專利名稱：一種公牛凍精基因組dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組DNA的提取方法，具體地說，涉及一種公牛凍精基因組DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
荷斯坦奶牛是為人類提供乳品的重要家畜品種，隨著人們對(duì)奶制品質(zhì)量要求的更新和提高，為滿足市場(chǎng)需求，需要對(duì)奶牛選育及提高奶牛群體產(chǎn)奶性能。遺傳育種與人工授精技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，使優(yōu)良公牛的精液被用于制作大量?jī)鼍?細(xì)管凍精或顆粒凍精)，便于其優(yōu)良遺傳性能的傳播，提高群體性能。隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，從分子生物學(xué)角度進(jìn)行荷斯坦奶牛的選育和提高性能，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。相對(duì)于血樣和耳組織樣品等，凍精數(shù)量多，容易獲得和保存，是種用公牛最常見的實(shí)驗(yàn)材料。DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象。為了對(duì)其進(jìn)行測(cè)序、雜交和基因的表達(dá)的研究，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的?；蚪MDNA提取的主要包含兩方面操作一是細(xì)胞裂解和DNA釋放，二是DNA的純化。這兩方面決定著基因組提取產(chǎn)物的產(chǎn)率、完整性和純化度。目前市場(chǎng)上存在著動(dòng)物不同組織基因組提取試劑盒，最常見的是血液基因組DNA提取的相關(guān)產(chǎn)品，采用創(chuàng)新的裂解液成分和純化方式，給血液樣品基因組的提取帶來了便利。而相對(duì)于凍精，卻鮮見商品化的試劑盒。其基因組提取最常見的方法是利用加入β -巰基乙醇的蛋白消化液消化精子，釋放DNA后利用酚/氯仿的有機(jī)溶劑抽提法純化產(chǎn)物(薩姆布魯克J，拉塞爾D. W.分子克隆指南[Μ]北京，科學(xué)出版社，2002)。這種方法在實(shí)際應(yīng)用中存在以下問題提取時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，產(chǎn)物中殘留的有機(jī)溶劑影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，凍精消化難度大，給實(shí)驗(yàn)室批量提取高質(zhì)高量的凍精基因組DNA帶來困難。哺乳動(dòng)物精子DNA是遺傳信息的載體，對(duì)繁衍后代具有重要意義，這一特殊使命要求精子的染色質(zhì)具有特殊結(jié)構(gòu)。與其他細(xì)胞不同，精子的染色質(zhì)形成經(jīng)過了加倍濃縮與組裝(蔣歡歡綜述，曹云霞，賀小進(jìn)審校.精子染色質(zhì)完整性檢測(cè)與輔助生殖技術(shù).國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2011，1，30 (1) 58-62 ；鄒喻蘋，汪小全，雷一丁，裴顏龍，張志憲.幾種瀕危植物及其近緣類群總DNA的提取與鑒定3，植物學(xué)報(bào)，1994，36 (7) :528_533)。 哺乳動(dòng)物精子的發(fā)生可分為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞三個(gè)階段。在精子細(xì)胞階段，核內(nèi)與DNA結(jié)合的組蛋白(Hl、H2a、H2b、H3、H4)逐步被精蛋白取代，這個(gè)過程稱為組蛋白-精蛋白取代反應(yīng)(histone-to-protamine replacement reaction, HPRR),(吳小芳，陳暉， 陳松，曹堅(jiān)，費(fèi)仁仁.人與大小鼠精子中精蛋白mRNA的分析，生殖與避孕，2001，08，21(4) 200-206)。精蛋白是一種低分子量堿性蛋白(分子量為4000-7000)含有27-65個(gè)氨基酸殘基，富含精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)(趙向東綜述，黃宇烽審校，精核蛋白的研究進(jìn)展， Journal of Andrology，1998，11，4 :38_41)。