專利名稱：一種人神經(jīng)生長因子的重組變異體及其制備方法
一種人神經(jīng)生長因子的重組變異體及其制備方法人神經(jīng)生長因子(hNGF)是人體中一種對神經(jīng)修復(fù)機(jī)能有調(diào)節(jié)作用的生物活性因子，對促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的生長，損傷神經(jīng)的再生具有決定性作用。目前hNGF作為藥品國內(nèi)外均未上市，只有我國批準(zhǔn)了鼠源NGF臨床應(yīng)用，但鼠源NGF因種屬差異及病毒污染的威脅而終將被重組產(chǎn)品替代。用基因工程生產(chǎn)重組人神經(jīng)生長因子是唯一的途徑。rhNGF具有重要臨床價值，將填補(bǔ)國際神經(jīng)修復(fù)藥物的空白。我國每年有上百萬神經(jīng)損傷病人，市場前景可觀。我們發(fā)明了一種通過蛋白質(zhì)工程改造獲得的hNGF重組變異體及其制備方法。天然活性的人神經(jīng)生長因子末端為 Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Ile-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asn-Ser等。我們通過對其分子結(jié)構(gòu)的深入研究,提出了 hNGF重組變異體的新結(jié)構(gòu)，此重組變異體(rhNGF)的特征在于重組表達(dá)的hNGF肽段從N端第一個氨基酸開始少了 S絲氨酸、S絲氨酸、S絲氨酸、H組氨酸、P脯氨酸、I異亮氨酸、F苯丙氨酸、H組氨酸、R精氨酸、G甘氨酸等10個氨基酸，多了 G甘氨酸、A丙氨酸二個氨基酸，并從E谷氨酸、F苯丙氨酸、S絲氨酸、V纈氨酸及往后氨基酸開始符合hNGF正常序列，從總體分子量上看少 了 8個氨基酸。我們通過上述對hNGF進(jìn)行的蛋白質(zhì)工程改造以期獲得藥效更好、更穩(wěn)定的hNGF重組突變體(rhNGF)，其為具有新結(jié)構(gòu)的生物分子，以利于新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用。實(shí)例說明I.目的基因的獲得為了獲得人NGF重組變異體的cDNA，我們采用全基因合成的方法獲得rhNGF的cDNA。全基因合成采用分段合成的方法進(jìn)行。基因序列設(shè)計則根據(jù)我們的分子設(shè)計和參考文獻(xiàn)報道的hNGF的基因序列。我們設(shè)計的hNGF基因序列的5’端含有Kpnl酶切位點(diǎn)及編碼羥胺切割位點(diǎn)的序列，3’端含有Xbal酶切位點(diǎn)和終止密碼TGA。合成基因設(shè)計序列見圖I。圖I. rhNGF合成基因設(shè)計序列
5’AAC GGC GCA GAA TTC TCG GTG
TGT GAC AGT GTC AGC GTG TGG GTT GGGGAT AAG ACC ACC GCC ACA GAC ATC AAGGGC AAG GAG GTG ATG GTG TTG GGA GAGGTG AAC ATT AAC AAC AGT GTA TTC AAACAG TAC TTT TTT GAG ACC AAG TGC CGG

GAC CCA AAT CCC GTT GAC AGC GGG TGCCGG GGC ATT GAC TCA AAG CAC TGG AACTCA TAT TGT ACC ACG ACT CAC ACC TTTGTC AAG GCG CTG ACC ATG GAT GGC AAGCAG GCT GCC TGG CGG TTT ATC CGG ATAGAT ACG GCC TGT GTG TGT GTG CTC AGCAGG AAG GCT GTG AGA TGA TCT AGA2.基因序列測定將人工合成的rhNGF的cDNA，插入載體pThioHis A，用合成的測序引物進(jìn)行正向測序(測序儀ABI PRISM) ο將測序圖譜用計算機(jī)讀序，得到cDNA序列并翻譯成對應(yīng)氨基酸，結(jié)果我們設(shè)計的hNGF的cDNA和氨基酸序列一致。表明我們克隆得到的rhNGF的cDNA是正確的。
