專利名稱：畢赤酵母壁蛋白Gcw30及其表面展示系統(tǒng)和構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw30及其構(gòu)建的表面展示系統(tǒng)和構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)是一種通過(guò)錨定蛋白將蛋白質(zhì)或多肽固定在細(xì)胞表面的技術(shù)。微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)包括宿主菌、錨定蛋白和靶蛋白，有時(shí)在錨定蛋白和靶蛋白之間也添加一段連接(linker)序列。微生物細(xì)胞表面展示在多肽分離、全細(xì)胞催化劑、 全細(xì)胞吸附劑、疫苗和抗體生產(chǎn)、蛋白文庫(kù)篩選、生物傳感器、生物修復(fù)等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。目前在微生物表面展示系統(tǒng)中應(yīng)用比較多的宿主菌主要有噬菌體、細(xì)菌(如大腸桿菌Esctwrichis. coli、奇異變形菌Proteus mirabilis 等)、釀酒酵母 QSaccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母QPichia pastor is)。表面展示使用的錨定蛋白一般具有以下特征(1)較牢固地錨定在細(xì)胞表面，不會(huì)輕易地從細(xì)胞表面脫落；(2)可以與靶蛋白序列有效融合而不影響靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；(3)對(duì)蛋白酶有一定的抗性。細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白主要有細(xì)菌菌毛蛋白、S層蛋白、冰核蛋白(INP)和一些外膜蛋白。釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白主要有凝集素系統(tǒng)、絮凝素系統(tǒng)和其它GPI錨定 (glycosylphosphatidylinositol anchored)蛋白系統(tǒng)和一些Pir蛋白系統(tǒng)。巴斯德畢赤酵母具有可以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵(細(xì)胞密度可高達(dá)140g/L)、蛋白適度糖基化和發(fā)酵培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在微生物細(xì)胞表面展示方面的應(yīng)用具有非常廣闊的前景，目前已有許多種蛋白，如解脂耶氏酵母脂肪酶、乳酸克魯維酵母黃酶、米根霉脂肪酶等已經(jīng)成功地展示在巴斯德畢赤酵母表面。目前巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)中使用的錨定蛋白主要來(lái)自釀酒酵母的凝集素系統(tǒng)、絮凝素系統(tǒng)和kdlp蛋白等。但是，這些錨定蛋白不是畢赤酵母的組成成分，而是通過(guò)人為手段外源引進(jìn)的。因此用外源壁蛋白作為畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白，可能會(huì)與內(nèi)源壁蛋白競(jìng)爭(zhēng)壁蛋白結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致展示效率不高。Khasa YP (Khasa YP, et al. Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 2010. (published online).)等報(bào)道了利用畢赤酵母Pir蛋白作為錨定蛋白進(jìn)行外源蛋白的細(xì)胞表面展示。但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Pir蛋白本身的表達(dá)量較低，作為畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白效果一般。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提高用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的內(nèi)源錨定蛋白的表達(dá)效率。本發(fā)明解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案是
一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw30，該蛋白的氨基酸序列為SEQ NO :1。
3
本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白由206個(gè)氨基酸組成，大小約為21. QKDa0 本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞壁上，用十二烷基硫酸鈉法不能提取，可以用β -1，3-葡聚糖酶法提取。本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw30可用于構(gòu)建畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，所述的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)是以所述壁蛋白為錨定蛋白將靶蛋白固定在畢赤酵母細(xì)胞表面構(gòu)成的。編碼所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30的基因，核苷酸序列如SEQ NO 4所示。一種巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，是以所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白 Gcw30為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面構(gòu)成的。上述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)可通過(guò)以下步驟構(gòu)建
(1)將權(quán)利要求2所述的基因克隆到表達(dá)載體的表達(dá)盒中，得到以權(quán)利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白為錨定蛋白的表面展示表達(dá)載體；
(2)將靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表達(dá)載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列的上游，與所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；