精子DNA圍繞精蛋白形成染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)，而后精蛋白分子內(nèi)外巰基進(jìn)一步氧化形成的二硫鍵廣泛交聯(lián)，從而使染色體逐漸濃縮，更加穩(wěn)定。成熟精子核這一致密化現(xiàn)象對(duì)保護(hù)精子基因組在精子面臨外界應(yīng)激時(shí)保持完整性具有重要作用，能夠保證遺傳物質(zhì)完整的傳遞到后代中(蔣歡歡綜述，曹云霞，賀小進(jìn)審校，精子染色質(zhì)完整性檢測(cè)與輔助生殖技術(shù)，國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2011，1，30(1) 58-62)。正是因?yàn)槌墒炀蛹?xì)胞的這種致密特性造成精子相對(duì)于其它組織細(xì)胞的染色體更加致密，基因組DNA不容易與精蛋白脫離。使得精子DNA在消化中釋放困難，產(chǎn)率低。另外， 凍精中出于對(duì)精細(xì)胞稀釋、營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)需要而添加的稀釋保護(hù)劑，其所含有的糖類、脂類和蛋白等成分也給細(xì)胞的消化和基因組的純化帶來障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種公牛凍精基因組DNA的提取方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種公牛凍精基因組DNA的提取方法，包括精子細(xì)胞的清洗、精子的裂解消化以及DNA的純化步驟，其中，精子的裂解和消化步驟為向清洗后的精子細(xì)胞沉淀中加入凍精原液2 3倍體積的精子細(xì)胞裂解液和20W/V% SDS (使體系中SDS的終濃度達(dá)到3% 5%，W/v)，靜置后渦旋混勻，然后向混合體系中加入蛋白酶K (使體系中蛋白酶K濃度達(dá)到0. 4mg/mL)，混勻， 過夜消化；其中，所述精子細(xì)胞裂解液的配方為pH值8. 0 WEDTAO. 01-0. 0125mol/L，pH值 8.0 的 Tris .Cl 0. 01-0. 0125mol/L, SDSl% -1. 25%,NaCl 2. 9-3. 625g/L，DTT 9.6-19. / L,以蒸餾水配制。優(yōu)選地，所述精子細(xì)胞裂解液的配方為pH值8. 0的EDTA 0. 0125mol/L, pH 值 8. 0 的 Tris · Cl 0. 0125mol/L, SDS 1. 25%, NaCl 3. 625g/L，DTT9. 625g/L，以蒸溜水配制?；蚪MDNA的純化步驟為向上述消化體系中加入該消化體系總體積0. 4 0. 6 倍的飽和食鹽水，混勻后靜置5-lOmin，離心，轉(zhuǎn)移上清，并用無水乙醇沉淀上清液，離心后， 洗滌沉淀，最后于4°C將沉淀過夜溶解于TB貯液(購自天根生化科技(北京)有限公司) 或ddH20中，-20°C保存。優(yōu)選地，前述方法中精子的裂解和消化步驟為向清洗后的精子細(xì)胞沉淀中加入凍精原液2倍體積的精子細(xì)胞裂解液和凍精原液0. 5倍體積的20W/v% SDS,靜置后渦旋混勻，然后向混合體系中加入蛋白酶K，混勻，過夜消化。優(yōu)選地，前述方法中基因組DNA的純化步驟中是向精子細(xì)胞的消化體系中加入該消化體系總體積0. 6倍的飽和食鹽水。前述方法中，所述公牛精子的清洗步驟為將管制凍精置于離心管中，加入生理鹽水，渦旋混勻，離心，得沉淀。前述方法中，所述的公牛凍精為荷斯坦公牛凍精。本發(fā)明還提供公牛凍精基因組DNA提取試劑盒，其包括試齊[JI :pH 值 8. 0 的 EDTA 0. 0 1-0. 0125mol/L, pH 值 8. 0 的 Tris 'C10. 01-0. 0125mol/L, SDS 1% -1. 25%, NaCl 2. 9-3. 625g/L, DTT9. 6-19. 3g/L,以蒸餾水配制；以及試劑II 飽和食鹽水。前述試劑盒還包括試劑III 生理鹽水；試劑IV 20% SDS ；以及試劑V 蛋白酶 K0優(yōu)選地，所述試劑盒包括試劑I :pH 值 8. 0 的 EDTA 0. 0125mol/L, pH 值 8. 0 的 Tris · CIO. 0125mol/L, SDS 1. 25%, NaCl 3. 625g/L，DTT 9. 625g/L，以蒸餾水配制；
