖瓶種子接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,控制轉(zhuǎn)速為400r / min,溫度為自然pH培養(yǎng)至24h后,一次性在無菌狀態(tài)下加入補料培養(yǎng)基磷酸鎂,繼續(xù)控制轉(zhuǎn)速為 400r / min,溫度為再培養(yǎng)70h,發(fā)酵結(jié)束。
7.如權(quán)利要求5所述的一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于步驟(5) 中所述的搖瓶種子接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,控制轉(zhuǎn)速為600r / min,溫度為 28°C自然pH培養(yǎng)至2 后,一次性在無菌狀態(tài)下加入補料培養(yǎng)基磷酸鎂,繼續(xù)控制轉(zhuǎn)速為 600r / min,溫度為再培養(yǎng)100h,發(fā)酵結(jié)束。
8.如權(quán)利要求5所述的一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于步驟(6)中萃取所用的丁酯量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算,即每10000U可利霉素添加ImL 丁酯;萃取所得的酯相的洗滌所用的蒸餾水、濃度為0. 5%磷酸二氫鈉水溶液的量按體積計算分別為所用丁酯體積量的1/4 ;酯相洗滌后加入的濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液的量按所取的發(fā)酵液中含可利霉素總效價換算,即每20000U可利霉素添加ImL濃度為0. 7%的磷酸二氫鈉水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效價可利霉素的發(fā)酵生產(chǎn)方法及其所用的培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)基包括斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵過程補料培養(yǎng)基磷酸鎂。所述的發(fā)酵生產(chǎn)方法,包括菌種的選取、培養(yǎng)基配制、斜面種子培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)、產(chǎn)物的分離及純化和產(chǎn)物的干燥等7個步驟,所得的可利霉素發(fā)酵液的平均生物效價為2100U/mL,相對提高了16.7%。
文檔編號C12P19/62GK102329839SQ20111026502
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者劉新星, 李彩玉, 李志生, 武桂華, 郝玉有 申請人:上海同聯(lián)醫(yī)藥技術(shù)有限公司
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