專利名稱：梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量pcr多靶檢測(cè)試劑盒及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過(guò)性接觸、輸血、創(chuàng)口或者胎盤(pán)等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液播散全身，使機(jī)體幾乎所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性的，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂(lè)觀地預(yù)言([1]WHO. GlcAal prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections :0verview and estimates[J]. Geneva :WH0, WHO/HIV/AIDS, 2001 :1-30.):“由于有高靈敏度檢測(cè)方法和高效的治療方案， 梅毒是一種能夠通過(guò)公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，由于至今仍然缺乏高靈敏的檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒依然是嚴(yán)重危害人類健康的全世界范圍的公共衛(wèi)生問(wèn)題。中國(guó)疾病控制中心的官方數(shù)據(jù)顯示2010年我國(guó)梅毒(Syphilis)的發(fā)病數(shù)為375309例，比2009年同期增長(zhǎng)24. 50%。報(bào)告發(fā)病數(shù)僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核居第三位，居于性傳播疾病首位(中國(guó)疾控中心http://www.chinacdc.net.cn)。近年來(lái)，有關(guān)梅毒與艾滋病之間存在著互相促進(jìn)的研究結(jié)果([2]BuchacZ，K.，Klausner, J. D.， Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P. D. and Schwendemann, J. HIV incidence among men diagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, and Los Angeles,2004to 2005[J], Jaids-J Acq Imm Def，2008，47(2) :234-240. [3]Ghanem,K. G. ,Erbelding,E. J.， Wiener, Z.S., et al. Serological response to syphilis treatment in HIV-positive and HIV-negative patients attending sexually transmitted diseases clinics[J]. SexTransm Infect, 2007,83 (2) :97-101.)，使得梅毒的控制越發(fā)困難而且重要。無(wú)疑，人們對(duì)梅毒的防控過(guò)于樂(lè)觀，對(duì)梅毒的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。盡管青霉素成功應(yīng)用于治療各期梅毒已經(jīng)有50年歷史，但治療失敗可見(jiàn)于任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法的選擇[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，.20(10) =1491-1494)在對(duì)健康體檢者、門診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)，這些人群存在一定比例的梅毒感染率，推測(cè)本地區(qū)人群梅毒的檢出率應(yīng)該在2. 59%以上。顯然，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒正以過(guò)去500 年任何國(guó)家和地區(qū)都未曾有過(guò)的速度在中國(guó)傳播，由于存在隱性感染以及無(wú)法統(tǒng)計(jì)的私人診所患者患病率，目前看到的梅毒發(fā)病率或許只是梅毒現(xiàn)狀的冰山一角([5]Lin，L.R. ,Fu, Ζ. G.，Dan，B.，Jing, et al. Development of a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPN17 and TPN47[J].Diagn Micr Infec Dis，2010，68 (3) : 193—200· [6]Tucker JD，C. X.， Peeling RW. Syphilis and social upheaval in china[J]. N Engl J Med，2010，362(18)1658-1661. [7] Chen，Ζ. Q.，Zhang，G. C.，Gong, X. D.，Lin, C.，Gao, χ.，Liang，G. J.，Chen， X. S.，and Cohen，M. S. Syphilis in china :Results of a national surveillance programme[J]. Lancet,2007, 369 :132-138. [8]Li-Rong Lin,Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu，et al. Evaluation of acolloidal gold-immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specific IgM antibody in syphilis serofast reaction patients a serologic marker for the relapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease· 2011，70 :10-16)。實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷梅毒必不可少的方法，也是判斷療效和復(fù)發(fā)的重要依據(jù)，包括 暗視野顯微鏡檢查和血清學(xué)試驗(yàn)。梅毒螺旋體感染早期，梅毒抗體還未產(chǎn)生或含量較低時(shí)，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但敏感度較低，且易受肛門周圍非致病螺旋體的影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測(cè)兩大類型。反應(yīng)素檢測(cè)對(duì)早期梅毒檢測(cè)靈敏度不高，而且生物假陽(yáng)性率較高，是主要用于療效觀察的一項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)([9]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)TRUST/TPPA與IgM抗體聯(lián)合檢測(cè).中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志.2010，152 (05) :446-448)。梅毒特異性抗體檢測(cè)的敏感性和特異性均較反應(yīng)素高。但是，梅毒特異性抗體檢測(cè)仍然存在著靈敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測(cè)到梅毒患者各類組織、體液中存在梅毒螺旋體，能證明梅毒螺旋體存在，那么這些棘手問(wèn)題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官，少量梅毒螺旋體即可導(dǎo)致兔睪丸炎，因此，兔感染試驗(yàn)被視為梅毒螺旋體檢測(cè)的最靈敏的方法。然而，兔感染試驗(yàn)操作繁瑣，觀察時(shí)間要求3個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能得到結(jié)果，臨床可操作性差。PCR擴(kuò)增技術(shù)以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴(kuò)增模板，通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了病原體的快速檢測(cè)，具有高效、靈敏和特異等優(yōu)勢(shì)。從理論上分析，通過(guò)優(yōu)化、改良PCR擴(kuò)增技術(shù)，其檢測(cè)的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗(yàn)，而檢測(cè)時(shí)間僅僅需要2個(gè)小時(shí)([10]HAYP E，CLARKE J R，TAYLOR-ROBINSON D， et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patients with syphilis and hiv infection using the polymerase chain reaction[J]. Genitourin Med,1990,66(6) 428-32)，有望成為解決這些棘手問(wèn)題的最佳方法。.