專利名稱：一種利用畢赤酵母基因調控發(fā)酵生產(chǎn)不同分子量透明質酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程和生物發(fā)酵領域，具體講是利用畢赤酵母基因調控發(fā)酵生產(chǎn)不同分子量透明質酸的方法。
背景技術：
透明質酸(HA)是由N-己酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重復結構組成的線形多糖結構。HA在潤滑關節(jié)，調節(jié)血管壁的通透性，促進創(chuàng)傷愈合等方面作用顯著。尤為重要的是，它具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質之一。但因HA的分子量較大，涂于表皮不會被真皮吸收，使其作用效果大大降低。而低分子量的HA寡糖(IXlO5 4X105)能滲透到真皮層，可調節(jié)皮膚代謝，促進血液循環(huán)，有·保健、美白作用。此外，低分子量HA寡糖還具有促血管生成，促進創(chuàng)傷愈合及抑制血管新生內膜增生等作用。因此不同分子量的HA各有其重要作用，現(xiàn)在不同分子量HA的生產(chǎn)制備技術已引起極大重視。不同分子量HA的制備方法有發(fā)酵法、生物合成法、化學降解法和酶解法。發(fā)酵法是通過控制發(fā)酵條件和分離精制條件來得到不同分子量的HA，但是分子量范圍比較大，且很難得到分子量小于一萬的HA。生物合成法反應條件要求極為嚴格，并且需要多種酶同時參與反應，成本較高。化學降解法是利用強酸、強堿或氧化劑等，反應條件較劇烈，能破壞HA糖鏈上的糖苷鍵，從而破壞HA的結構。酶降解法反應條件溫和，降解速度快，較適于制備不同分子量HA，但是需要先制備酶液，再利用酶液降解HA。現(xiàn)多采用真核表達系統(tǒng)表達生產(chǎn)目標酶類，通過降解HA來生產(chǎn)制備不同分子量的HA及HA寡糖，具有產(chǎn)量高、安全、簡便等優(yōu)點。

發(fā)明內容
本發(fā)明利用真核表達系統(tǒng)——畢赤酵母表達系統(tǒng)分別表達透明質酸合成酶(HAS，一種主要在透明質酸合成過程中起作用的酶)和透明質酸酶(HAase，一種主要在將HA催化降解為不同分子量HA過程中起作用的酶)，并在發(fā)酵過程中直接生成多種不同分子量的HA。該方法實現(xiàn)了透明質酸分子量與基因調控方式的偶聯(lián)，可以根據(jù)需要制備特定分子量的HA，是一種安全、簡便、有效的方法。本發(fā)明的目的是得到一種重組畢赤酵母通過基因調控直接生產(chǎn)特定分子量HA的新方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案本發(fā)明提供了一種重組畢赤酵母基因工程菌HAS-PH20，構建過程為首先將獸疫鏈球菌透明質酸合成酶表達載體pGAPZ a A-szHasA轉入酵母菌中，得到重組酵母HAS，再將重組人透明質酸酶表達載體pPICZ a A-ph20轉入重組酵母HAS，即得到目的重組酵母HAS-PH20。
本發(fā)明提供了一種在發(fā)酵罐中，通過調節(jié)甲醇的流加速率、流加時間和甘油甲醇的體積比，用酵母基因工程菌HAS-PH20生產(chǎn)不同分子量的HA寡糖的新型發(fā)酵方法。本發(fā)明提供的畢赤酵母基因工程菌HAS-PH20及不同分子量HA的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，解決了目前HA生產(chǎn)過程中分子量分級困難的問題。


圖I :獸疫鏈球菌透明質酸 合成酶酵母表達載體pGAPZ a A-szHasA的構建過程圖。圖2 :重組人透明質酸酶酵母表達載體pPICZ a A_ph20的構建過程圖。圖3 :發(fā)酵液中所得的不同分子量HA的純化分析圖。