(3)轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，根據(jù)所述表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即得到表面展示系統(tǒng)。所述靶蛋白為堿性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南極假絲酵母脂肪酶B。所述巴斯德畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GSl 15。上述方法中，所述的表達(dá)載體是常用的帶有分泌信號(hào)肽序列的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體，如 PPIC9K、pPICZ α A、pPICZ α B、pPICZ α C、pGAPZ α A、pGAPZ α B、pGAPZ α C 等；如果是無(wú)信號(hào)肽的表達(dá)載體，可在靶蛋白基因序列的上游添加分泌信號(hào)肽序列。表達(dá)載體為pPIC9K時(shí)，構(gòu)建表面展示表達(dá)載體后，將靶蛋白的基因序列克隆連接到所述表面展示表達(dá)載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列上游的限制性內(nèi)切酶酶切位存、EcoR 1與Mlu I之間。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果。本發(fā)明所述的壁蛋白Gcw30是巴斯德畢赤酵母內(nèi)源壁蛋白，且在畢赤酵母中表達(dá)量十分高，與現(xiàn)已用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的內(nèi)源錨定蛋白Pirl蛋白和Pir2蛋白相比，分別高6倍和13倍。因此，本發(fā)明所述巴斯德畢赤酵母可用于構(gòu)建高表達(dá)效率的巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)。


圖1.用SDS法和β-1，3-葡聚糖酶法提取巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw30的 Wfestern blot結(jié)果。a. SDS法提取壁蛋白Gcw30 ;b. β _1，3-葡聚糖酶法提取壁蛋白 Gcw30o圖2 重組菌GS115/GCW30和對(duì)照菌GS115的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。虛線對(duì)照菌 GS115 ；實(shí)線重組菌 GS115/GCW30。圖3 三丁酸甘油酯乳化平板水解圈法檢測(cè)GS115/GCW30-CALB陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。a.對(duì)照菌 GS115 ；b.陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子 GS115/GCW30-CALB。圖4 熒光顯微鏡驗(yàn)證融合蛋白GCW30-CALB在畢赤酵母細(xì)胞壁表面展示結(jié)果。a.GS115/GCW30-CALB的普通光學(xué)顯微b.GS115/GCW30-CALB 的熒光顯微c.對(duì)照菌GS115的普通光學(xué)顯微d.對(duì)照菌GS115的熒光顯微圖。圖5 菌體酶活曲線圖。其中， 表示重組菌GS115/GCW30-CALB的菌體酶活曲線； ·表示對(duì)照菌GSl 15的菌體酶活曲線。圖6 采用Gcw30、Pirl和Pir2作為錨定蛋白展示CALB的酶活比較。術(shù)語(yǔ)解釋
MD平板13. 4g/L酵母氮源，4X 10_4 g/L生物素，20g/L葡萄糖和20g/L瓊脂 BMGY培養(yǎng)基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸鉀緩沖液(pH6. 0)，13. 4g/ L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，10g/L甘油。BMMY培養(yǎng)基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸鉀緩沖液(pH6. 0)， 13.4g/L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，5g/L甲醇。三丁酸甘油酯乳化平板13. 4g/L酵母氮源，10g/L三丁酸甘油酯，5g/L聚乙烯醇，20g/L瓊脂，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH6. 0)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因的克隆、表達(dá)和鑒定 (1)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因的克隆
根據(jù)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30的基因序列SEQ NO. 4以及巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒 PPIC9K上的多克隆位點(diǎn)特征，設(shè)計(jì)合成引物
其中引物Pl方框部分為^boTP I酶切位點(diǎn)，下劃線部分為I酶切位點(diǎn)，斜體部分為 FLAG標(biāo)簽序列；引物Ρ2下劃線部分為Λ^ I酶切位點(diǎn)。以巴斯德畢赤酵母GS115基因組 DNA為模板，以Pl和P2為引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出壁蛋白GCW30基因序列，擴(kuò)增條件為 預(yù)變性94°C 5分鐘；再進(jìn)行30個(gè)以下循環(huán)94°C變性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分鐘；最后72°C延伸7分鐘。
(2)載體 p9KGCW30-FLAG 的構(gòu)建
將壁蛋白GCW30基因的PCR產(chǎn)物用I和Λ^ I雙酶切，酶切的產(chǎn)物與巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K的^bo/ I和Λ^ I雙酶切產(chǎn)物連接，得到重組巴斯德畢赤酵母表面展示表達(dá)質(zhì)粒P9KGCW30。將得到的P9KGCW30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主ToplOF。用含50mg/ L氨芐青霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑取氨芐青霉素抗性陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，通過(guò) EcoR I和Λ^ I雙酶切鑒定并測(cè)序，結(jié)果表明壁蛋白GCW30基因序列正確插入，且FLAG標(biāo)簽在所述壁蛋白GCW30基因的上游。