3.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將rhNGF的cDNA插入pBV220中直接表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物形成不溶性的包含體，需要經(jīng)過變性和復(fù)性得到有活性的rhNGF。因rhNGF含三對二硫鍵，復(fù)性很困難，導(dǎo)致產(chǎn)率很低。為了獲得rhNGF的高效可溶性表達(dá),我們把rhNGF與大腸桿菌硫氧還蛋白thioredoxin進(jìn)行融合表達(dá)，thioredoxin可以引導(dǎo)其后的蛋白正確折疊，呈可溶性表達(dá)，具天然生物學(xué)活性，避免了變性復(fù)性的難題。切割方法用的是鹽酸羥胺切割法。鹽酸羥胺可以特異地切割蛋白中的Asn-Gly肽鍵，產(chǎn)生N端為Gly的多肽。我們發(fā)現(xiàn)rhNGF多肽中不含羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly，故我們選定輕胺切割位點(diǎn)Asn-Gly為連接點(diǎn)與thioredoxin融合表達(dá)rhNGF。表達(dá)的融合蛋白用輕胺切割后釋放出rhNGF，其起始氨基酸為Gly，此后的氨基酸序列與rhNGF序列一致。Gly與Met性質(zhì)相似，放在N端均不影響蛋白的活性，況且hNGF的N端氨基酸對活性不重要，其N端8個氨基酸在人體內(nèi)首先要被水解掉以實(shí)現(xiàn)功能。羥胺是人體內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物，鹽酸羥胺成本低，切割特異性好，切割效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。我們選用質(zhì)粒pThioHis A作為表達(dá)載體(Invitrogen公司產(chǎn)品)，它含有啟動子Ptrc promotor、thioredoxin前導(dǎo)肽及終止子aspA terminator,以及Amp抗性基因。我們將合成的rhNGF cDNA用Kpnl-Xbal雙酶切后的片段插入上述質(zhì)粒的Kpnl-Xbal之間，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pTHNGF。宿主菌選用大腸桿菌JM109 (購自Invitrogen公司)。大腸桿菌JM109的基因型為recAlsupE44 endAl hsdR17 gyrA96 relAl thi Δ (lac-proAB)F，[traD36proAB+lacIqlacZ Δ Μ15]。將質(zhì)粒pTHNGF轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，即構(gòu)成工程菌pTHNGF/JM109。將其保存于15%甘油中，冷凍于_70°C，即為原始種子庫。4. rhNGF工程菌的檢定4. I細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特性
從原始種子庫中取一支甘油保存的pTHNGF/JM109工程菌，接種在LBA培養(yǎng)基中，37°C搖蕩培養(yǎng)16小時，再以10%的比例接種到LBA培養(yǎng)基中(LB+0. lmg/ml Amp)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，以此為種子液進(jìn)行以下各項(xiàng)檢查4. I. I細(xì)菌形態(tài)用種子液涂布玻片后，革蘭氏染色并鏡檢。工程菌為革蘭氏陰性，菌體為直桿狀，邊緣清晰，兩端鈍圓，大小基本一致，未見其它雜菌污染。4. I. 2培養(yǎng)特征用種子液劃線LBA平板，37°C培養(yǎng)20小時，肉眼可見菌落為圓形，邊緣光滑，菌落飽滿，表面濕潤、光滑，呈乳白色，基質(zhì)未見色素產(chǎn)生。4. 1.3生理生化特性
能利用葡萄糖、乳糖、甘油作為碳源，不能利用果糖、肌醇。吲哚反應(yīng)為陽性。V. P.反應(yīng)呈陰性,不水解明膠。4. 2抗生素抗性特征未轉(zhuǎn)化的宿主菌BL21在LB培養(yǎng)基上生長，在LBA培養(yǎng)基上不生長(Amp :0. Img/ml) ο轉(zhuǎn)化后的工程菌pTHNGF/JM109在LB培養(yǎng)基和LBA培養(yǎng)基上都生長良好。表明工程菌pTHNGF/JM109具有氨芐青霉素的抗性。4. 3質(zhì)粒酶切圖譜分析從上述種子液中提取質(zhì)粒pTHNGF，進(jìn)行酶切鑒定。用KpnI-XbaI及KpnI-PstI均可切出370bp的小帶,用EcoRI-PstI可切出約340bp的小帶,酶切鑒定結(jié)果均符合質(zhì)粒設(shè)計，說明質(zhì)粒PTHNGF構(gòu)建正確。4. 4工程菌的表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的獲得將pTHNGF/JM109種子液以I %的比例接種于LBA培養(yǎng)基中，37°C生長至OD6tltl約為O. 5，加入IPTG至ImM作為誘導(dǎo)劑，37°C誘導(dǎo)5小時，收獲菌體，洗滌后取樣裂解，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析?？