具體實施例方式實驗條件I菌株與載體畢赤酵母菌株及大腸桿菌菌株T0P10為本實驗室保存；畢赤酵母表達載體pGAPZ a A 及 pPICZ a A 購自 Invitrogen 公司。2酶及其它試劑本發(fā)明所用到的各種限制性內切酶均購自TaKaRa公司，pfu DNA聚合酶及TaqDNA聚合酶購自Fermentas公司；其它試劑均為國產(chǎn)試劑。3培養(yǎng)基畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為Basal Salts培養(yǎng)基(85%磷酸26. 7mL/L，硫酸鈣O. 93g/L，硫酸鉀18. 2g/L，硫酸鎂14. 9g/L，氫氧化鉀4. 13g/L，甘油40g/L);發(fā)酵過程中用到的微量鹽溶液PTMl (硫酸銅6g/L，碘化鈉O. 08g/L,硫酸鎂3. Og/L,鑰酸鈉O. 2g/L，硼酸O. 02g/L，氯化鈷O. 5g/L，氯化鋅20. Og/L，硫酸亞鐵20. Og/L,生物素O. 2g/L，硫酸5mL/L)。本發(fā)明所用到的重組遺傳學技術均為本領域中的常規(guī)技術。實施例I :重組質粒pGAPZ a A-szHasA及pPICZ a A_ph20的構建和畢赤酵母轉化一重組質粒pGAPZ a A-szHasA的構建I全基因合成序列表I中獸疫鏈球菌透明質酸合成酶基因szHasA，并對其進行PCR克隆擴增，PCR引物序列如下正向5，-CCGCTCGAGGCAGAACATTAAAAAACCTCA-3’反向5’-CATTTCTAGATTATAATAATTTTTTACGTGTT-3’PCR反應條件預變性94°C,5min變性94Imin復性56°C,Imin延伸72°C，2min循環(huán)30個延伸72°C，IOmin2重組質粒的構建通過O. 7%的瓊脂糖電泳檢測，回收大小約為I. 2kb的PCR產(chǎn)物用于克隆表達。該PCR回收產(chǎn)物及pPICZ a A載體通過限制性內切酶Xho I、Xbal I酶切后進行連接構建重組質粒 pGAPZ a A-szHasA。3重組質粒pGAPZ a A -szHasA連接完成后，轉化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞。二重組質粒pPICZ a A_ph20的構建I ph20基因序列優(yōu)化根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化設計ph20基因序列在人透明質酸酶基因(geneID6677)基礎上，利用P. pastoris偏愛密碼子替換稀有密碼子，將亮氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，丙氨酸等氨基酸的大多數(shù)密碼子替換成以UUA，CCA, GAA, GAU,CAA, UCA, GCA,并敲除掉了 Sac I酶切位點，最終優(yōu)化后的ph20基因序列具有表2中的堿基序列。2全基因合成已經(jīng)優(yōu)化過的重組人透明質酸酶基因ph20，并對其進行PCR克隆擴增；PCR引物序列如下:正向5，-GTATCTCTCGAGAAAAGATTGAACTTCAGAGCA-3’反向5’-CAAATCTAGAGGACCTGATCAGTGAAAACAATTC-3’PCR反應條件預變性94°C,5min變性94Imin復性55°C，Imin延伸72°C，2.5min循環(huán)30個延伸72°C，IOmin3重組質粒的構建通過O. 7%的瓊脂糖電泳檢測，回收大小約為I. 4kb的PCR產(chǎn)物用于克隆表達。該PCR回收產(chǎn)物及pPICZ a A載體通過限制性內切酶Xho I、Xbal I酶切后進行連接構建重組質粒 pPICZ aA_ph20。4重組質粒pPICZ a A_ph20連接完成后，轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞。三畢赤酵母轉化I酵母菌株研究用酵母為P. Pastoris。2酵母轉化首先將線性化的重組質粒pGAPZ a A_szHasA轉入酵母菌中，得到重組酵母HAS，再將線性化的重組質粒pPICZ a A-ph20轉入重組酵母HAS，即得到目的重組酵母HAS-PH20。具體酵母轉化步驟如下(I)挑取酵母單菌落，接種至含有5mL YI3D培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，30°C培養(yǎng)過夜；(2)取O. 2mL的培養(yǎng)物接種至含有500mL新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，過夜生長至 OD6tltl 達到 I. 3-1. 5 ；(3)在4°C，1500g離心5min收集細胞，用500mL預冷的滅菌水懸浮細胞；同樣條件離心，用250mL預冷的滅菌水懸浮細胞；