(3)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30的表達(dá)和鑒定采用限制性內(nèi)切酶I對(duì)P9KGCW30質(zhì)粒進(jìn)行線性化后，用LiCl法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115，在MD平板上挑取His+轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA作為模板，以PI、P2為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，結(jié)果證明巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30的基因序列整合到了 GS115的基因組中， 得到的重組菌命名為GS115/ GCW30。將GS115/ GCW30接種于50mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)16_20h至OD6tltl到2_6。離心收集菌體，再將其懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至0D_為1，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔Mh向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵后，10000 rpm離心收集菌體，采用β _1，3-葡聚糖酶法提取細(xì)胞壁蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，并用anti-FLAG抗體進(jìn)RWfestern blot驗(yàn)證(圖1 )，結(jié)果表明巴斯德畢赤酵母壁蛋白 GCW30成功地在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面得到表達(dá)。用anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)重組菌GS115/ GCW30和GS115進(jìn)行分析比較(圖2)，結(jié)果顯示與GS115相比，重組菌GS115/ GCW30的熒光發(fā)生較大偏移，表明在重組菌GS115/ GCW30的細(xì)胞表面成功地表達(dá)了巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30-FLAG的融合蛋白。
實(shí)施例2 巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30表面展示載體p9KGCW30的構(gòu)建 (1)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因的克隆
根據(jù)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因序列以及巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9K上的多克隆位點(diǎn)特征，設(shè)計(jì)合成引物
引物P2下劃線部分為I酶切位點(diǎn)；引物P3方框部分為^boTP I酶切位點(diǎn)，下劃線部分為i/Ζ I酶切位點(diǎn)。以巴斯德畢赤酵母GS115基因組DNA為模板，以P2和引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出壁蛋白GCW30基因序列，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C 5分鐘；再進(jìn)行30個(gè)以下循環(huán)94°C變性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸1分鐘；最后72°C延伸7分鐘。 得到巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因片段。
(2)表面展示表達(dá)載體p9KGCW30的構(gòu)建
將壁蛋白GCW30基因的PCR產(chǎn)物用I和Λ^ I雙酶切，酶切的產(chǎn)物與巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K的^bo/ I和Λ^ I雙酶切產(chǎn)物連接，得到重組巴斯德畢赤酵母表面展示表達(dá)質(zhì)粒P9KGCW30。將得到的p9KGCW30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主ToplOF。用50mg/L氨芐青霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑取氨芐青霉素抗性陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，通 I和Λ^ I雙酶切鑒定并測(cè)序，結(jié)果表明壁蛋白GCW30基因序列正確插入。
實(shí)施例3 巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30表面展示載體ρΖ α AGCW30的構(gòu)建 (1)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因的克隆
根據(jù)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因序列以及巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9K上的多克隆位點(diǎn)特征，設(shè)計(jì)合成引物
Ρ2 :5，- TAATATGCGGCCGCCTATAGACCGCTCAAGAC -3，(SEQ NO 3) Ρ4 5' - ATATCTCGAGCTTGATTTGGGAAGCTTG -3' (SEQ NO 6)
引物Ρ2下劃線部分為I酶切位點(diǎn)；引物Ρ4下劃線部分為I酶切位點(diǎn)。以畢赤酵母GS115基因組DNA為模板，以Ρ2和Ρ4為引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出壁蛋白GCW30基因序列，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C 5分鐘；再進(jìn)行30個(gè)以下循環(huán)94°C變性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸1分鐘；最后72°C延伸7分鐘。得到巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因片段。(2)表面展示表達(dá)載體ρΖ α AGCW30的構(gòu)建