梢娬T導(dǎo)后的菌體在26kD處比空白對照多出一條濃的蛋白帶，與要表達(dá)的rhNGF融合蛋白分子量26kD大小相等，經(jīng)薄層掃描，該條帶占菌體總蛋白的10-20 %左右。對表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲破菌，并高速離心。將沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳?？梢姳磉_(dá)的rhNGF融合蛋白集中在上清中，即以可溶形式表達(dá)，具天然活性，不需要經(jīng)過變性和復(fù)性。經(jīng)過滲透壓釋放的方法，將大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的可溶rhNGF融合蛋白大部分釋放到緩沖液中，羥胺切割后，經(jīng)Ni螯合層析柱和CM-Sepharose層析柱純化，即得到純化的rhNGFο5.表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證資料5. I特異性鑒別實(shí)驗(yàn)純化的rhNGF產(chǎn)品做免疫印跡鑒定，結(jié)果與抗hNGF抗體呈陽性反應(yīng)。表明本產(chǎn)品與抗hNGF抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。5. 2N末端氨基酸序列分析對純化的rhNGF進(jìn)行N端氨基酸序列分析，測序結(jié)果表明N端15個氨基酸序列為Gly-Ala-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asp-Ser-Val-Ser-Val-Trp-Val-Gly即N端氨基酸序列與設(shè)計符合。6.活性測定采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)法測定，具體為以DMEM為母液，在含20%雞血漿和15%雞胚浸液的培養(yǎng)基中，利用伊莎褐雞胚腰椎背根神經(jīng)節(jié)，在終濃度為30ng/ml的NGF的刺激下，培養(yǎng)36h。經(jīng)檢測，純化的rhNGF其生物學(xué)活性與鼠源神經(jīng)生長因子活性在一個數(shù)量級，達(dá)105u/mg 以上。通過以上步驟，我們對hNGF進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造，以期獲得藥效更好、生物活 性更穩(wěn)定的hNGF重組突變體(rhNGF)，以利于人神經(jīng)生長因子的作用機(jī)制研究和臨床應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明中的人神經(jīng)生長因子重組變異體(rhNGF)特征在于表達(dá)的NGF肽段N端少了 SSSHPIFHRG 10個氨基酸，多了 GA 二個氨基酸，分子量上看少了 8個氨基酸，從EFSV開始同于人神經(jīng)生長因子正常序列。
2.本發(fā)明中人神經(jīng)生長因子重組變異體(rhNGF)第I位氨基酸為甘氨酸。
3.本發(fā)明中人神經(jīng)生長因子重組變異體(rhNGF)第2位氨基酸為丙氨酸。
4.本發(fā)明中切割rhNGF融合蛋白的Asn-Gly肽鍵用的是羥胺切割法。鹽酸羥胺可以特異地切割蛋白中的Ash-Gly肽鍵，產(chǎn)生N端為Gly的多肽。
5.本發(fā)明采用IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，采用超聲破菌和滲透法釋放大部分可溶rhNGF融合蛋白，用Ni螯合層析柱和CM-Sepharose層析柱純化rhNGF。
6.本發(fā)明獲得的人神經(jīng)生長因子重組變異體具有藥用價值，可以開發(fā)出各種劑型的藥品。劑型指粉針、水針、噴霧、含片、膠囊、栓劑等藥物劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人神經(jīng)生長因子的重組變異體rhNGF及其制備方法。我們根據(jù)分子結(jié)構(gòu)研究設(shè)計的人神經(jīng)生長因子重組變異體(rhNGF)其肽段N端少了SSSHPIFHRG 10個氨基酸，多了GA二個氨基酸，此后從EFSV開始的序列同于人神經(jīng)生長因子正常序列。采用全基因合成的方法獲得rhNGF的cDNA，構(gòu)建工程菌進(jìn)行表達(dá)，得到rhNGF融合蛋白，用羥胺切割后進(jìn)行純化即得到純化的rhNGF，其具有天然生物活性。
文檔編號C12N15/70GK102911265SQ20111022353
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者王革 申請人:王革