(4)按步驟3離心，用20mL預冷的lmol/L山梨醇懸浮細胞；如上離心，用ImL預冷的lmol/L山梨醇懸浮細胞；80 μ L分裝；(5)將5-20 μ g的線性化DNA溶解在5 10 μ L TE溶液中，與80 μ L的酵母感受態(tài)細胞混勻，轉至O. 2cm冰預冷的電轉化杯中；(6)冰上放置5min，根據(jù)所使用裝置推薦的酵母參數(shù)進行電擊；立即加入ImL預冷的lmol/L山梨醇至杯中，將內容物轉至滅菌離心管中；(7)將菌體懸液涂布于含有適量抗生素的YPDS平板上，每600 μ L涂布平板；將平板置于30°C培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。實施例2 :酵母工程菌HAS-PH20發(fā)酵生產(chǎn)多種不同分子量HA的方法在I升發(fā)酵罐中，酵母工程菌HAS-PH20可直接生產(chǎn)不同分子量HA。首先在30°C條件下，將重組酵母HAS-PH20在YPD培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24小時；將過夜培養(yǎng)的酵母，按
O.5% 2%的比例接種于YTO種子培養(yǎng)基中，上罐發(fā)酵方法如下(I)菌體培養(yǎng)階段發(fā)酵溫度保持在28 30°C，利用28%的氨水調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值至5. O 6. 0，然后將種子培養(yǎng)基按5% 10%的接種量接種入Basal Salts上罐培養(yǎng)基中，同時添加4. 37mL PTMl鹽溶液，通氣攪拌18 24小時；·
(2)甘油補料階段，即組成型表達獸疫鏈球菌透明質酸合成酶并產(chǎn)生透明質酸階段流加30% -50%的甘油，流加量為10 20mL/hr/L，培養(yǎng)24 48小時左右，此時保證溶氧量大于20%。該過程既是酵母生長階段即菌體濕重大量增加階段，也是獸疫鏈球菌透明質酸合成酶組成型表達階段，在此過程中透明質酸被快速積累；(3)甲醇誘導階段，即利用甲醇作為誘導劑誘導重組人透明質酸酶表達并將HA分解為不同分子量HA寡糖階段甘油流加一段時間后停止流加甘油，將碳源換為甲醇，流加速度為4 8mL/hr/L，再繼續(xù)培養(yǎng)24 48小時，此過程保證溶氧量大于20%。該過程流加甲醇可誘導AOXl啟動子作用并開始表達重組人透明質酸酶，在此過程中通過調節(jié)甲醇的流加速率、流加時間和甘油甲醇的體積比來獲得不同分子量的HA寡糖。(4)發(fā)酵液離心，取上清，選擇不同的超濾膜進行超濾和凝膠層析，可以得到不同分子量的HA HA1 (分子量8 000 10 000)，HA2 (分子量5 000 8 000)，HA3 (分子量3
000 5 000)，HA4 (分子量 2 000 3 000)，HA5 (分子量 I 000 2 000)，HA6 (分子量 I000以下)。表I獸疫鏈球菌透明質酸合成酶堿基序列ATGAGAACATTAAAAAACCTCATAACTGTTGTGGCCTTTAGTATTTTTTGGGTACTGTTGATTTACGTCAATGTTTATCTCTTTGGTGCTAAAGGAAGCTTGTCAATTTATGGCTTTTTGCTGATAGCTTACCTATTAGTCAAAATGTCCTTATCCTTTTTTTACAAGCCATTTAAGGGAAGGGCTGGGCAATATAAGGTTGCAGCCATTATTCCCTCTTATAACGAAGATGCTGAGTCATTGCTAGAGACCTTAAAAAGTGTTCAGCAGCAAACCTATCCCCTAGCAGAAATTTATGTTGTTGACGATGGAAGTGCTGATGAGACAGGTATTAAGCGCATTGAAGACTATGTGCGTGACACTGGTGACCTATCAAGCAATGTCATTGTTCACCGGTCAGAAAAAAATCAAGGAAAGCGTCATGCACAGGCCTGGGCCTTTGAAAGATCAGACGCTGATGTCTTTTTGACCGTTGACTCAGATACTTATATCTACCCTGATGCTTTAGAGGAGTTGTTAAAAACCTTTAATGACCCAACTGTTTTTGCTGCGACGGGTCACCTTAATGTCAGAAATAGACAAACCA