將壁蛋白GCW30基因的PCR產(chǎn)物用Xho I和Λ^ I雙酶切，酶切的產(chǎn)物與巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒PPICZaA的ZAo I和Λ^ I雙酶切產(chǎn)物連接，得到重組畢赤酵母表面展示表達(dá)質(zhì)粒pZ a AGCW30。將得到的pZ a AGCW30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主！"oplOF。用含IOOmg/ L kocin的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑取&0(^11抗性陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，通過(guò)ZA0 I和 Not I雙酶切鑒定并測(cè)序，結(jié)果表明壁蛋白GCW30基因序列正確插入。實(shí)施例4 巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30表面展示載體pG a AGCW30的構(gòu)建 (1)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因的克隆
根據(jù)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因序列以及畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9K上的多克隆位點(diǎn)特征，設(shè)計(jì)合成引物
P2 :5，- TAATATGCGGCCGCCTATAGACCGCTCAAGAC -3，(SEQ NO 3) P4 5' - ATATCTCGAGCTTGATTTGGGAAGCTTG -3' (SEQ NO 6)
引物P2下劃線部分為I酶切位點(diǎn)；引物P4下劃線部分為I酶切位點(diǎn)。以畢赤酵母GSl 15基因組DNA為模板，以P2和P4為引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出壁蛋白GCW30基因序列，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C 5分鐘；再進(jìn)行30個(gè)以下循環(huán)94°C變性30秒、55°C退火 30秒、72°C延伸1分鐘；最后72°C延伸7分鐘。得到巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30基因片段。(2)表面展示表達(dá)載體pG a AGCW30的構(gòu)建
將壁蛋白GCW30基因的PCR產(chǎn)物用Xho I和Λ^ I雙酶切，酶切的產(chǎn)物與巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒PGAPZaA的ZAo I和I雙酶切產(chǎn)物連接，得到重組畢赤酵母表面展示表達(dá)質(zhì)粒pG a AGCW30。將得到的pG a AGCW30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主！"oplOF。用含IOOmg/ L kocin的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑取&0(^11抗性陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，通過(guò)ZA0 I和 Not I雙酶切鑒定并測(cè)序，結(jié)果表明壁蛋白GCW30基因序列正確插入。實(shí)施例5 利用p9KGCW30表面展示系統(tǒng)展示南極假絲酵母脂肪酶B (1)南極假絲酵母脂肪酶B基因的克隆
根據(jù)含有南極假絲酵母脂肪酶B (CALB，基因序列如SEQ NO :7所示)基因序列的質(zhì)粒pKNS-CALB的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的特征，采用EcoR I和i/Ζ I進(jìn)行雙酶切，得到 FLAG-CALB融合蛋白的DNA序列。(2)利用p9KGCW30表面展示表達(dá)載體在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示南極假絲酵母脂肪酶B
將FLAG-CALB融合蛋白的DNA序列的EcoR I和Mlu I雙酶切產(chǎn)物與p9KGCW30載體的I和i/Ζ I雙酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒P9KGCW30-CALB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主 ToplOF。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，通過(guò)I和i/Ζ I雙酶切鑒定并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明壁蛋白CALB基因序列正確插入。將重組質(zhì)粒p9KGCW30-CALB轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，通過(guò)MD平板篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在MD平板上生長(zhǎng)4 后，隨機(jī)挑取His+轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至三丁酸甘油酯乳化平板進(jìn)行鑒定。 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子GS115/GCW30-CALB菌落在平板上形成明顯的水解圈(圖3)，表明CALB在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)，并且表現(xiàn)出脂肪酶水解活性。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子GS115/GCW30-CALB接種于50mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)16-20h至OD6tltl到2-6。離心收集菌體，再將其懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至0D_為 1，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔Mh向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵后， IOOOOrpm離心收集菌體，采用β _1，3-葡聚糖酶法方法提取細(xì)胞壁蛋白，進(jìn)行SDS電泳，并用anti-FLAG抗體進(jìn)行flfestern blot驗(yàn)證，結(jié)果表明CALB成功地在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面得到展示。用anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)后，采用熒光顯微鏡對(duì)GS115/GCW30-CALB 和對(duì)照菌株GS115進(jìn)行分析比較(圖4)，結(jié)果顯示，GS115/GCW30-CALB的細(xì)胞表面可發(fā)出明顯的熒光，而對(duì)照菌GS115的細(xì)胞表面則幾乎沒(méi)有熒光。表明在GS115/GCW30-CALB的細(xì)胞表面成功地展示了 FLAG-CALB的融合蛋白。(3)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子GS115/GCW30-CALB的發(fā)酵與脂肪酶活性的測(cè)定