試劑II:飽和食鹽水；試劑III:生理鹽水；試劑IV :20w/v% SDS ；以及試劑V:蛋白酶K。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述試劑盒在提取荷斯坦公牛凍精基因組DNA中的應(yīng)用?；诠鼍蚪MDNA提取中存在的一些關(guān)鍵問題，本發(fā)明人有針對(duì)性的改進(jìn)消化裂解液成分和配比，確定適宜的消化時(shí)間，提高公牛精子DNA的消化產(chǎn)率；同時(shí)摒棄原有的有機(jī)溶劑抽提的純化方法，采用比較簡(jiǎn)單的高鹽法進(jìn)行DNA純化，使用的試劑易于配制，成本低，能有效去除雜質(zhì)，獲得產(chǎn)率高、質(zhì)量好的凍精基因組。本發(fā)明試劑盒使用簡(jiǎn)便、 快速、涉及的有毒物質(zhì)少，提取出的DNA量多、純度高，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的需要?？蓮V泛用于凍精基因組DNA的高效和批量獲取。


圖1為荷斯坦公牛凍精基因組DNA提取電泳檢測(cè)結(jié)果，其中M為DNA marker (7000、5500、3500、2000、1000、500bp)，1-44 代表 44 個(gè)樣品。圖2為荷斯坦公牛凍精基因組DNA GHR基因目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M為DNA marker (600、500、400、300、200、IOObp)，1-44 代表 44 個(gè)樣品。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段， 所用原料均為市售商品。除另有說明，實(shí)施例中的溶液配制均在20°C下進(jìn)行。實(shí)施例1荷斯坦公牛凍精基因組DNA的提取1材料和試劑生理鹽水(0. 9% )稱取0. 9克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100毫升。
高壓滅菌備用。精子細(xì)胞裂解和消化試劑(1)精子細(xì)胞裂解液滅菌蒸餾水 60mL，加入 0. 5mo 1/LEDTA (pH = 8. 0) 2mL, Imo 1/ L Tris · Cl (pH = 8.0) ImL 和 10% SDS IOmL, 0. 29g NaCl，0.77g DTT (對(duì)于難消化樣品可以加倍添加DTT)，混勻后加水定容到80mL。配制的混合液常溫保存，使用時(shí)間不能超過一周。0. 5mol/L EDTA :80mL蒸餾水中加入18. 61g 二水乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA-Na · 2H20)，混勻后用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8. 0 (約20gNa0H顆粒)，然后加水定容至IOOmL,分裝后高壓滅菌備用。lmol/L Tris · Cl :800mL蒸餾水中加入121. Ig Tris堿，用鹽酸調(diào)溶液pH值至 8. 0 (溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定pH值)，然后加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。當(dāng)溶液變?yōu)辄S色時(shí)，應(yīng)予丟棄。10% SDS :900mL蒸餾水中加入IOOg SDS，加熱至68°C用磁力攪拌器攪拌助溶，混勻后用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 2，加水定容至1L。室溫保存，無需滅菌。
(2)精子細(xì)胞消化液400 μ L精子細(xì)胞裂解液，100 μ L 20% SDS，10 μ L蛋白酶K。20%的SDS :900mL蒸餾水中加入200g SDS，加熱至68°C用磁力攪拌器攪拌助溶， 混勻后用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 2，加水定容至1L。室溫保存，無需滅菌。如發(fā)現(xiàn)溶液凝固，說明室溫低，加熱溶解后再用。蛋白酶K(20 mg/mL)天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)RT403-01。DNA純化試劑飽和食鹽水20°C時(shí)，飽和氯化鈉濃度為26. 47%，即在IOOmL水中溶解36克氯化鈉，適量補(bǔ)加氯化鈉，混勻靜置10-20min后仍有固體未溶，所得上清即為飽和食鹽水。75%乙醇取3體積無水乙醇和1體積蒸餾水，混勻備用。瓊脂糖水平電泳檢測(cè)試劑50XTAE =Tris 堿 242g、冰乙酸 57. ImL,0. 5mol/L EDTA(pH = 8. 0) lOOmL，加水充