ATCTCTTAACACGCTTGACAGATATTCGCTATGATAATGCTTTTGGCGTTGAACGAGCTGCCCAATCCGTTACAGGTAATATTCTCGTTTGCTCAGGCCCGCTTAGCGTTTACAGACGCGAGGTGGTTGTTCCTAACATAGATAGATACATCAACCAGACCTTCCTGGGTATTCCTGTAAGTATCGGTGATGACAGGTGCTTGACCAACTATGCAACTGATTTAGGAAAGACTGTTTATCAATCCACTGCTAAATGTATTACAGATGTTCCTGACAAGATGTCTACTTACTTGAAGCAGCAAAACCGCTGGAACAAGTCCTTCTTTAGAGAGTCCATTATTTCTGTTAAGAAAATCATGAACAATCCTTTTGTAGCCCTATGGACCATACTTGAGGTGTCTATGTTTATGATGCTTGTTTATTCTGTGGTGGATTTCTTTGTAGGCAATGTCAGAGAATTTGATTGGCTCAGGGTTTTGGCCTTTCTGGTGATTATCTTCATTGTTGCTCTTTGTCGTAATATTCACTATATGCTTAAGCACCCGCTGTCCTTCTTGTTATCTCCGTTTTATGGGGTACTGCATTTGTTTGTCCTACAGCCCTTGAAATTGTATTCTCTTTTTACTATTAGAAATGCTGACTGGGGAACACGTAAAAAATTATTATAA表2重組人透明質酸酶堿基序列TTGAACTTCAGAGCTCCACCTGTTATTCCAAACGTCCCATTCTTGTGGGCCTGGAATGC
ACCTTCTGAGTTCTGTTTGGGAAAGTTCGATGAGCCACTTGACATGTCATTGTTTAGTTTCATTGGATCTCCTAGAATCAATGCTACTGGTCAAGGAGTTACCATTTTCTACGTCGATAGATTGGGTTACTATCCTTACATTGACTCAATCACTGGAGTTACAGTCAACGGTGGAATTCCACAGAAGATCAGTCTTCAAGATCATTTGGACAAGGCTAAGAAAGACATCACTTTCTACATGCCAGTTGATAACTTGGGTATGGCAGTCATCGACTGGGAAGAGTGGAGACCAACATGGGCTAGAAACTGGAAGCCTAAGGATGTTTACAAGAACAGATCTATCGAATTGGTTCAACAGCAAAACGTCCAGCTGTCCTTGACCGAAGCAACTGAGAAGGCTAAACAAGAATTTGAGAAGGCTGGAAAGGATTTCCTTGTTGAGACTATCAAGTTGGGTAAACTGCTTAGACCAAACCACTTATGGGGATACTATTTGTTCCCTGACTGTTACAATCATCACTATAAGAAACCAGGTTACAACGGATCCTGCTTCAATGTTGAAATCAAGAGAAACGATGACCTGTCCTGGTTGTGGAATGAGTCAACTGCTCTTTACCCTAGTATCTATTTGAACACTCAGCAATCACCAGTTGCTGCCACATTGTATGTTAGAAATAGAGTCAGAGAAGCCATTAGAGTTTCTAAGATCCCTGATGCTAAATCCCCATTGCCTGTCTTTGCCTACACCAGAATTGTTTTCACTGATCAGGTCCTTAAGTTTTTGTCTCAAGACGAATTGGTTTATACATTTGGAGAGACCGTCGCTCTGGGTGCCTCAGGAATTGTTATCTGGGGAACTTTGAGTATCATGAGATCTATGAAGTCCTGTTTGCTTCTGGATAACTACATGGAAACCATCCTTAACCCATACATCATCAATGTTACTTTGGCAGCTAAGATGTGTTCTCAAGTTCTGTGCCAGGAGCAAGGTGTCTGCATTAGAAAGAACTGGAATTCTTCCGACTACCTTCATTTGAACCCTGATAACTTCGCTATCCAGTTGGAAAAGGGTGGAAAGTTCACAGTTAGAGGAAAGCCAACCCTTGAAGATTTGGAGCAATTTTCCGAAAAGTTCTACTGTTCATGCTACAGTACATTGTCTTGTAAGGAGAAAGCCGACGTTAAGGATACCGACGCCGTTGATGTCTGTATTGCAGACGGTGTTTGCATCGATGCATTCTTGAAACCACCTATGGAAACTGAAGAGCCACAAATCTTCTACAAT
權利要求
1.一種通過基因調控直接生產(chǎn)特定分子量HA的畢赤酵母基因工程菌HAS-PH20。
2.權利要求I所述的畢赤酵母，其特征在于該酵母細胞為畢赤酵母GS115、KM71或SMDl168。