將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子GS115/GCW30-CALB接種于50mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng) 16-20h至OD6tltl到2-6。離心收集菌體，再將其懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至0D_為1，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔Mh向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每24h取樣，利用分光光度法測(cè)定脂肪酶的酶活力在ImL 50mM Tris-HClCpH 8. 0)、1. 25mM / NPB的反應(yīng)體系中加入10 μ L菌體懸液，45°C反應(yīng)5min，測(cè)定OD4tl5值。1個(gè)酶活力單位定義為每分鐘水解底物生成1 μ mol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。脂肪酶活性測(cè)定的結(jié)果(圖5)顯示，GSll5/GCW30-CALB的菌體酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸升高，到120h可達(dá)1259U/g，而對(duì)照菌GS115的菌體則幾乎沒(méi)有酶活。表明CALB 被以活性形式成功地展示在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面。 實(shí)施例6 利用p9KGCW30表面展示表達(dá)載體展示米黑根毛霉脂肪酶
(1)根據(jù)含有米黑根毛霉脂肪酶(RML)基因序列的質(zhì)粒pKFS-RML的序列特征，設(shè)計(jì)并合成引物
P5 :GCGGGAATTCG^TTACAAGGATGATGACGAr^^GTTCCAATTAAGAGAC AATCTAACT (SEQ NO 8)
P6 :GCGCACGCGTAGTACACAAACCAGTGTTAATACCA (SEQ NO :9)
其中P5下劃線部分為feo/P I識(shí)別位點(diǎn)，斜體部分為FLAG標(biāo)簽序列；P6中下劃線部分為Mlu I位點(diǎn)。通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出RML基因序列，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C 5分鐘；再進(jìn)行30個(gè)以下循環(huán)94°C變性30秒、55 °C退火1分鐘、72 °C延伸1分鐘45秒；最后72°C延伸 10分鐘。得到FLAG-RML基因片段。測(cè)序結(jié)構(gòu)顯示RML基因(SEQ NO 10)被正確擴(kuò)增
(2)利用p9KGCW30表面展示表達(dá)載體在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示RML
將FLAG-RML融合蛋白的DNA序列的EcoR I和Mlu I雙酶切產(chǎn)物與p9KGCW30載體的 EcoR I和ΙΛ/ I雙酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒P9KGCW30-RML，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主ToplOF。 挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，通過(guò)I和I雙酶切鑒定。將重組質(zhì)粒P9KGCW30-RML 轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，通過(guò)MD平板篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在MD平板上生長(zhǎng)4 后，隨機(jī)挑取部分轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至三丁酸甘油酯乳化平板進(jìn)行鑒定。在三丁酸甘油酯乳化平板上形成明顯水解圈的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子GSl 15/GCW30-RML。
實(shí)施例7 利用p9KGCW30表面展示表達(dá)載體展示堿性木聚糖酶
(1)根據(jù)含有堿性木聚糖酶基因(XYN)序列的質(zhì)粒PPIC9K-XYN的序列特征，設(shè)計(jì)并合成引物
P7 CGTGAATTCATGATTACTTTGTTTAAGAAGCC (SEQ NO 11) P8 :GATACGCGTTTAATCAATAATTCTCCAG (SEQ NO :12)
其中P7下劃線部分為feo/P I識(shí)別位點(diǎn)；P8中下劃線部分為ΙΛ/Ι位點(diǎn)。通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出XYN基因序列，擴(kuò)增條件為預(yù)變性94°C 5分鐘；再進(jìn)行35個(gè)以下循環(huán)94°C變性 30秒、55°C退火1分鐘、72°C延伸2分鐘；最后72°C延伸10分鐘。得到XYN基因片段。測(cè)序結(jié)構(gòu)顯示XYN基因(SEQ NO 13)被正確擴(kuò)增
(2)利用p9KGCW30表面展示表達(dá)載體在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示XYN 將XYN序列的I和雙酶切產(chǎn)物與p9KGCW30載體的I禾PiZ/ Ι雙酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒P9KGCW30-XYN，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主ToplOF。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，通過(guò)I和ΙΛ/Ι雙酶切鑒定。將重組質(zhì)粒p9KGCW30-XYN轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115， 通過(guò)MD平板篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在MD平板上生長(zhǎng)4 后，隨機(jī)挑取部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落 PCR和測(cè)序鑒定p9KGCW30-XYN陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例8