分溶解，定容至1L。溴化乙啶(EB)貯存液(電泳上樣時(shí)使用)lg溴化乙啶溶于IOOmL蒸餾水中。電泳使用的瓊脂糖凝膠用50 X TAE液配制。瓊脂糖干粉購自北京東勝泰博科技公司。2荷斯坦公牛管制凍精基因組DNA的提取2. 1公牛管制凍精采用44頭荷斯坦種公牛的管制凍精(購自北京奶牛中心)。管制凍精體積250 μ 1/管，GB4143-2008中規(guī)定每劑量?jī)鼍鈨龊缶踊盍?>35%、前進(jìn)精子數(shù)> 800萬個(gè)。每劑量?jī)鼍偩訑?shù)約為2000萬個(gè)左右(總精子數(shù)隨季節(jié)、牛只狀況、凍精生產(chǎn)廠家等因素變動(dòng)范圍較大)。制備管制凍精中所使用的稀釋保護(hù)劑，采用GB4143-84中推薦的配方A或B，其配制方法如下配方A 檸檬酸鈉、果糖、卵黃稀釋液a液蒸餾水100毫升，檸檬酸鈉2. 97克，卵黃10毫升；b液取a液41. 75毫升，加入果糖2. 5克，甘油7毫升，混勻即得。配方B 脫脂奶、卵黃稀釋液脫脂奶82毫升，b液10毫升，甘油8毫升，混勻即得。2. 2凍精基因組DNA的提取步驟1 取2mL離心管，放入約200 μ L體積凍精原液，加入500 μ L生理鹽水，渦旋混勻，12000rpm離心lmin。倒去上清液(去除管制凍精液中的精漿和稀釋液)，保留精子細(xì)胞沉淀。步驟2 重復(fù)步驟1 一次。步驟3 向沉淀加入400 μ L精子細(xì)胞裂解液和100 μ L 20% SDS,靜置2_;3min后渦旋混勻沉淀和溶液。然后向混合液中加入10μ L蛋白酶K，顛倒混勻。步驟4 混勻的樣品放入56°C的水浴鍋，過夜消化(10個(gè)小時(shí)左右，難消化樣品適當(dāng)增加消化時(shí)間)。步驟5 取消化好的樣品，加入300 μ L飽和食鹽水，顛倒2-3min，放入4°C冰箱靜置5-lOmin，沉淀溶液中蛋白和SDS復(fù)合物。然后12000rpm離心lOmin，將上清(DNA存在于上清中)移到新管中。步驟6 向上清液加入1000 μ L冰鎮(zhèn)的無水乙醇。顛倒l-2min，出現(xiàn)絮狀沉淀(DNA 沉淀)，然后12000rpm離心aiiin。肉眼可見DNA沉淀貼于離心管底部。倒去上清液，保留沉淀。步驟7 向離心管中加入500 μ L 75%的乙醇，顛倒混勻，清洗DNA沉淀上的殘留雜質(zhì)和鹽離子。然后12000 rpm離心aiiin，倒去上清，保留沉淀。步驟8 重復(fù)步驟7 —次。步驟9 開蓋放置2-aiiin，使DNA沉淀上殘余乙醇揮發(fā)。步驟10 向離心管中加入200 μ L TB (天根生化科技(北京)有限公司，也可以用 ddH20，保證溶液浸沒DNA沉淀，室溫放置半小時(shí)或者4度過夜，待沉淀溶解完全后檢測(cè)提取的基因組質(zhì)量。2. 3提取純化的基因組質(zhì)量檢測(cè)水平電泳檢測(cè)用1 %的瓊脂糖水平電泳檢測(cè)，點(diǎn)2 μ L樣品，130V電泳lOmin。檢測(cè)DNA條帶的完整性和純度。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出，44個(gè)樣品的條帶顯示呈明顯的主帶，沒有脫尾現(xiàn)象，說明DNA完整性好；點(diǎn)樣孔干凈，沒有蛋白殘留；條帶清晰，亮度強(qiáng)，說明提取的DNA濃度較高。分光光度計(jì)檢測(cè)采用Thermo Scientific NanoDrop 2000 分光光度計(jì)，在波長(zhǎng) 230nm、260nm 及^Onm處測(cè)定光吸收值，根據(jù)^Onm的光吸收值計(jì)算DNA產(chǎn)率，根據(jù)^0nm/280nm和 260nm/280nm光吸收比值判斷DNA樣品的純度。檢測(cè)結(jié)果如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種公牛凍精基因組DNA的提取方法，包括精子細(xì)胞的清洗、精子的裂解和消化以及DNA的純化步驟，其特征在于，精子的裂解和消化步驟為向清洗后的精子細(xì)胞沉淀中加入凍精原液2 3倍體積的精子細(xì)胞裂解液和20w/v% SDS，靜置后渦旋混勻，然后向混合體系中加入蛋白酶K，混勻，過夜消化；其中，所述精子細(xì)胞裂解液的配方為pH值8.0的EDTA 0. 