3.權利要求I所述的酵母基因工程菌HAS-PH20，其特征在于先將表達獸疫鏈球菌透明質酸合成酶的組成型重組質粒pGAPZ a A-szHasA轉化畢赤酵母，得到重組酵母菌HAS ;再將表達重組人透明質酸酶的誘導型重組質粒pPICZ a A-ph20轉化重組酵母菌HAS，得到目標菌株HAS-PH20。
4.權利要求3所述的表達獸疫鏈球菌透明質酸合成酶的組成型重組質粒pGAPZ a A-szHasA,其特征在于該重組質粒是在GAP組成型啟動子的調控下進行表達的，所述的獸疫鏈球菌透明質酸合成酶基因szHasA具有獸疫鏈球菌透明質酸合成酶堿基序列表中的喊基序列。
5.權利要求3所述的表達重組人透明質酸酶的誘導型重組質粒pPICZa A-ph20,其特征在于該重組質粒是在AOXl誘導型啟動子的調控下進行表達的；重組人透明質酸酶基因ph20是按照畢赤酵母偏好性設計的DNA分子，該分子的核苷酸序列所編碼的氨基酸，與人透明質酸酶基因(gene ID6677)所編碼的氨基酸完全相同。
6.權利要求5所述的根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子設計的ph20基因序列，其特征在于ph20基因序列是在人透明質酸酶基因(gene ID6677)基礎上，利用P. pastoris偏愛密碼子替換稀有密碼子，對亮氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，丙氨酸等氨基酸的大多數(shù)密碼子替換成以UUA，CCA, GAA, GAU’ CAA, UCA, GCA,并敲除掉了 Sac I酶切位點，所述的Ph20基因序列具有重組人透明質酸酶堿基序列表中的堿基序列。
7.權利要求I所述的畢赤酵母基因工程菌HAS-PH20發(fā)酵生產(chǎn)不同分子量HA的方法，其特征在于 首先在30°C條件下，將重組酵母HAS-PH20用YPD培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24小時；將過夜培養(yǎng)的酵母，按O. 5% 2%的比例接種于YI3D種子培養(yǎng)基中，上罐發(fā)酵方法如下 (1)菌體培養(yǎng)階段發(fā)酵溫度保持在28 30°C，利用28%的氨水調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值至5. O 6. 0，然后將種子培養(yǎng)基按5 % 10 %的接種量接種入Basal Salts上罐培養(yǎng)基中，同時添加4. 37mL PTMl鹽溶液。通氣攪拌18 24小時； (2)甘油補料階段組成型表達獸疫鏈球菌透明質酸合成酶并產(chǎn)生透明質酸階段流加30% 50%的甘油，流加量為10 20mL/hr/L，培養(yǎng)24 48小時左右，此時保證溶氧量大于20%。該過程既是酵母生長階段即菌體濕重大量增加階段，也是獸疫鏈球菌透明質酸合成酶組成型表達階段，在此過程中透明質酸被快速積累； (3)甲醇誘導階段利用甲醇作為誘導劑誘導重組人透明質酸酶表達并將HA分解為不同分子量HA寡糖階段甘油流加一段時間后停止流加甘油，將碳源換為甲醇，流加速度為4 8mL/hr/L，再繼續(xù)培養(yǎng)24 48小時，此過程保證溶氧量大于20%。該過程流加甲醇可誘導AOXl啟動子作用并開始表達重組人透明質酸酶，在此過程中通過調節(jié)甲醇的流加速率、流加時間和甘油甲醇的體積比來獲得不同分子量的HA寡糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用畢赤酵母基因調控生產(chǎn)不同分子量透明質酸(hyaluronic acid，簡稱HA)的新方法。該方法包括分別將組成型表達獸疫鏈球菌透明質酸合成酶的重組質粒pGAPZαA-szHasA和誘導型表達重組人透明質酸酶的重組質粒pPICZαA-ph20轉化酵母細胞，得到目標菌株HAS-PH20。利用該酵母工程菌HAS-PH20通過不同的基因調控和誘導方式，在發(fā)酵過程中直接生成多種不同分子量的透明質酸。該方法實現(xiàn)了透明質酸分子量與基因調控方式的偶聯(lián)，可以根據(jù)需要制備特定分子量的透明質酸。
文檔編號C12N1/19GK102911887SQ201110219289
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月2日 優(yōu)先權日2011年8月2日
發(fā)明者朱希強, 劉飛, 張莉, 劉霞, 釗倩倩, 王紹花, 陳勉, 侯重文, 袁丹丹, 張林軍, 陳曉燕 申請人:山東省生物藥物研究院