本發(fā)明所述壁蛋白所構(gòu)建的巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)與用Pir蛋白所構(gòu)建的巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的效果比較。1、實(shí)驗(yàn)材料
(1)本發(fā)明所述壁蛋白所構(gòu)建的巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng) GS115/GCW30-CALB,制備方法參見(jiàn)實(shí)施例5。(2)用Pir蛋白所構(gòu)建的巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng) GS115/GCW30-CALB 中的錨定蛋白用 Pirl 或 Pir2 替換，得到 GSl 15/ Pirl-CALB 和
GSl 15/ Pir2-CALB，方法如下
pZa A/Pirl 和 pZa A/Pir2 表達(dá)載體的構(gòu)建詳見(jiàn)Khasa YP 的報(bào)道(Khasa YP, et al. Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 2010. (published online).
pZ α A/Pirl-CALB 和 pZ α A/Pir2_CALB 的構(gòu)建將 CALB 基因(SEQ NO :7)分別插入到 ρΖαΑ/Pirl 禾口 pZaA/Pir2 中(sfi/ 1 禾口1 雙醇切)。GS115/ Pirl-CALB 禾口 GS115/ Pir2_CALB pZaA/PirI-CALB 禾口 pZaA/ Pir2-CALB分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，用含100mg/L Zeocin的YPD平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。2、實(shí)驗(yàn)方法
GS115/GCW30-CALB、GS115/ Pirl-CALB 和 GSl 15/ Pir2_CALB 在分別 BMMY 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)后，測(cè)定菌體的CALB酶活，方法參見(jiàn)實(shí)施例5。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果如圖6所示，GS115/ Pirl-CALB和GSl 15/ Pir2_CALB的菌體酶活僅為GS115/ GCW30-CALB 的 16. 68%和 7. 55%。
權(quán)利要求
1.一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列如SEQ NO 1 所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW30的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ NO :4所示。
3.—種巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，其特征在于，是以權(quán)利要求1所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw30為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面構(gòu)成的。
4.權(quán)利要求3所述的巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建方法，該方法由以下步驟組成(1)將權(quán)利要求2所述的基因克隆到表達(dá)載體的表達(dá)盒中，得到以權(quán)利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白為錨定蛋白的表面展示表達(dá)載體；(2)將靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表達(dá)載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列的上游，與所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；(3)轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，根據(jù)所述表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即得到表面展示系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達(dá)載體包括帶有分泌信號(hào)肽序列的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為pPIC9K、pPICZα A、 pPICZ α B、pPICZ α C、pGAPZ α A、pGAPZ α B 或 pGAPZ α C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4 6之一所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述靶蛋白為堿性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南極假絲酵母脂肪酶B。
8.根據(jù)權(quán)利要求4 6之一所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述巴斯德畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GSl 15。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種畢赤酵母壁蛋白及其構(gòu)建的表面展示系統(tǒng)和構(gòu)建方法。所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白的氨基酸序列為SEQNO1；所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)是以所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw30為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面構(gòu)成的。本發(fā)明的壁蛋白Gcw30在畢赤酵母中表達(dá)量十分高，與現(xiàn)已用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的內(nèi)源錨定蛋白Pir1蛋白和Pir2蛋白相比，分別高6倍和13倍。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102276702SQ20111021580
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者葉燕銳, 周新瑩, 張莉, 林影, 鄭穗平, 韓雙艷 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)