盡管國(guó)內(nèi)外有些企業(yè)研發(fā)出梅毒PCR檢測(cè)試劑，但尚未有進(jìn)入臨床應(yīng)用的有注冊(cè)文號(hào)PCR檢測(cè)試劑，而僅僅停留在科研應(yīng)用。更嚴(yán)重的是，目前的PCR檢測(cè)試劑在研發(fā)過(guò)程中由于未經(jīng)嚴(yán)格的比對(duì)試驗(yàn)，無(wú)一例外的存在靈敏度和特異性嚴(yán)重不足，其準(zhǔn)確性不高，是目前梅毒PCR技術(shù)在臨床中應(yīng)用的瓶頸。多靶實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)([11]Erali M, Pounder JI, Woods GL. et al. Multi Plex single color PCR with ampIicon melting analysis for identification of Aspergillus speeies[J]· ClinChem，2006，52(7) :1443-1445)在同一反應(yīng)管中同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)2個(gè)以上的靶基因的檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)避免了單基因突變?cè)斐傻穆z，很大程度上提高了梅毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。將在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經(jīng)梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻(xiàn)血員、孕產(chǎn)婦、婚前體檢、手術(shù)患者和輸血前篩查等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，有著目前常用的血清學(xué)檢測(cè)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒及其制備方法。所述梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA 聚合酶(Tag酶)瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2 清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含5個(gè)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶， 所述5個(gè)靶基因?yàn)閜oIA基因、TPN47基因、tmpA基因、TpF-I基因和bmp基因5個(gè)梅毒高特異性基因；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶；所述6個(gè)含5個(gè)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶、PCR反應(yīng)液瓶、含收集管的離心柱、陰性質(zhì)控品瓶、陽(yáng)性質(zhì)控品瓶、Tag酶瓶、蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶和第2清洗緩沖液均布在外包裝盒內(nèi)。所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA 的樣品。所述6個(gè)含5個(gè)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度可分別為1. 0 X 102copies/mL, 1. OX 103copies/mL、l. 0 X 104copies/mL、1· 0 X 105copies/mL、1· 0 X 106copies/mL 禾口 1. OX 107copies/mL，共 6 個(gè)濃度。所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs和5對(duì)引物探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有3' -5' DNA聚合酶活性、5' -3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期> 45min 的高溫聚合酶。所述梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(kù)(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體靶基因，包括polA基因、TPN47基因、tmpA 基因、TpF-I基因和bmp基因5個(gè)梅毒特異性基因，5對(duì)梅毒高特異性基因探針和引物的設(shè)計(jì)采用PCR引物探針設(shè)計(jì)軟件primer premier 5. 0,Oligo 6. 0、TM Utility vl. 3,Clustal X等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE(10mM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM ΤΑ)溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存；2)多靶基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟1)中的5個(gè)靶基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min,與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱4 后，再在冰中放置lmin， 加入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Ml I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并_20°C保存作為Real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；3)多靶基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，其具體方法如下包含靶基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒， 取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，260nm, 280nm比色，純度=A260A280,濃度= A260X 50 X 2 X 100 X 1(Γ6X 6. 02 X IO23/ (2806 X 324. 5X2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋，以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍；4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs,5對(duì)引物探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液；5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液菌懸液IOOml經(jīng)5000r/min，4°C離心5min,以IOml緩沖液I重懸菌液，4°C，5000r/min，離心5min，細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴 20min ；加入5ml緩沖液II，75°C水浴45min, 4°C, 15000r/min離心IOmin ；上清加入硫酸銨使達(dá)30%,4°C,1500r/min離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C 條件下透析，每他換液1次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA ；7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本；制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品；8)制備梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA 聚合酶(Tag酶)、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒。在步驟1)中，所述5對(duì)梅毒高特異性基因探針和引物的序列如下所示；
權(quán)利要求