010-0. 0125mol/ L, pH 值 8. 0 的 Tris · Cl 0. 01-0. 0125mol/L, SDS 1 % -1. 25 %, NaCl 2. 9-3. 625g/L, DTT9. 6-19. 3g/L，以蒸餾水配制；基因組DNA的純化步驟為向上述消化體系中加入該消化體系總體積0. 4 0. 6倍的飽和食鹽水，混勻后靜置5-lOmin，離心，轉(zhuǎn)移上清，并用無水乙醇沉淀上清液，離心后，洗滌沉淀，最后將沉淀溶于蒸餾水中，-20°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述精子細(xì)胞裂解液的配方為pH值8.0 的 EDTA 0. 0125mol/L，pH 值 8. 0 的 Tris · CIO. 0125mol/L，SDS 1. 25%, NaCl 3. 625g/L， DTT 9. 625g/L，以蒸餾水配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，精子的裂解和消化步驟為向清洗后的精子細(xì)胞沉淀中加入凍精原液2倍體積的精子細(xì)胞裂解液和凍精原液0. 5倍體積的 20w/v% SDS，靜置后渦旋混勻，然后向混合體系中加入蛋白酶K，使體系中蛋白酶K濃度達(dá)到0. 4mg/mL,混勻，過夜消化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，基因組DNA的純化步驟中是向精子細(xì)胞的消化體系中加入該消化體系總體積0. 6倍的飽和食鹽水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，公牛精子的清洗步驟為將凍精置于離心管中，加入生理鹽水，渦旋混勻，離心，得沉淀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的公牛凍精為荷斯坦公牛凍精。
7.公牛凍精基因組DNA提取試劑盒，其特征在于，其包括試劑 I :pH 值 8. 0 的 EDTA 0. 010-0. 0125mol/L，pH 值 8. 0 的 Tris 'C10. 01-0. 0125mol/ L, SDS 1% -1. 25%, NaCl 2. 9-3. 625g/L, DTT9. 6-19. 3g/L,以蒸溜水配制； 試劑II 飽和食鹽水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其還包括 試劑III 生理鹽水；試劑 IV :20w/v% SDS ； 試劑V:蛋白酶K。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，其包括試劑 I :pH 值 8. 0 的 EDTA 0. 0125mol/L, pH 值 8. 0 的 Tris · CIO. 0125mol/L, SDS 1. 25%, NaCl 3. 625g/L，DTT 9. 625g/L，以蒸餾水配制； 試劑II 飽和食鹽水； 試劑III 生理鹽水； 試劑 IV :20w/v% SDS ； 試劑V:蛋白酶K。
10.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的試劑盒在提取荷斯坦公牛凍精基因組DNA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種公牛凍精基因組DNA的提取方法，其包括公牛精子的清洗、精子的裂解和消化以及基因組DNA的純化步驟，本發(fā)明通過改進(jìn)消化裂解液成分和配比，確定適宜的消化時(shí)間，提高了公牛精子DNA的消化產(chǎn)率；同時(shí)摒棄原有的有機(jī)溶劑抽提的純化方法，采用比較簡(jiǎn)單的高鹽法進(jìn)行DNA純化，使用的試劑易于配制，成本低，能有效去除雜質(zhì)，獲得產(chǎn)率高、質(zhì)量好的凍精基因組，適合凍精基因組DNA的高效和批量獲取。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102296062SQ20111025121
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者劉銳, 初芹, 孫東曉, 張毅, 張沅, 張勝利, 范學(xué)華, 謝巖 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)