1.梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒，其特征在于設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含5個(gè)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶，所述 5個(gè)靶基因?yàn)閜olA基因、TPN47基因、tmpA基因、TpF-I基因和bmp基因5個(gè)梅毒高特異性基因；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶；所述6個(gè)含5個(gè)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶、PCR反應(yīng)液瓶、含收集管的離心柱、陰性質(zhì)控品瓶、陽(yáng)性質(zhì)控品瓶、Tag酶瓶、蛋白酶 K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶和第2清洗緩沖液均布在外包裝盒內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。
3.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述6個(gè)含5個(gè)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度分別為1. OX 102copies/mL、l. OX 103copies/mL、 1.0X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL 和 1.0X 107copies/mL,共 6 個(gè)濃度。
4.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs和5對(duì)引物探針組成的混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述耐熱DNA聚合酶具有3' -5' DNA聚合酶活性、5' -3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶是半衰期> 45min的高溫聚合酶。
6.如權(quán)利要求1所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(kù)(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體靶基因，包括POlA基因、TPN47基因、tmpA基因、TpF-I基因和bmp基因5個(gè)梅毒特異性基因，5對(duì)梅毒高特異性基因探針和引物的設(shè)計(jì)采用 PCR 引物探針設(shè)計(jì)軟件 primer premier 5.0、Oligo 6· 0、TM Utility vl. 3, Clustal X等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE(10mM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM ΤΑ)溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存；2)多靶基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟1)中的5個(gè)靶基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱4 后，再在冰中放置lmin，加入LB 培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Ml I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并-20°C 保存作為Real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；3)多靶基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，其具體方法如下包含靶基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取 10μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，260nm，280nm比色，純度=A260A280,濃度= A260X 50 X 2 X 100 X 1(Γ6X 6. 02 X IO23/ (2806 X 324. 5X2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋，以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍；4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs,5對(duì)引物探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液；5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代- β -D半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液菌懸液IOOml 經(jīng)5000r/min，4°C離心5min，以IOml緩沖液I重懸菌液，4°C，5000r/min,離心5min，細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ；加入5ml緩沖液 II，75 °C 水浴 45min,4°C，15000r/min 離心 IOmin ；上清加入硫酸銨使達(dá) 30% A°C, 1500r/ min離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每Mi換液 1次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA;7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本；制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品；8)制備梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述5對(duì)梅毒高特異性基因探針和引物的序列如下所示；
8.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述梯度稀釋選1. OX 102copies/mL、l. OX 103copies/mL、 1.0X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL、1.0X 107copies/mL 6 個(gè)濃度作標(biāo)準(zhǔn)品。
9.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述PCR緩沖液為pH= 5. 0 10. 0之間的穩(wěn)定緩沖對(duì)，所述pH最好為7. 0 9. 0 ；引物的濃度最好為25ρπι01/μ L，熒光探針的濃度最好為20ρπιΟ1/μ L，dNTPs 的濃度最好為2mmol/L ；鎂離子的濃度最好為15 20mmol/L。
10.如權(quán)利要求6所述的梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒的制備方法， 其特征在于在步驟5)中，所述緩沖液I為50mmol/Ltris-HCl，50mmol/L Glucose, Immo 1/ LEDTA，pH8. 0 ；所述緩沖液 II 為 5mmol/L Tris2HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/L PMSF,0. 5% Tween 20,0. 5% NP 40 ；所述緩沖液 III 為 50ml mol/LTris2HCl, lOmmol/LKCl, lmmol/L DTT，0. 5% PMSF，50%甘油；在步驟6)中，所述樣本可包括組織、全血、分泌物臨床標(biāo)本；所述分泌物可包括皮膚、 生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物；在步驟8)中，Tag酶的用量可為8 10U/反應(yīng)。
全文摘要
梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒及其制備，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含5個(gè)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。先篩選靶基因，再構(gòu)建多靶基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，制作多靶基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線后，先后制備PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶，建立樣品處理方法后，制備質(zhì)控品，最后完成梅毒螺旋體實(shí)時(shí)熒光定量PCR多靶檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102251052SQ20111023249
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者劉莉莉, 張忠英, 張長(zhǎng)弓, 方贊熙, 楊天賜, 林麗蓉, 黃松潔 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院